浓缩试样组分和扩增核酸的方法

专利名称：浓缩试样组分和扩增核酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于浓缩试样组分和扩增含于试样组分中的核酸的方法。
背景技术：
在传染病诊断中，由于对于大肠杆菌以及引起结核病、败血症或肺炎的细菌的抗生素抗性如MRSA和氟喹诺酮抗性不断扩展，所以对该抗生素抗性的证实具有越来越大的
重要性。在常规诊断中，这些抗性大多基于培养得知。但该基于细胞培养的抗性测定是一种耗时的方法，因为培养和评定需2-3天时间。借助于细菌-DNA分析可明显快地测定抗性。 为此需扩增细菌的DNA。这类扩增例如可通过DNA聚合酶和RNA聚合酶的协同作用(基于核酸序列的扩增；NASBA)、通过聚合和索排代(Strang-Verdi^ngung)(滚环扩增；RCA)或借助于连接酶(连接酶链反应；LCR)实现。但聚合酶链反应(PCR)由于其特异性和敏感性而成为最常使用的扩增方法。为此，一般在PCR前处理和净化含核酸的物质。核酸的处理流程有多个工作步骤，其中例如通过离心浓集细胞或病毒，且通过细胞溶解和各种洗涤步骤分离核酸。欧洲专利EP 0389063 B2描述了一种常用的多步骤的净化方法，其中在离液盐存在下DNA结合到含二氧化硅的固相上。在此方法中首先用离液缓冲液溶解细胞。使该溶胞产物与含二氧化硅的结合有DNA的固相接触。接着从溶胞产物的残余物中分离出含有结合的DNA的固相，并洗涤该DNA络合物。最后依最终应用从固相中洗脱该DNA或直接以结合的状态扩增该DNA。与此相反，所谓的微全分析装置(μ全分析装置，μ TAS)的优点在于，将各工作步骤合并并进行自动化，并同时减少到微量规模。这类系统的潜力主要在于低功率消耗、快的反应时间和减少了试样体积和试剂体积，以致可实现芯片大小的分析实验室(“芯片实验室”)。从WO 200465010已知一种这类可从水溶液中分离和扩增DNA的微流体系统。在应用该系统时，首先通过膜过滤试样，这时细胞保留在膜上，并且在下一步骤中与膜一起从过滤器室中取出。将该膜送入实际的微流体系统中后，洗涤、溶解细胞，并接着扩增DNA，这时从仪器中取出用于扩增的膜，并随后再次送入。最后在该膜穿过通道时检测扩增的DNA。但是，不仅由于在试样处理和PCR反应之间的许多工作步骤使得用于诊断的耐用的μ-TAS的制备变得困难，而且还由于例如为分析含细胞或含病毒的流体而必须提供明显多于用于分析的仅几滴的量，因为在这种介质中常仅存在非常少量的细胞数或病毒数。 例如对于败血症的情形，每毫升血液中仅有5个病菌。所以通常需处理较大的试样体积(几毫升)，由此才能有机会在分析物中发现足够的细胞或病毒。将由此产生的对宏观量的试样体积的必需转变为微流体系统中所需的微升量就成了问题。

发明内容
本发明的目的在于提供一种用于从生物试样中浓缩试样组分和扩增含于试样组分中的核酸的方法，该方法以少数几步单一步骤进行，并可实现自动化。此外，本发明的目的还在于提供一种实施相应方法的设备，该设备胜任微型规模的自动化要求。因此本发明的目的是一种用于从生物试样中浓缩试样组分和扩增含于试样组分中的核酸的方法，该方法包括下列步骤
1)备制液态的生物试样，
2)将该试样送入具有至少一个过滤器的分离系统中，
3)通过在过滤器上分离试样组分而浓集含于试样中的试样组分，
4)加入扩增试剂，和
5)直接扩增至少一种含于试样组分中的核酸。术语“试样组分”在下面应意指细胞以及病毒。术语“细胞”在下面应意指原核细胞以及真核细胞。术语“病毒”在下面应意指具有其增殖和扩展信息但无自身代谢的和因此指定寄主细胞的代谢的非细胞颗粒。在寄主细胞的外面病毒主要作为病毒粒存在。术语“含于试样组分中的核酸”在下面一方面应意指自身(内生)核酸，包括线粒体的核酸或病毒粒的核酸，另一方面也应意指例如侵害细胞的病毒的外来(外生)核酸。核酸可以是DNA (脱氧核糖核酸)、RNA (核糖核酸)或cDNA。直接或间接来自活的或死的生物体并已呈液态存在或已溶解以致可施加到过滤系统中的所有物质均看作是“生物试样”。术语“分离系统”在下面应意指一种可实施本发明方法并包含至少一个过滤器的设备。因此“分离系统”也可包括由多个过滤器组成的系统。此外，分离系统还包括试样和试剂的相应送入和排出连接端。本文中的“过滤器”意指一种部件，借助于该部件可将生物试样中的含待扩增的核酸的试样组分与其它组分分离。因此通过在过滤器上的分离浓缩或浓集了这些试样组分。 该试样组分不仅可在过滤器上也可在过滤材料内进行分离。术语“扩增”意指核酸的有目的增殖。例如可借助于NASBA、RCA、LCR和/或PCR 进行扩增。“直接扩增”意指核酸在至少一个过滤器上或至少一个过滤器中的直接扩增，无需预先例如通过细胞溶解进行单独的核酸提取。“扩增试剂”意指用于实施扩增的所有必需的试剂如酶、缓冲剂、核苷酸、引物和其它助剂。术语“提取”在下面意指使待扩增的核酸适用于扩增的过程。令人意外的是，用本发明的方法可仅用少数几个方法步骤即可浓缩和扩增试样组分或含于其中的核酸。这种情况特别可归因于该扩增直接在过滤器上发生且无需单独的核酸提取步骤，因为直接扩增包括了试样组分的可能提取。由此可省去多个工作步骤。此外，可在一个微流体系统中实施通常呈空间分离的几个工作步骤即浓集、核酸提取、核酸净化和扩增，在该微流体系统中个别步骤甚至不再必要。由此明显减少了工作步骤的数目和所用的介质，这导致时间和成本的大大节省。
所述试样组分优选是细胞或大的病毒粒如天花病毒粒。在一个实施方案中，步骤5中的扩增通过PCR进行，并包括至少下列分步骤 5. 1)过滤器的改性、核酸提取和至少一种核酸的变性，
5.2)引物结合，和
5.3)引物延伸。PCR的优点在于，在约95°C下变性的第一PCR步骤可靠地提取核酸，即使其易于扩增。如果试样组分是细胞，则尤其如此。过滤器的改性使得在后续步骤中至少一种核酸和PCR试剂均不滞留在过滤器上或结合在过滤器上并由此对扩增产生不利影响和阻止扩增。因此该过滤器的改性导致更好的PCR结果。由此不再需要单独的提取步骤，该单独的提取步骤由于事后所需的提取试剂的去活化而随之产生耗费的净化过程和冲洗过程。在一个优选的实施方案中，在步骤5. 1)中的过滤器改性通过在步骤4)中加入阻断过滤器的聚合物进行，该聚合物选自可溶性的蛋白或白蛋白，优选BSA;或合成的聚合物，优选PEG成PPG。BSA的应用对PCR而言显示特别好的结果。在另一个实施方案中，在步骤幻中侧向流过过滤器，即试样的流向相对过滤器呈横向或水平。侧向流过的优点在于，该分离装置的结构比横向结构的过滤器系统更为简单。此夕卜，通过过滤器的流径明显更短。因此例如可通过使流过方向从横向改变成侧向而在相同分离度情况下用面积为3x16 mm或直径为8 mm的单层过滤器代替直径约为8 mm的双层过滤器^jiampeMini Spin column)。由此，与横向整合的过滤器相比，可大大减少过滤器体积， 而无需承受分离度的损失。在微流体应用中，这种体积减少具有显著优点，因为整个结构可微型化。此外，侧向流过的过滤器有助于简单的、可自动化的工艺进程，其明显有利于试样组分的高收率以及后续的核酸扩增。术语“分离率”描述了单位时间由过滤器滞留的试样组分数目，而“分离度”或“效率”给出在过滤器上总共滞留的试样组分的百分数。在含1000试样组分的起始溶液情况下，由过滤器滞留的700试样成分相应于该过滤器的分离度或效率为70 %。在另一个实施方案中，使用纤维过滤器作为侧向流过的过滤器。虽然纤维过滤器具有较大的孔，但可分离较大量的试样组分。在具有约ι μ m的孔的膜过滤器情况下，仅可分离少量(< 10 %)的直径约为1 μ m的试样组分，与此相反，在孔径< 0. 5 μ m情况下可实现显著的分离率。相反，在纤维直径为1-10 μ m和孔隙度为50-90 %的侧向流过的纤维过滤器情况下，可达明显高于90 %的非常高的分离度。或者，也可横向流过该纤维过滤器。在另一个实施方案中，该过滤器选自纤维过滤器，优选含二氧化硅的纤维过滤器， 特别优选玻璃纤维过滤器；膜过滤器和离子交换剂，优选阴离子交换剂。优选使用含二氧化硅的纤维过滤器，其玻璃纤维的直径为> 0.01 μπι至<40 μ m，优选彡0.1 μ m至彡30 μ m，特别优选彡0.1 μπι至彡5 μ m。该优选的直径特别是与待浓缩的试样组分的直径有关。此外，该过滤器还可包含散粒料，即呈固定相。或者，也可使用膜过滤器。在膜过滤器情况下，过滤主要经筛选效应实现。优选使用具有0.22 ym孔径的I^all的Supor 200型膜过滤器。该膜过滤器的孔径与待过滤的试样组分有关。在大肠杆菌情况下，孔径大小为< 1 μπι。此外，也可使用离子交换剂，尤其是阴离子交换剂。在离子交换剂情况下，在试样组分的带电表面和离子交换剂的交换基团之间形成强相互作用。在此，阴离子交换剂的实例是 Varian Inc.公司的 MratoSperes Ion Exchange SPE PL-MIXED MP 型。令人意外的是，试样组分在具有较大孔的纤维过滤器上可同样良好分离。如果该试样组分是细菌则尤其如此。此外，该纤维过滤器的优点在于，与膜过滤器不同，纤维过滤器在较高负荷下也具有小的流阻。相反，在膜过滤器情况下，特别是在高颗粒浓度情况下，常导致过滤器的快速堵塞，因为所有的分离试样组分均可堵塞孔。因此在相同压力下，在膜过滤器上的分离率比在纤维过滤器上要小。当然，如上所述，也可使用膜过滤器和/或离子交换剂来实施本发明方法，因为这些过滤器种类也有几乎100 %的高效率，并因此可确保从生物试样中有效地分离试样组分。在本发明方法的另一个实施方案中使用了多于一个的过滤器。优选使用两个不同的过滤器，以致可分离不同大小的各种试样组分。在另一个实施方案中，生物试样是含病菌的试样流体如尿、血、血浆、血清、涂液、 唾液、痰和/或支气管肺胞灌洗液(BAL)。在另一个实施方案中，在步骤幻和4)之间可进行试样组分的酶促分解、化学分解和/或机械分解，在分解中可使细胞膜或病毒粒壳和/或病毒壳体溶解或受损，并使核酸可用。因此，术语“分解”在下面意指使待扩增的核酸可进行扩增的过程。按此，术语提取和分解在内容上是一致的，但选用术语“分解”以强调其在此是一个单独的过程，该过程不同于提取，其不受扩增本身的限制。这种分解例如作为溶解进行，其中借助于酶促方法、热方法或化学方法而使核酸可用。例如用蛋白酶K处理或用溶菌酶处理适用于酶促溶解法。热溶解通过加热或冷冻试样组分进行。化学溶解方法的实例是用十二烷基硫酸钠(SDQ和NaOH的组合进行处理、用硫氰酸胍(DIT)处理和用Triton XlOO和高浓氯化锂的组合进行处理。机械分解例如使用玻璃珠或涡流器进行。此外，还有其它的已知分解方法。各方法的组合也是可能的。该附加的分解的优点在于，也可使试样组分中的核酸，特别是难分解的细胞，可供进行后续的扩增。该分解步骤优选是酶促分解或化学分解，因为这无需其它器具，并且该附加的方法步骤可易于自动化。在一个优选实施方案中，通过试样组分的分解所释出的至少一种核酸在步骤5) 的扩增前经净化。依扩增条件不同，例如在借助于PCR扩增时由于受限的引物选择，则该净化是必需的，以达到最佳的扩增结果。该净化例如可通过用为随后的扩增同时调节最佳条件的缓冲溶液进行冲洗来实现。此外，在一个优选实施方案中，在步骤幻中经扩增的核酸接着被过滤器洗脱。术语“洗脱”表示核酸从过滤器中脱出或溶出。为此向过滤器供入由一种或多种溶剂组成的流动相，并随洗脱液洗出核酸。如果例如作为最终用途欲成批检测经扩增的核酸，则要实施该步骤。在此特别优选是水性洗脱，即在去离子水中洗脱经扩增的核酸。如果借助于PCR进行扩增，则在分离试样组分后优选用含BSA的PCR缓冲液冲洗过滤器，以去除例如杂质如代谢产物、调节用于随后的PCR的介质和停用过滤器。之后加入由DNTP、引物、聚合酶和缓冲液组成的混合物，并实施PCR常用的热循环。在该热循环中 DNA扩增(增多)。接着可用过滤器将其洗脱。例如可从含IO5个病菌的10 ml尿中经20次循环分离出在50 μ 1中的IO11个DNA分子。此外，一个实施方案是优选的，即其中在步骤幻中扩增的核酸用过滤器的滤液进行冲洗，在微流体系统中混合洗脱液并再送到过滤器。该滤液优选与试样的当前流向呈反相流过过滤器，并且混合后的洗脱液以当前的流向流过过滤器。通过这一方法步骤可实现扩增核酸的净化，例如以改进接着的检测结果。异硫氰酸胍(GIT)和/或乙醇适合用作滤液。在微流体系统中的混合可借助于磁珠和/或混合器结构例如用洗涤缓冲液进行。或者，核酸的色谱净化也是可能的。此外，另一种可能是，在下流后将洗脱液提供到一个新鲜的过滤器上。该步骤在某些应用中是有用的，例如对DNA的纯度有特别要求时使用。如上所述，过滤器可包含散粒料或固定相。在此情况下，优选是用过滤器的滤液冲洗在步骤幻中扩增的核酸，在微流体系统中混合洗脱液，并再送到过滤器上。该滤液与当前的流向呈反向流过固定相，并且混合后的洗脱液以当前的流向流过固定相。因此通过适当选择固定相可实现色谱净化。本发明的另一目的是提供一种用于实施本发明方法的设备，该设备呈实验室芯片系统结构。该设备可以宏观试样体积在μ-TAS系统中实施本发明方法。因此，虽然是含有高浓度的待浓集的试样组分的大试样体积，但也可实现微型化，该微型化可省时和低成本运行。本发明的其它优点和有利的方案通过附图和实施例阐明，并在下面说明书中描述。要注意的是，这些附图和实施例仅是描述性质，不能认为是以任何方式限制本发明。


图1示出本发明方法的示意流程。图2示出具有侧向流过的纤维过滤器201的分离系统。图3示出具有横向流过的过滤器301的分离系统。图4示出在实施例中试样1的实验结果-标记引物过滤器-PCR IO7细胞25 μ 1。图5示出在实施例中试样2的实验结果-标记引物过滤器-PCR IO7细胞25 μ 1。图6示出用于算出检测限的试验的实验结果。图7示出实施例中图1-3中的试样1-3的杂交图案。
具体实施例方式图1示出使用分离系统的本发明方法的示意流程。将生物试样例如尿(其中含有病菌如大肠杆菌)加入到过滤器上。待扩增的核酸是 DNA，且扩增借助于PCR进行。
在步骤1中，每ml含IO4-IO7个细菌的细菌悬浮液102的宏观量的试样体积(10 ml)在最大为0. 5巴压力下经10分钟(S卩1 ml/min)通过过滤器(在此为二氧化硅纤维垫 101)。大肠杆菌以95%-99 %的分离度滞留在二氧化硅纤维垫上，以使悬浮液103随后几乎不再含有细菌102。接着在步骤B中，用100-500 μ 1的PCR缓冲液洗涤过滤器101，以创造PCR的最佳条件。在步骤C中，加入PCR溶液即含dNTP、缓冲液、Taq-聚合酶、引物和 PEG的30 μ 1 PCR主混合物，并开始PCR循环。在PCR反应中，第一变性步骤导致大肠杆菌102溶解。步骤D示出扩增DNA的第一部分净化，即反向于当前流向流下。在微流体系统中借助于由箭头104表示的混合器混合洗脱液，并再送到过滤器。在最后的步骤E中，流下的DNA按流向再次加到过滤器上。用洗涤缓冲液冲洗后，洗涤缓冲液排入图中以105表示的废物容器中，经净化的DNA在50 μ 1杂交缓冲液中洗脱(以箭头106表示)。接着该 DNA立即用于杂交。图2示出具有侧向流过的纤维过滤器201的分离系统。箭头204表示按本发明方法步骤幻在过滤器上分离时试样的流向。该分离系统具有试样和试剂的加入口 205和排出口 206。在该具有侧向流过的纤维过滤器201的分离系统中，将生物试样如具有感染病毒的细胞的唾液试样在加入口 205处注射入该分离系统中，然后以流向204流经过滤器201 或穿过过滤器201，在此细胞由过滤器201所滞留。该唾液试样的残余液经排出口 206离开该分离系统。由此，感染病毒的细胞被浓集或浓缩。在下一步(未示出)中，添加扩增试齐U，其中包括专用的引物和阻断过滤器201的物质。接着借助于对病毒核酸有特异性的所述专用引物在过滤器201上或过滤器201中扩增释出的病毒-核酸，其中在第一扩增步骤中实现核酸提取，即细胞溶解。图3示出具有横向流过的过滤器301的分离系统。箭头304表示按本发明方法的步骤3)在过滤器上分离时试样的流向。该分离系统具有试样和试剂的加入口 305和排出口 306。在具有横向流过的过滤器301的分离系统中，来自BAL试样的细胞(如金黄色葡萄球菌)经加入口 305加到分离系统中。在此该细菌以流向304横向通过过滤器301或在过滤器301上通过，其中该细菌由过滤器301所滞留。 BAL试样的残余液经排出口 206离开该分离系统。由此，细菌被浓集或浓缩。在下一步(未示出)中溶解该细菌。加入扩增试剂后，在过滤器301中扩增该细菌的核酸。实验1
用该实验可表明是否可弃去单独的提取步骤或溶解步骤，是否可在过滤器上实施PCR 以及是否可在最后实现成功的杂交。使用反向引物在过滤器上实施PCR，该反向引物在5 ’端由萤光分子花青素3标记。该实验用IO7个大肠杆菌细胞进行，这些细胞在Qiagen QIAamp Mini Spin组件中的半个破碎过滤器上离心(6000转/分，15秒)。之后将该过滤器块转入PCR容器中， 并加入PCR试液(含BSA)。表1 :PCR 试液
权利要求
1.用于从生物试样中浓缩试样组分和扩增含于试样组分中的核酸的方法，其包括下列步骤1)备制液态的生物试样(102)，2)将该试样送入具有至少一个过滤器O01)的分离系统中，3)通过在过滤器(201)上分离试样组分而浓集含于试样中的试样组分，4)加入扩增试剂，和5)直接扩增至少一种含于试样组分中的核酸。
2.权利要求1的方法，其特征在于，所述扩增在步骤5中通过PCR进行，并包括至少下列分步骤5. 1)过滤器的改性、核酸提取和至少一种核酸的变性，5.2)引物结合，和5.3)引物延伸。
3.权利要求2的方法，其特征在于，在步骤5.1)中的过滤器O01)的改性通过在步骤4)中加入阻断过滤器O01)的聚合物进行，该聚合物选自可溶性的蛋白或白蛋白，优选 BSA ；或合成的聚合物，优选PEG成PPG。
4.上述权利要求之一的方法，其特征在于，在步骤3中侧向流过所述过滤器001)。
5.上述权利要求之一的方法，其特征在于，所述过滤器选自-纤维过滤器，优选含二氧化硅的纤维过滤器，特别优选玻璃纤维过滤器， -膜过滤器，和-离子交换剂，优选阴离子交换剂。
6.上述权利要求之一的方法，其特征在于，在步骤幻和4)之间进行试样组分的酶促分解、热分解、化学分解和/或机械分解。
7.权利要求6的方法，其特征在于，在步骤幻的扩增前净化通过试样组分的分解所释出的至少一种核酸。
8.上述权利要求之一的方法，其特征在于，接着由过滤器(201)洗脱步骤5)中扩增的核酸。
9.上述权利要求之一的方法，其特征在于，用过滤器O01)的滤液冲洗步骤幻中扩增的核酸，在微流体系统中混合洗脱液并再送到过滤器，其中所述滤液优选与当前试样的流向(204)反向流过过滤器001)，并且混合后的洗脱液以当前流向(204)流过过滤器 (201)。
10.用于实施权利要求1-9之一的方法的设备，特征在于该设备呈实验室芯片系统结构。
全文摘要
本发明涉及一种用于从生物试样中浓缩试样组分和扩增含于试样组分中的核酸的方法，其中该核酸在分离试样组分的同一个过滤器上扩增。
文档编号C12N15/10GK102453710SQ20111032909
公开日2012年5月16日 申请日期2011年10月26日 优先权日2010年10月27日
发明者魏勒 J., 道布 M., 罗塔歇尔 P., 明希 S. 申请人:罗伯特·博世有限公司