专利名称：提高牛的瘦肉率、肌间脂肪含量和生殖能力的转基因载体的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高牛的瘦肉率、肌间脂肪含量和生殖能力的转基因载体。
背景技术：
牛肉作为中国人民的主要肉类食品之一，保证全国人民有充足的、优质的牛肉供应是关系到人民日常生活的重要事件。而随着人口的增长和人民生活水平的提高，除了对牛肉的需求量增加以外，对牛肉的质量和口感的要求也提高了。上海浦东国际机场就曾发现从日本走私运入价值一百万余元、八百多公斤的顶级和牛肉(又称雪花牛肉)，由此可见中国对高档肉类产品的消费需求。因此，有必要建立和改良中国自己的牛的品种，改善牛肉口感和质量，以满足人民群众的生活需求。前面提到的顶级和牛肉的特点是肉色艳丽，脂肪有如大理石花纹般分布在肌肉内，可比秋季降霜时的美丽，而且由于肌肉中富含脂肪，入口柔融欲化，风味鲜美。因此，可通过降低牛全身的脂肪含量来提高瘦肉率，同时，增加肌肉中的脂肪含量来改善牛肉的口感和品质。在肌肉中过表达PEPCK-C的(PEPCK-Cmus)转基因小鼠有着令人吃惊和兴奋的表型。首先，PEPCK-Cmus转基因小鼠的运动能力远远高于对照小鼠，可以以20米/分钟的速度跑上5公里(对照小鼠在同样的速度下只能跑0.2公里)。其次，PEPCK-Cmus转基因小鼠的寿命远远长于对照小鼠，而且在30-35月时还能够产下正常的小鼠后代(大多数小鼠在12-18月时就失去生殖能力了)。PEPCK-Cmus转基因小鼠的高运动能力可能与骨骼肌里的甘油三酯的增加有关。尽管PEPCK -Cmus转基因小鼠全身的脂肪含量下降，不到对照小鼠脂肪含量的一半，但是PEPCK-Cmus转基因小鼠比对照小鼠却有更多的脂肪分布于骨骼肌中(Hakimi, P.et al.“Overexpression of the cytosolic form of phosphoenolpyruvatecarboxykinase(GTP) in skeletal muscle repatterns energy metabolism in themouse.”J Biol Chem，2007.282 (45):32844-32855)。PEPCK-Cmus 转基因小鼠中低脂肪含量和高肌间脂肪含量的特点和顶级和牛肉的特性是类似的。基于PEPCK-Cmus转基因小鼠的神奇表型，我们预期在牛的骨骼肌中过表达PEPCK-C可降低牛的脂肪含量，并在肉质和口感上得到大幅度的提高，这样的牛肉有着巨大的经济价值。大规模的生产PEPCK-Cnius转基因牛有望填补国内在高品质牛肉的空白，丰富人民群众的菜篮子，对提高人民群众的生活质量有重要的意义。而且PEPCK-C转基因可提高小鼠的生殖能力，因此，PEPCK-Cmus转基因牛很可能在繁殖能力上有所提高，在优良品种的繁殖上有着广泛的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种能提高牛的瘦肉率、肌间脂肪含量和生殖能力的转基因载体。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
转基因载体含有小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase, MCK)增强子、2.7kb牛的a-骨骼肌肌动蛋白(a-skeletal actin)基因的启动子、牛的PEPCK-C的cDNA和牛生长激素基因(bGH)的3’端不翻译区域，且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因一嘌呤霉素(Puromycin)基因和原核细胞中筛选用的抗性基因-博莱霉素(Zeocin)基因(见图2)。2.7kb的a-骨骼肌肌动蛋白(a-skeletal actin)的启动子可保证下游的基因在骨骼肌中特异表达，而且MCK增强子也具有肌肉组织特异性的增强子活性，可特异地促进下游基因的高表达。在此转基因载体中表达的是牛自身的PEPCK-C基因，所以从食品安全的角度讲，对消费者的健康没有任何影响。此外，本发明在嘌呤霉素和博莱霉素抗性基因的两端还加入LoxP序列，这样，在PEPCK-C基因整合到基因组DNA后，如有需要，我们可通过表达Cre蛋白，诱导LoxP序列的重组，以除去抗性基因，进一步保障转基因动物的食品安全性。本发明所构建的肌肉组织特异表达牛PEPCK-C的转基因载体全序列如SEQID No:I所示。其中，第51-1919碱基为牛PEPCK-C编码区，第2094-2307碱基为bGH 3’端不翻译区，第2483-2516碱基为LoxP，第2872-3543碱基为嘌呤霉素抗性基因，第3601-3972碱基为博莱霉素(Zeocin)抗性基因，第3982-4015碱基为LoxP，第5489-5839碱基为MCK增强子，第6145-8892碱基为牛a -骨骼肌肌动蛋白基因的启动子。本发明的转基因载体可应用于体细胞克隆，以构建高瘦肉率、高肌间脂肪含量和高生殖能力的PEPCK-Cmus转基因牛。
图1是本发明的技术流程图。 图2是本发明构建的PZT51转基因载体的示意图。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1:插入 LoxP-Puro-Zeo-LoxP 片段,构建 pZTl。将pO)NA3.1 (myc-His) a 载体(Invitrogen)用 PvuII 酶切，酶切体系为 2 ii g 质粒DNA, 3 u I 10Xbuffer,2u I PvuII 酶，加入 ddH20 补足体积至 30 yl，37°C 温浴 3 小时.然后将酶切体系在I %的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出3.3kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA.具体步骤为，将紫外光下切下目的DNA条带装入1.5ml离心管中，称重后加入3倍体积的溶胶液，55°C保温10分钟，使琼脂糖凝胶完全融化；融化的凝胶待温度降至室温后，将混合液转入附柱中，10，OOOg离心I分钟，倒掉流出液；加入650 u I漂洗缓冲液，10，OOOg离心I分钟，倒掉流出液；吸附柱再次离心，10，OOOg离心，I分钟，倒掉流出液；将吸附柱转移到一个新的1.5ml离心管中，加入50 u I ddH20，放置I分钟，10，OOOg离心I分钟收集纯化产物.
从pSNAP载体用EcoRV酶切出LoxP-Puro-Zeo-LoxP片段，酶切体系为3 ii g质粒DNA, 3 u I 10 X buffer, 2 u I EcoRV 酶，加入 ddH20 补足体积至 30 yl，37°C 温浴 3 小时。然后将酶切体系在I %的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出1.7kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA.具体步骤同上。将pCDNA3.1 (myc-His) a (PvuII)和 LoxP-Puro-Zeo-LoxP (EcoRV)连接，连接反应中加入2 ill载体，6 ill插入片段，I ill 10Xbuffer,l U I T4DNA连接酶，16°C温浴16小时。将连接产物转化到E.coli的感受态细胞中。取一管50 ill的Trans5 a感受态细胞置于冰上，待其融化后，向其中加入4 Ul上述连接产物，轻弹混匀，后于冰上孵育30分钟；42°C热击30秒，后冰上静置10分钟；加入500 u I无抗性的LB液体培养基，37°C震荡培养I小时；4，OOOrpm离心5分钟，吸走，保留IOOiU左右的培养基，用移液器将细菌沉淀吹打均勻后涂布在含氨节和博莱双抗性的LB培养基平板上。然后将平板置于37°C温箱培养16小时。克隆生长出来后，挑单克隆菌落至3ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37°C震荡培养12小时，提取质粒DNA，用EcoRI酶切鉴定，阳性克隆中可得到2.9kb和2.0kb的两条DNA条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性，得到的克隆即为PZT1。实施例2:插入牛a-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA片段，构建pZT2。将pZTl 用 PvuI 和 NdeI 双酶切，酶切体系为 2iig 质粒 DNA，3iil 10 X buffer,1.5 ill PvuI酶，1.5 ill NdeI酶，加入ddH20补足体积至30iil，37°C温浴3小时。然后将酶切体系在I %的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出4.0kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。通过PCR扩增得到2.7kb的牛a -骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA片段，PCR条件如下:lyl (约 IOOng)牛基因组 DNA，引物 I (ATG CCT CCT CAG CTCTCA AAC GG)和引物2 (TCA CAT CTG GCT GAT TCT CTG CTT C)的终浓度均为 0.5 u M, dNTPs 的终浓度为 0.2mM,5u I 10 X buffer, I u I HiFi Taq 酶，加入 ddH20 补足体积至 50 y I。PCR 循环为，95°C，2分钟；接着是950C，30秒，550C，30秒，72。。，3分钟，35个循环；72°C，5分钟；4°C，保温。将PCR产物在I %的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出2.7kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。将PCR扩增得到的2.7kb的牛a -骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA片段通过TA克隆连接到pEASY-T3载体(全式金公司)上。Iyl pEASY_T3，加入4 2.7kb的牛a -骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA片段，250C，30分钟。然后将连接反应转化到E.coli感受态细胞中，把转化后的细胞涂布到含有IPTG和X-Gal以及氨苄青霉素的LB平板上生长。克隆生长出来后，挑白色的单克隆菌落至3ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37°C震荡培养12小时，提取质粒DNA，用EcoRI酶切鉴定，阳性克隆中可得到3.0kb和2.7kb的两条DNA条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性，得到的克隆即为pLCNK3。从pLCNK3用PvuI和NdeI双酶切以切出牛a -骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA，酶切体系为 g pLCNK3DNA, 3 u I 10 Xbuffer,1.5u I PvuI 酶，1.5 y I NdeI 酶，加入ddH20补足体积至30 u 1，37°C温浴3小时。然后将酶切体系在I %的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出2.7kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。将pZTl (PvuI/NdeI)和牛a -骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA(PvuI/NdeI)连接，连接反应同上。
将连接产物转化到E.coli的感受态细胞中。具体步骤同上，除了只用博莱霉素进行抗性筛选。克隆生长出来后，挑单克隆菌落至3ml含博莱霉素的LB培养液中，37°C震荡培养12小时，提取质粒DNA，用EcoRI酶切鉴定，阳性克隆中可得到2.8kb、2.lkb、1.6kb和0.5kb的四条DNA条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性，得到的克隆即为pZT2。实施例3:插入牛PEPCK-C编码区域DNA片段，构建pZT4。将pZT2 用 NdeI 和 KpnI 双酶切，酶切体系为 2iig 质粒 DNA，3iil 10 X buffer,1.5 ill KpnI酶，1.5 ill NdeI酶，加入ddH20补足体积至30iil，37°C温浴3小时。然后将酶切体系在I %的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出6.6kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。通过PCR扩增得到1.9kb的牛PEPCK-C编码区DNA片段，PCR条件如下:1 Ul胎牛成纤维细胞的 cDNA，引物 I (ATG CCT CCT CAG CTC TCA GAC G)和引物 2(GGTACC TTACAT CTG GCT GAT TCT CTG CTT C)的终浓度均为 0.5 y M，dNTPs 的终浓度为 0.2mM, 5 U I10 X buffer, I U I HiFi Taq 酶，加入 ddH20 补足体积至 50 yl。PCR 循环为，95°C，2 分钟；接着是95 °C，30秒，55 °C，30秒，72 °C，2分钟，35个循环；72 °C，5分钟；4°C，保温。将PCR产物在I %的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出1.9kb大小的DNA条带,用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。 将PCR扩增得到的的牛PEPCK-C编码区DNA片段通过TA克隆连接到pEASY_T3载体(全式金公司)上。Iyl ￡45￥13，加入4111的牛？￡ 0(-(:编码区0嫩片段，251:，30分钟。然后将连接反应转化到E.coli感受态细胞中，把转化后的细胞涂布到含有IPTG和X-Gal以及氨苄青霉素的LB平板上生长。克隆生长出来后，挑白色的单克隆菌落至3ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37°C震荡培养12小时，提取质粒DNA，用EcoRI酶切鉴定，阳性克隆中可得到3.0kb和1.9kb的两条DNA条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性，得到的克隆即为PZT3。从pZT3中用NdeI和KpnI双酶切以切出牛PEPCK-C编码区域DNA片段，酶切体系为 3iig pZT3DNA, 3 u I 10 X buffer,1.5u I KpnI 酶，1.5 y I NdeI 酶，加入 ddH20 补足体积至30iU，37°C温浴3小时。然后将酶切体系在I %的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出1.9kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。将pZT2 (KpnI/NdeI)和牛 PEPCK-C 编码区域 DNA 片段(KpnI/NdeI)连接，连接反应同上。将连接产物转化到E.coli的感受态细胞中。具体步骤同上，除了只用博莱霉素进行抗性筛选。克隆生长出来后，挑单克隆菌落至3ml含博莱霉素的LB培养液中，37°C震荡培养
12小时，提取质粒DNA，用EcoRI酶切鉴定，阳性克隆中可得到2.8kb、2.0kbU.9kb和1.6kb的四条DNA条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性，得到的克隆即为pZT4。实施例4:插入MCK增强子DNA片段，构建pZT51。将pZT4 用 PvuI 酶切，酶切体系为 g 质粒 DNA，3ii I 10Xbuffer,1.5 U IKpnI酶，1.5 u INdeI酶，加入ddH20补足体积至30 yl，37°C温浴3小时。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出8.5kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。pZT4 载体的去磷酸化，35 ill pZT4 (PvuI), 4 U I 10 X buffer，I 牛小肠碱性去磷酸化酶(CIP)，37°C温浴I小时。然后将反应体系在I %的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出8.5kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。通过PCR扩增得到MCK增强子DNA片段，PCR条件如下:I yl (约IOng)模板DNAPST181，引物 I (gataCGATCGACGGGCCAGATATACGCGTTAGAA)和引物 2 (ccggCGATCGGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTAT)的终浓度均为 0.5 u M, dNTPs 的终浓度为 0.2mM, 5 u I 10 X buffer, I u IHiFi Taq酶，加入ddH20补足体积至50iU。PCR循环为，95°C，2分钟；接着是95°C，30秒，550C，30秒，720C，30秒，35个循环；72°C，5分钟；4°C，保温。然后将PCR产物在I %的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出500bp大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。用PvuI 酶切 MCK 增强子 DNA 片段，酶切体系为 3 ii g DNA，4 ill 10 X buffer, 3 U IPvuI酶，加入ddH20补足体积至40iU，37°C温浴3小时。然后将酶切体系在I %的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出500bp大小的DNA条带,用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。将pZT4(PvuI/CIP)和MCK增强子DNA片段(PvuI)连接，连接反应同上。将连接产物转化到E.coli的感受态细胞中。具体步骤同上，除了只用博莱霉素进行抗性筛选。克隆生长出来后，挑单克隆菌落至3ml含博莱霉素的LB培养液中，37°C震荡培养12小时，提取质粒DNA，用PvuI酶切鉴定，阳性克隆中可得到8.5kb和0.5kb的两条DNA条带。再通过测序进一步确定阳性克 隆的正确性，得到的克隆即为PZT51。
_核苷酸或氨基酸序列表_
SEQUENCE LISTING
<110〉南开大学
<120〉提高牛的痩肉率、肌间脂肪含量和生殖能力的转基因载体 〈130〉 sglll02402 <160〉 I
<170> Patentln version 3.3
〈210〉 I <211〉 8971 <212〉 DNA <213〉肌肉组织特异表达牛PEPCK-C的转基因载休全序列 〈400〉 I
tatggtcgac ctgcaggcgg ccgcgaattc actagtgatg gatcgccctt atgcctcctc 60
agctctcaga cggcctcaac tactcagcca aaatcgtccg gggctccctg gacagcctgc 120
cccaggccgt gaggagtttc gtggagagca gcgccaagct gtgccggcct gaccaagtcc 180
acatctgcga tggctccgag gaggagaacc ggcagctgct gagccacatg gaggaggagg 240
gtgtgatcaa gaggctgaag aagtatgaca actgctggtt ggctctcact gaccccaggg 300
atgtggccag aattgaaagc aagacggtca tcatcactcg agagcaaaga gatacggtgc 360
权利要求
1.一种提高牛的瘦肉率、肌间脂肪含量和生殖能力的转基因载体，其特征在于该转基因载体包含小鼠的肌酸激酶增强子、2.7kb牛的a-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子、牛的PEPCK-C的cDNA和牛生长激素基因的3’端不翻译区域，且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因一嘌呤霉素基因和··核细胞中筛选用的抗性基因-博莱霉素基因。
全文摘要
本发明公开了一种提高牛的瘦肉率、肌间脂肪含量和生殖能力的转基因载体，该转基因载体包含小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase，MCK)增强子、2.7kb牛的α-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子、牛的PEPCK-C的cDNA和牛生长激素基因的3’端不翻译区域，且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因--嘌呤霉素基因和原核细胞中筛选用的抗性基因-博莱霉素基因。本发明的转基因载体可应用于体细胞克隆，以构建高瘦肉率、高肌间脂肪含量和高生殖能力的PEPCK-Cmus转基因牛。
文档编号C12N15/85GK103074371SQ20111032913
公开日2013年5月1日 申请日期2011年10月26日 优先权日2011年10月26日
发明者戴一凡, 陈凌懿 申请人:南开大学