专利名称：蛋白去乙酰化酶sirt1在促进间充质干细胞增殖与延缓衰老中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于酶的新用途，特别是涉及蛋白去乙酰化酶SIRTl在调控间充质干细胞增殖与衰老中的应用。
背景技术：
SIRTl(silent mating type information regulation 2homolog 1)是 Sirtuin家族(SIRTl-7)的一员，是一种从细菌到人类高度保守的多功能的NAD依赖的蛋白去乙酰化酶。它能延长酵母、果蝇和线虫等低等生物的寿命。在小鼠和人等高等动物中，它参与调控恶性肿瘤生成及化疗耐药、应激应答、细胞代谢和老化等多种生命活动，从而作为治疗恶性肿瘤、糖尿病、血管老化以及帕金森等疾病的潜在靶子而引起广泛关注。骨髓或脂肪来源的间充质干细胞(MSC)具备以下优势1)取材方便，易于分离培养扩增；幻具有免疫调节能力，同种异体移植MSCs可诱导免疫耐受；幻遗传背景稳定，适合作基因治疗的载体细胞；4)具有多向分化潜能，可分化为骨、软骨、脂肪、内皮、神经和胰岛样等多种细胞。这些优势使其成为组织和细胞工程理想的种子细胞。但是，在体外扩增培养过程中，MSC的增殖很快停滞(growth arrest)，细胞逐渐衰老，这是目前影响MSC应用的主要障碍。因而明确间充质干细胞增殖和衰老的调控机制，延长MSC的寿命，在基于间充质干细胞的组织细胞替代和修复治疗中具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛋白去乙酰化酶SIRTl的新用途，即在促进间充质干细胞增殖与延缓其衰老中的应用。所述间充质干细胞可来源于骨髓和脂肪。具体来讲，所述用SIRTl延缓间充质干细胞衰老的方法为在间充质干细胞中过表达 SIRTl。具体来讲，所述用SIRTl促进间充质干细胞增殖的方法为以下之一方法1)在间充质干细胞中过表达SIRTl ；方法2)用SIRTl的激活剂处理间充质干细胞。所述在间充质干细胞中过表达SIRTl的方法优选为利用重组慢病毒载体系统将SIRTl基因导入间充质干细胞，SIRTl得到过表达，具体包括以下步骤A)将SIRTl基因导入慢病毒载体系统中的目的基因转移载体中，得到携带有SIRTl基因的重组慢病毒载体；B)将携带有SIRTl基因的重组慢病毒载体与慢病毒载体系统中的两种包装质粒和包膜质粒按4. 5-5. 5 3.7-4.7 1.5-2.5 2. 3-3. 3的重量份数比混合后，用脂质体介导法转染慢病毒包装细胞，得到携带有SIRTl基因的重组慢病毒；C)将携带有SIRTl基因的重组慢病毒转染间充质干细胞，得到表达SIRTl的间充质干细胞。所述方法2)中SIRTl的激活剂可为白丁芦醇(resveratrol)或4_吡啶甲酰胺(isonicotinamide)；所述用SIRTl的激活剂处理间充质干细胞的方法为将IX 105个MSC接种于六孔板，使用1_20μπι浓度的白丁芦醇加入到培养基当中，持续培养3天；所述白丁芦醇的浓度优选为5 μ m或20 μ m，尤其优选为20 μ m。本发明的应用还包括在间充质干细胞中过表达SIRTl的同时还过表达有尼克酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)；所述过表达的方法优选为利用重组慢病毒载体系统将SIRTl基因和Nampt基因分别导入间充质干细胞，SIRTl和Nampt共表达。本发明提供了蛋白去乙酰化酶SIRTl的一种新用途，即在调控间充质干细胞增殖与衰老中的应用。实验结果表明，增殖期的MSC中SIRTl的表达水平较高，而在衰老的MSC中SIRTl的表达水平很低，甚至不表达(见图1)，在MSC中过表达SIRTl基因和可促进MSC的增殖并延长其寿命；SIRTl特异地Knockdown (在MSC中表达抑制SIRTl基因表达的小干扰RNA)能显著减缓骨髓来源的间充质干细胞的增殖，使Brdu标记的S期细胞明显减少，随着培养时间的延长，与对照细胞相比，衰老细胞数也显著增加(见图幻；此外，在脂肪组织来源的间充质干细胞中，SIRTl Knockdown也具有同样的作用(见图5)。这些结果表明，SIRTl为间充质干细胞体外增殖所必需，在骨髓来源的MSC和脂肪来源的MSC中均得到验证，因而可通过调控MSC中SIRTl的表达水平调控MSC的增殖及衰老。本发明对明确间充质干细胞增殖和衰老的调控机制，延长MSC的寿命，在基于间充质干细胞的组织细胞替代和修复治疗中具有十分重要的意义，应用前景广阔。
图1为SIRTl的表达水平与MSC的增殖和衰老的关系的检测结果图2为证明SIRTl对MSC增殖和衰老的调控作用的技术路线图3为用基于慢病毒的载体系统在MSC中过表达SIRTl及其酶活性失活的负显性突变体H363Y，观察MSC的增殖和衰老情况，明确SIRTl的过表达及高酶活性能促进MSC增殖并延长其寿命的检测结果图4为用SIRTl的激活剂处理后MSC增殖和衰老情况的Brdu染色和PI染色结果，明确SIRTl的过表达及高酶活性能促进MSC增殖并延长其寿命的检测结果图5为用基于慢病毒的载体系统在MSC中表达抑制SIRTl基因表达的小干扰RNA，观察MSC的增殖和衰老情况，明确SIRTl的低表达及低酶活性能促进MSC衰老并减短其寿命的检测结果图6为目前已知的细胞增殖停滞和衰老的信号传导机制图7为SIRTl被激活或抑制的MSC中p21Cipl和pl6INMa表达水平的检测结果
具体实施例方式实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。部分检测方法如下CN 102382801 A
说明书
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PKpropidine iodine)染色用胰蛋白酶消化细胞，用70%乙醇_20°C固定过夜，洗涤后加入100 μ L终浓度为lmg/mL的RNase A 37°C处理30分钟，最后加入300 μ L 50mg/mL 的 PI 染色液(配方:5mg PI+0. ImL Triton X-100+3. 7mg EDTA+1 OmLPBS，4 度避光保存)室温染色30分钟后上流式细胞仪检测细胞周期。Brdu染色将MSC —式三份种入M孔板，使其达30%汇合后，加入终浓度为IOmM的Brdu(购自Sigma公司)，37°C孵育4小时，随后用甲醇丙酮(1 1)固定液在_20°C下固定20分钟，2M HCl室温处理30分钟，用1 200稀释的Alexa_594标记的抗Brdu抗体(购自hvitrogen公司)室温染色60分钟，最后用DAPI复染细胞核，显微镜下计数红色细胞(阳性细胞，BrdU掺入的细胞，也是处于增殖期的细胞)和蓝色细胞(所有活细胞)的数量。衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色将1 X IO4个MSC细胞种入M孔板，一式三份，使其达50%汇合后，用2%甲醛-0. 2%戊二醛固定液室温固定5分钟，加入X-Gal染色液(lmg/mL X-gal，40mmol/L 柠檬酸 / 磷酸钠(pH 6. 0)，5mmol/L 铁氰化钾，5mmol/L 亚铁氰化钾，150mmol/L NaCl,2mmol/L MgCl2) 37°C孵育12小时，显微镜下观察计数蓝色细胞比例。AnnexinV染色使用购自凯基生物的ArmexinV染色试剂盒，具体染色方法为1.贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集(注胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性)；2.用PBS洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)收集1-5 X IO5细胞；3.加入500 μ L的Binding Buffer 悬浮细胞；4.加入 5 μ L Annexin V-FITC 混勻后，加入 5 μ L PropidiumIodide，混勻；5.室温、避光反应5-15min ；6.在1 hour内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。实施例1、SIRTl对间充质干细胞(MSC)增殖与衰老的调控一、检测SIRTl的表达水平与MSC的增殖和衰老的关系采用常规密度梯度离心法联合贴壁培养法从人骨髓和脂肪组织中分离扩增MSC，在体外持续传代培养直至衰老，收集不同供者(供者1、2、3)，不同代数(4、7、8、12、14、17代)的细胞，检测SIRTl的表达(表达水平用Wfestern Blot方法检测，一抗为兔抗人SIRTl抗体(购自Epitomics公司)，二抗为山羊抗兔抗体(购自中杉金桥公司)及MSC增殖(细胞计数，PI染色和Brdu染色)和衰老(SA- β -Gal染色)指标，分析二者之间是否相关。其中，Western Blot检测结果如图1所示(A-MSC表示脂肪来源的间充质干细胞，B-MSC表示骨髓来源的间充质干细胞；β-actin蛋白作为内参)，可以看出处于增殖期的MSC中SIRTl的表达水平较高，而在衰老的MSC中SIRTl的表达水平很低，甚至不表达，从而证明SIRTl的表达水平与MSC的增殖和衰老相关，且随着细胞的衰老SIRTl的表达水平逐步降低。如图2所示的技术路线证明SIRTl可促进MSC增殖和延缓衰老，具体方法如下述步骤二、三、四所示二、SIRTl对MSC增殖的调控用下述实验进一步证明SIRTl促进MSC的增殖及延缓MSC衰老的作用实验1、用基于慢病毒的载体系统在骨髓来源的MSC中过表达SIRTl及其酶活性失活的负显性突变体
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H363Y(阴性对照，SIRTl是指蛋白去乙酰化酶，H363Y是蛋白去乙酰化酶SIRTl的突变体，具体来说就是将SIRTl自N端第363位氨基酸残基由H变成Y，从而使蛋白去乙酰化酶SIRTl失去活性，同时由于在细胞内失去活性的蛋白去乙酰化酶H363Y和具有活性的蛋白去乙酰化酶SIRTl存在竞争性，所以在细胞内表达H363Y之后会减弱SIRTl的作用)，观察MSC的增殖(细胞计数，PI染色、AnnexinV染色和Brdu染色)和衰老(SA- β _6al染色)情况，明确SIRTl的过表达及高酶活性是否能促进MSC增殖并延长其寿命，具体方法如下1. 1 Western Blot 检测 SIRTl 的过表达水平1. 1. 1 SIRTl基因和SIRT1-H363Y基因的获得(参见步骤具体方法包括以下步骤(限制性核酸内切酶、快速链接试剂盒、片段补平试剂盒均购自TaKaRa公司，胶回收试剂盒购自Promega公司)1.酶切载体 PBable-H363Y 和 pBable-Sirtl (Addgene 购买)酶切体系为质粒5ug，BamH I lul, Buffer K 5ul，用水补充反应体系至50ul，反应条件为30°C反应2小时。2.酶切载体pBplv (购自hvitrogen公司)酶切体系为质粒5ug，Sal I lul, Buffer H 2ul，用水补充反应体系至20ul，反应条件为37°C反应4小时。3.将步骤1中的酶切产物使用胶回收试剂盒回收酶切片段1)加入150ul的BufferDE-A，混合均勻后于75°C加热，间断混合直至凝胶块完全融化。2)加入75ul的BufferDE-B，混合均勻，加BufferDE-B后混合物的颜色为黄色，充分混勻以保证形成均一的黄色溶液。3)将试剂盒内提供的制备管置于试剂盒内提供的2mL离心管中，吸取步骤2)中的混合液，转移到DNA制备管，12000 Xg离心lmin，吸滤液加入到DNA制备管中，重复离心一次，弃滤液。4)将制备管置回2mL离心管，加500ul BufferWl，12000 X g离心30s，弃滤液。5)将制备管置回2mL离心管，加700ul BufferW2，12000 X g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700ul Bufferff2洗涤一次，12000Xg离心lmin。6)将制备管置回2mL离心管中，12000 Xg离心lmin。7)将滤液置于洁净的1. 5mL离心管(试剂盒提供)中，在制备管膜中央加入事先在水浴锅中以65°C预热的去离子水43ul，室温静置lmin，12000 X g离心Imin洗脱DNA。然后将滤液加入到制备管膜中央再离心一次。4.将步骤3中的回收产物进行补平反应体系步骤3中的回收产物43ul，IOXbuffer 5ul，dNTP (2. 5um) lul，反应条件为37°C反应20分钟。5.将步骤4中的产物用步骤3的方法进行纯化回收6.将步骤5的产物进行酶切酶切体系为步骤5的产物17ul，Buffer H 2ul，Sal I lul，反应条件为37°C反应2小时。
7.将步骤6的酶切产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，回收2. 2Kb大小的片段，回收方法同步骤3。8.将步骤2中的产物用步骤3的方法进行纯化回收。
9.将步骤8中的产物进行酶切酶切体系为步骤8的产物15ul，Buffer T 2ul，BSA 2ul，Sma I lul，反应条件为37°C反应2小时。10.将步骤9的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收8Kb大小的片段，回收方法同步骤3。11.将步骤7和步骤10的产物按照7ul 3ul的比例混合，并加入IOul solusionI 16°C连接2小时，得到分别携带H363Y基因和SIRTl基因的载体，命名为pBplv-H363Y和pBplv-SIRTlo对得到的重组慢病毒载体用限制性内切酶EcoR V和Ml I进行酶切鉴定，对酶切产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果经酶切获得了约2000bp的DNA片段，与预期结果相符，表明获得了携带有SIRTl基因的重组慢病毒载体，将其命名为pBPLV-SIRTl。同样用与上述相同方法构建得到携带有H363Y基因的重组慢病毒载体，将其命名为pBplv-H363Y。1. 1.2慢病毒包装培养^3-FT (购自hvitrogen公司)慢病毒包装细胞，培养基为添加10% FBS,0. lmmol/L NEAA, 2mmol/L L-谷氨酰胺，1 % 青-链霉素，500 μ g/mL G418 的高糖 DMEM 培养基(Sigma公司产品，Cat#D5648)。用步骤1. 1. 1构建的携带有SIRTl基因的重组慢病毒载体PBPLV-SIRT1、携带有SIRT1-H363Y基因的重组慢病毒载体pBp 1V-H363Y (阴性对照)以及空载体pBPLV(空白对照)分别和包装质粒pLPl (购自^witrogen公司)、PLP2 (购自hvitrogen公司)及包膜蛋白质粒pLP/VSVG (购自hvitrogen公司)按5ug 4. 2ug 2ug 2. 8ug的比例混合后加入1.5mL无血清Opti-MEM8 I培养基(购自hvitrogen公司)中，轻轻混勻，在另一个无菌的5mL管中将42ul Iipofectamine2000(购自hvitrogen公司)稀释于1. 5mL的无血清Opti-MEM I培养基中，室温静置5分钟，混合以上两种液体，室温孵育20分钟以形成DNA-Iipofectamine 2000复合物。用0. 25%胰酶(Gibco公司产品，Cat#25200-056)消化收集培养的细胞，计数约6X IO6个细胞，将其重悬到5mL不含抗生素的生长培养基(在高糖DMEM培养基(Sigma公司产品，Cat#D5648)的基础上添加 10%胎牛血清(FBS) (Biochrom 公司产品，cat#S0115)，0. Immol/L 非必需氨基酸(Non-Essential Amino Acids, NEAA)(购自 HyClone 公司)和 2mmol/LL-谷氨酰胺)中，再将^3-FT包装细胞悬液与3mL含有DNA-Iipofectamine 2000复合物的培养基混勻后加入到含有5mL不含抗生素的生长培养基的IOcm细胞培养皿中，混勻，放于37°C、5% CO2孵箱中培养，次日用含有lmmol/L丙酮酸钠的完全培养基(在高糖DMEM培养基的基础上添加10%胎牛血清，0. lmmol/L非必需氨基酸，2mmol/L L-谷氨酰胺，
青-链霉素和lmmol/L丙酮酸钠)更换含有DNA-1 ipofectamine 2000复合物的培养基进行包装，并分别在包装对、72小时后取样，对经包装的293-FT细胞在荧光显微镜下进行观察，结果包装M小时后即可见到293-FT细胞内有绿色荧光蛋白eGFP表达(eGFP基因为慢病毒载体PBPLV携带)，表达绿色荧光蛋白eGFP的细胞超过95%，表明包装效率很高，且伴随着包膜质粒pLP/VSVG中VSVG基因的表达，逐渐出现293-FT细胞的多细胞合胞体，包装72小时后培养上清为淡黄色，此时收集病毒液上清于15mL的无菌离心管中，4°C、3000rpm离心15min去除细胞碎片，为排除细胞上清收集液中其它未知成分对干细胞增殖和衰老的影响，用10% PEG8000对慢病毒进行浓缩，将病毒上清冻存于_70°C备用。1. 1. 3慢病毒感染MSC和感染后MSC的流式细胞术分选病毒感染前一天于六孔板中接种MSC，至细胞密度为3 X IO5细胞/孔，感染时，每孔加入ImL步骤1. 1. 2获得的病毒上清和终浓度为8 μ g/mL的聚凝胺(polybrene，购自Sigma公司)促进病毒的转染效率，晃动培养瓶使病毒液能接触到所有细胞，3小时后加入3mL MSC细胞培养基(DMEM-低糖培养基，购自Sigma公司)按1 1体积比混合后加入体积百分浓度为10%的胎牛血清(Biochrom公司产品，cat#S0115)，再过池，更换新的培养基。荧光显微镜观测结果表明慢病毒可高效率的转染MSC，转染后的细胞通过流式细胞术进行分选，将感染有携带SIRTl基因的重组慢病毒载体pBPLV-SIRTl、感染有携带H363Y基因的重组慢病毒载体pBplv-H363Y和空载体pBPLV的MSC分别命名为MSC_SIRT1、MSC_H363Y和 MSC-pBPLV。1. 1. 4 Western blot方法检测转染细胞SIRTl的表达水平 分别取步骤1. 1. 3中经分选获得的1 X IO6个MSC-SIRT1、MSC-H363Y (阴性对照)和MSC-pBPLV (空白对照，Mock)，用放射性免疫沉淀裂解缓冲液RIPA (50mmol/LTris · HCl(pH8.0)，150mmol/L NaCl,lmmol/L DTT,0. 5mmol/L EDTA,1. 0 % NP40,0. 5 %去氧胆酸钠，0. 1 % SDS, 100 μ g/mL PMSF, 1 μ g/mL胰蛋白酶肽，2 μ g/mL亮抑制肽，100 μ mol/L正钒酸钠)裂解细胞，然后对裂解细胞进行不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，再用半干式电转的方法将蛋白质转移至PVDF膜，接着用5%脱脂奶粉封闭2h，再与相应的一抗(兔抗人SIRTl抗体，购自Epitomics公司)和二抗山羊抗兔抗体(购自中杉金桥公司)孵育后，用化学发光试剂(购自Santa Cruz公司，Cat# :SC_2048)于暗室自显影，同样用β-actin蛋白作为内参(一抗为小鼠抗人β-actin的多克隆抗体，购自Chemicon公司)。检测结果如图3中的图A所示，MSC-SIRT1中的SIRTl以及阴性对照中的H363Y在蛋白水平上获得表达(表达水平没有差异)，而空白对照pBPLV只有微量的表达。1. 2Brdu染色、SA- β -Gal染色和累积细胞群体倍增值检测SIRTl的过表达及高酶活性是否能促进MSC增殖并延长其寿命观察上述MSC/SIRT1、MSC/H363Y和MSC/pBPLV的增殖(细胞计数，PI染色、AnnexinV染色和Brdu染色)和衰老(SA-β -Gal染色)情况，明确SIRTl的过表达及高酶活性是否能促进MSC增殖并延长其寿命。慢病毒感染后第10天、第38天MSC的Brdu染色结果如图3中图B所示(横坐标表示时间，纵坐标表示BrdU掺入的细胞比例，*表示和对照组比较具有统计学意义)，由图可以看出SIRTl的高表达之后处于增殖期的MSC细胞明显增多，表明SIRTl的高表达可以促进细胞的增殖；慢病毒感染后第10天、第38天MSC的SA-β -Gal染色结果如图2中图C所示(横坐标表示时间，纵坐标表示SA-β -Gal染色阳性细胞的比例，即衰老细胞的比例，*表示和对照组比较具有统计学意义)，由图可以看出SIRTl的高表达之后衰老的细胞少于对照组，表明SIRTl的高表达可以延缓细胞衰老；慢病毒感染后第0、35、70、105天MSC细胞生长曲线如图3中的图D所示(横坐标表示时间，纵坐标表示累积细胞群体倍增值PDs = Ig (培养后细胞计数/培养前细胞计数)/lg2，将各代PDs值累加即得最终的累积细胞群体倍增值(cumulative population doublings, CPDs)，
8由图可以看出SIRTl的表达能够使MSC细胞保持较好的增殖状态，表明SIRTl的表达促进了 MSC细胞的增殖。上述检测结果证明了 SIRTl的过表达及高酶活性能够促进MSC增殖并延长其寿命。需要说明的是=Nampt是将抑制SIRTl酶活性的尼克酰胺转换为酶活性必需的NAD的一种限速酶，如果SIRTl的效果不明显的情况下，可以转入Nampt，以此来提高SIRTl的活性，但以上实验已证实SIRTl单独作用的效果就非常明显，因此一般不再需要共同转入Nampt0应用中如果希望提高表达效率，可以将SIRTl与Nampt共表达。因此，SIRTl与Nampt共表达也属于本发明的实施方式之一。实验2、酶SIRTl的激活剂主要有白丁芦醇(resveratrol)或4_吡啶甲酰胺(isonicotinamide)等，文章(Resveratrol Protects Human Endothelium fromH202_Induced Oxidative Stress and Senescence via SirTl Activation)的作者已经非常明确的证明白丁芦醇可以激活SIRTl的活性。本实验选用SIRTl的激活剂白丁芦醇(resveratrol)处理MSC,观察MSC的增殖(PI和Brdu染色)，明确SIRTl高酶活性是否能促进MSC增殖，具体方法如下3. 1用SIRTl的激活剂resveratrol (白丁芦醇)处理骨髓来源的MSC，以未经处理MSC为对照，处理方法为将IX IO5个MSC接种于六孔板中，使用1μπι、5μπι、20μπι浓度的白丁芦醇分别加入到培养基当中，持续培养3天。3. 2 Brdu染色、PI染色检测SIRTl的过表达及高酶活性是否能促进MSC增殖观察上述经激活剂处理的MSC和对照MSC的增殖(PI染色和Brdu染色)情况，明确SIRTl的过表达及高酶活性是否能促进MSC增殖并延长其寿命。经激活剂5um、20um处理后MSC的Brdu染色结果如图4中图A所示(BrdU掺入的细胞比例，*表示和对照组比较具有统计学意义)，由图可以看出SIRTl的高表达之后处于增殖期的细胞明显增多，表明SIRTl的激活可以促进MSC细胞的增殖。经激活剂5um、20um处理后MSC的PI染色结果如图4中的图B所示，经激活剂处理后的MSC处于S期的细胞数明显增多，进一步证明SIRTl的激活可以促进MSC细胞的增殖。实验3、用下述实验从反面证明SIRTl对延缓MSC衰老的调控作用用抑制SIRTl基因表达的小干扰RNA和基于慢病毒的载体系统在骨髓来源和脂肪来源的MSC中抑制SIRTl，观察MSC的增殖(细胞计数，PI染色、AnnexinV染色和Brdu染色)和衰老(SA- β -Gal染色)情况，明确SIRTl的低表达及低酶活性是否能促进MSC衰老并减短其寿命，具体方法如下1. 1 Western Blot检测表达有抑制SIRTl基因表达的小干扰RNA的MSC中SIRTl的表达水平1. 1. 1抑制SIRTl基因表达的小干扰RNA的获得首先在GenBank上找到人SIRTl基因的开放阅读框架全长，针对选用的慢病毒载体 pSicor，依照 Elbashir 的 RNAi 设计原则(Elbashir SM, Harborth J, Lendecke Iff, etal.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference In culturedMammaIiancells. Nature. 2001 ；411:494-498.), W ffl il http://www. ambion. com/techlib/misc/siRNA_finder. htmL在线设计，最终选择2个靶位，分别位于SIRTl基因mRNA序列转录起始位点aug下游的2段序列，将获得的2对抑制SIRTl基因表达的小干扰RNA分别命名为
9siRNA-Ι 和 siRNA-2，siRNA-1 作用于 SIRTlmRNA 的序列 5 ‘ -GAAGTGCCTCAGATATTAA-3 ‘，siRNA-2 作用于 SIRTl mRNA 的序列 5，-GTTGACCTCCTCATTGTTA-3，。1. 1. 2、抑制SIRTl基因表达的RNAi慢病毒干扰载体的构建根据siRNA-Ι和siRNA_2所作用的靶序列以及载体pBPLV的使用要求，设计能够产生siRNA-Ι和siRNA-2的siDNA序列，分别命名为shsirtll和shsirtl2，具体序列如下shsirtll 正义链5’ -TGAAGTGCCTCAGATATTAATTCAAGAGATTAATATCTGAGGCACTTCTTTTTTC-3，(序列表中序列1)shsirtll 反义链5’ -TCGAGAAAAAAGAAGTGCCTCAGATATTAATCTCTTGAATTAATATCTGAGGCACTTCA-3’(序列表中序列2)；shsirtl2 正义链5’ -TGTTGACCTCCTCATTGTTATTCAAGAGATAACAATGAGGAGGTCAACTTTTTTC-3'(序列表中序列3)shsirtl2 反义链TCGAGAAAAAAGTTGACCTCCTCATTGTTATCTCTTGAATAACAATGAGGAGGTCAACA-3，(序列表中序列4)。将shsirtll和shsirtl2的正义链和反义链两两退火后，再在T4DNA连接酶作用下分别与经限制性内切酶Hpa I和B10 I双酶切的慢病毒载体系统中的目的基因转移载体PBPLV中，对得到的重组慢病毒载体用限制性内切酶Bio I和^Cbal I进行酶切鉴定，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果经酶切分别获得了大小相差50bp的DNA片段，与预期结果相符，表明获得了分别携带有shsirtll和shsirtl2的重组慢病毒载体，命名为pSicor-shsirtll、pSicor-shsirtl2。1. 1.3慢病毒包装方法与步骤二中相同。1. 1. 4慢病毒感染MSC和感染后MSC的流式细胞术分选用携带有shsirtl、shsirtl2 的重组慢病毒载体 pSicor-shsirtll、pSicor-shsirtI〗及空载pSicor的慢病毒分别感染MSC，方法与步骤二相同。荧光显微镜观测结果表明慢病毒可高效率的转染MSC，转染后的细胞通过流式细胞术进行分选，将感染有携带SIRTl基因的重组慢病毒载体pSicor-shsirtll、感染有重组慢病毒载体pSicor-shsirtl2 以及空载体 pSicor 的 MSC 分别命名为 ShSIRTl-I、ShSIRTl-2 和 Mock。1. 1. 6 Western blot方法检测转染细胞SIRTl的表达水平分别取步骤1. 1. 4中经分选获得的IX IO6个MSC/shSIRTll、MSC/shSIRT2和空白对照Mock，用与步骤二相同的方法检测SIRTl基因的蛋白表达水平。检测结果如图5中的A幅所示(A-MSC表示脂肪来源的MSC，B-MSC表示骨髓来源的MSC)，空白对照Mock中的SIRTl基因和β -actin基因均可在蛋白水平上获得高水平表达，而SiSIRTI-I和aiSIRTl_2仅β-actin基因在蛋白水平上获得表达，表明SIRTl基因在SiSIRTI-I和aiSIRTl_2中的表达被抑制。2. 1 Brdu染色、SA-β -Gal染色和PI染色检测SIRTl的低表达及低酶活性是否能促进MSC衰老并减短其寿命观察上述经干涉处理的MSC和对照MSC的增殖(细胞计数、PI染色和Brdu染色)和衰老(SA-β-Gal染色)情况，明确SIRTl的过表达及高酶活性是否能促进MSC增殖并延长其寿命。感染慢病毒后0-15天MSC的细胞数统计结果如图5中的图B所示(A-MSC表示脂肪来源的MSC，B-MSC表示骨髓来源的MSC)，由图可以看出(细胞计数显示SIRTl基因表达被抑制(knockdown)使细胞增殖减慢)，表明SIRTl的下调表达可以抑制细胞的增值；感染慢病毒后5天的Brdu染色结果结果如图5中的图C、图D所示(A-MSC表示脂肪来源的MSC，B-MSC表示骨髓来源的MSC)，由图可以看出SIRTl基因表达被抑制使BrdU掺入显著降低，表明SIRTl的下调表达可以抑制细胞的增值；感染慢病毒后第5天GO-Gl期细胞、S期细胞和G2-M期细胞的细胞比例统计结果如图5中的图E所示(横坐标表示不同方法处理的MSC，纵坐标表示细胞所占比例，*表示有差异)，由图可以看出SIRTl基因表达被抑制后处于S期的细胞明显减少，表明SIRTl的下调表达可以抑制细胞的增值。SIRTl的抑制表达可以很好的抑制细胞的增殖从而促进细胞衰老。与此相反的是，在MSC当中，上调SIRTl的表达，发现SIRTl上调表达之后，Brdu染色结果如图3中的图B所示，由图可以看出SIRTl基因上调表达之后，使BrdU掺入比例显著提高，表明SIRTl的上调表达可以促进细胞的增值；生长曲线如图3中的图D所述，由图可以看出，SIRTl基因上调表达之后，细胞的增值加快；SA-β -Gal染色结果如图3中的图C所示，SIRTl基因上调表达之后衰老细胞明显减少，表明SIRTl的上调表达可以延缓细胞的哀老。实施例2、SIRTl对间充质干细胞(MSC)增殖与衰老的调控机理图6综述了目前所知的细胞衰老的机制途径一端粒缩短、癌基因激活及活性氧自由基引起DNA损伤，损伤信号激活p53，p53激活p21Cipl，p21 Cipl抑制CDK2导致pRb去磷酸化；另一条途径中某些衰老信号激活了 pl5INK4b或pl6INK4a，pl5INK4b或pl6INMa抑制⑶K4/6导致pRb去磷酸化。已经知道，去磷酸化的pRb及乙酰化的pRb —方面结合转录因子E2F抑制增殖促进基因的转录，另一方面影响增殖促进基因的染色质结构使其表达关闭，而高磷酸化的PRb及去乙酰化的pRb与E2F的结合能力降低，使E2F得以释放从而促进增殖促进基因的转录。因此，去磷酸化的PRb和乙酰化的pRb是导致细胞增殖抑制及衰老的活性形式。目前，人骨髓MSC细胞增殖停滞及衰老的调控机制不甚清楚，比较明确的是pl6INMa途径在此过程中起了重要作用。鉴于(I)SIRTl能下调人胚肺成纤维细胞中pl6INMa的表达并增强pRb的磷酸化；(2) SIRTl能直接使pRb去乙酰化而失活pRb36 ；(3) SIRTl能直接使p53去乙酰化而失活p532，推测SIRTl可能通过综合调控人MSC细胞中p21Cipl、pl6INK4a、pRb和p53中一个或几个分子的活性而在人MSC细胞增殖和衰老中发挥十分重要的调控作用。一、检测体外衰老的MSC中和SIRTl被激活或抑制的MSC中p21Cipl和pl6INMa的表达情况，明确哪条通路参与了 MSC增殖和衰老的调控用Wfestern blot方法检测体外衰老的MSC中和SIRTl被激活或抑制的 MSC (MSC-SIRT1、MSC-H363Y、MSC-pBPLV、ShSIRTl-I、ShSIRTl-2 和空白对照)中p21Cipl(p21)和pl6INK4a(pl6)的表达情况，一抗分别为p21抗体和pl6抗体(p21抗体购自Snata Cruz公司，pl6抗体购自BD公司)，二抗分别为山羊抗兔抗体和山羊抗小鼠抗体
1(购自中山金桥公司)。结果如图7所示，由图可以看出，通过干涉载体特异的抑制SIRTl的表达之后，P16的表达上调，p21的表达基本不变，过表达SIRTl之后，可以抑制pl6的表达，P21的表达水平基本不变，说明SIRTl上调延缓细胞衰老以及SIRTl下调促进细胞衰老是通过pl6这条通路，而不是p21这条通路。
权利要求
1.蛋白去乙酰化酶SIRTl在促进间充质干细胞增殖和/或延缓其衰老中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述间充质干细胞来源于骨髓或脂肪。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于用SIRTl促进间充质干细胞增殖与延缓其衰老的方法为在间充质干细胞中过表达SIRTl。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述在在间充质干细胞中过表达SIRTl包括以下步骤A)将SIRTl基因导入慢病毒载体系统中的目的基因转移载体中，得到携带有SIRTl基因的重组慢病毒载体；B)将携带有SIRTl基因的重组慢病毒载体与慢病毒载体系统中的两种包装质粒和包膜质粒按4. 5-5. 5 3.7-4.7 1.5-2.5 2. 3-3. 3的重量份数比混合后，用脂质体介导法转染慢病毒包装细胞，得到携带有SIRTl基因的重组慢病毒；C)将携带有SIRTl基因的重组慢病毒转染间充质干细胞，得到表达SIRTl的间充质干细胞。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于用SIRTl促进间充质干细胞增殖的方法为用SIRTl的激活剂处理间充质干细胞。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述中SIRTl的激活剂可为白丁芦醇(resveratrol)或4-吡啶甲酰胺(isonicotinamide)；所述用SIRTl的激活剂处理间充质干细胞的方法为将IX IO5个MSC接种于六孔板，使用1-20 μ m浓度的白丁芦醇加入到培养基当中，持续培养3天。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述白丁芦醇的浓度优选为5μπι或20 μ m,最优选为20 μ m。
8.根据权利要求1至7任一所述的应用，其特征在于所述在间充质干细胞中过表达SIRTl的同时还过表达有尼克酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述过表达的方法为利用重组慢病毒载体系统将SIRTl基因和Nampt基因分别导入间充质干细胞，SIRTl和Nampt共表达。
全文摘要
本发明公开了蛋白去乙酰化酶SIRT1的一种新用途，即在促进间充质干细胞增殖与延缓衰老中的应用。实验结果表明SIRT1为间充质干细胞体外增殖所必需，在骨髓来源的MSC和脂肪来源的MSC中均得到验证，可通过调控MSC中SIRT1的表达水平调控MSC的增殖及衰老。本发明对明确间充质干细胞增殖和衰老的调控机制，延长MSC的寿命，在基于间充质干细胞的组织细胞替代和修复治疗中具有十分重要的意义，应用前景广阔。
文档编号C12N15/867GK102382801SQ20111032935
公开日2012年3月21日 申请日期2011年10月26日 优先权日2011年10月26日
发明者岳 文, 翟超, 袁红丰, 裴雪涛 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所