拟南芥组蛋白脱乙酰化酶基因hda15在调控植物种子萌发中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程应用技术领域，具体涉及拟南芥组蛋白脱乙酰化酶基因 HDA15在调控植物种子萌发中的应用。
【背景技术】
[0002] 种子在农林和园艺生产中具有重要的地位，其萌发直接影响农林园艺的生产。目 前，由休眠到萌发的"开关"机制尚未明确，尤其是对种子萌发调控相关基因的研究方面。 种子萌发是种子植物生命周期中的一个关键过程，决定着植物何时进入自然和农业生态系 统。种子萌发涉及种皮破裂、胚根伸长、子叶扩张和绿化等连续阶段，各种各样的环境因素 都会影响种子萌发，包括温度、湿度、光照和养分的有效性。其中光是种子萌发中一个关键 的环境因素，它是通过光受体，如光敏色素、隐花色素和向光素等来感知。
[0003] 光敏色素是种子萌发过程中主要的光受体，它是吸收红光-远红光可逆转换的光 受体。它有两种类型，一种为红光吸收型（Pr)，最大吸收峰在666纳米；另一种为远红光吸 收型（Pfr)，最大吸收峰在730纳米，两者可以很快的相互转变。Pr为生理活跃型，在黑暗 中积累，所以黄化幼苗中有Pr无Pfr。在红光或白光照射下，大多数Pr转变为Pfr。Pfr可 发生降解和在暗中缓慢的逆转为Pr及参与反应。拟南芥中已有五个光敏色素（PHYA-PHYE) 被确定，PHYA促进种子萌发响应于非常低通量光和高辐照度远红光反应，而PHYB促进种子 萌发响应于低通量红光。因此PHYA仅经过长时间吸收表达，而PHYB在光起始种子萌发中 起主导作用。PHYB在种子萌发的起始阶段起重要的作用，部分是通过抑制光敏色素相互作 用因子I(PIFl)来实现的。而PIFl在一定程度上通过抑制GA途径和激活ABA途径来调控 种子萌发过程。然而，PHYB-PIF1介导的转录背后的机制在很大程度上仍然不清楚。
[0004] 拟南芥HDA15是一种组蛋白乙酰化修饰酶，它的作用是使染色质上的组蛋白发生 去乙酰化，使染色质编的更为致密，从而抑制相关基因的表达。已有研究表明HDA15可以与 PIF3相互作用，抑制在拟南芥黄花幼苗中叶绿素生物合成相关基因的表达。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供拟南芥组蛋白脱乙酰化酶基因HDA15在调控植物种子萌发 中的应用，所述的拟南芥组蛋白脱乙酰化酶基因HDA15,其核苷酸序列如SEQIDNO. 1的第 172-1830位所示。
[0006] 所述的应用优选在培育高萌发率转基因植物方面的应用。可以通过构建HDA15突 变体从而获得高萌发率的转基因植物。
[0007] 所述的应用优选在调控拟南芥种子萌发中的应用。
[0008] 本发明的hdal5-l突变体是HDA15的T-DNA插入突变体，pil5-l是 PIFl(PHY-INTERACTINGFACTOR1，又名PHYTOCHROMEINTERACTINGFACTOR3-LIKE5 即 PIL5)的突变体，phyB-9是PHY基因B失活突变体，hdal5pifl是基于hdal5-l和pil5-l 而得到的双突变体，hdal5phyB是基于hdal5-l和phyB-9而得到的双突变体，HDA15-GFP是 超表达HDA15和GFP的转基因株系，35S:HDA15-TAPs是超表达HDA15和TAP(MYC和HIS标 签蛋白）的株系，PIFI-GFPs是超表达PIFl和GFP的转基因株系，HDA15-GFPpifl是超表 达HDA15和GFP且PIFl突变的转基因株系。
[0009] 本发明利用HDA15基因超表达植株35S:HDA15-TAPs和T-DNA插入突变体hdal5 为对象，进行PHYB激活实验后，HDA15基因超表达植株种子萌芽率显著降低；进行PHYB失 活实验后，T-DNA插入突变体hdal5比野生型具有更高的萌芽率；表明HDA15负调控PHYB 调控光起始种子萌发过程。在PhyB突变体背景下失活HDA15可部分恢复phyB突变体的表 型，说明HDA15可能在PHYB调控光起始阶段种子萌发的遗传下游。利用构建的HDA15-GFP PiH株系验证HDA15抑制PHYB介导的种子萌发依赖于PIFl。进一步利用HDA15与PIFl 体内、体外互作实验表明，HDA15的N端1-146氨基酸区域是与PIFl相互作用区域；利用全 基因组转录组对HDA15-PIF1调控的基因进行分析并对相关基因进行表达验证，结果表明 HDA15-PIF1是光起始种子萌发转录网络的关键抑制因子。通过染色质免疫共沉淀实验进一 步验证HDA15作用于靶基因是依赖于PIFl结合到靶基因启动子区的G-box，并通过表达分 析证实了HDA15-PIF1是通过降低靶基因中的乙酰化水平来抑制其表达的。
[0010]HDA15-PIF1调控光依赖种子萌发途径：在远红光或者黑暗下，PHYB以Pr的形式定 位于细胞质中，此种情况下PIFl在细胞核中积累，PIFl与HDA15互作，招募HDA15到种子 萌发相关基因启动子的G-box上，使其H3乙酰化水平降低，降低其表达水平，从而抑制种子 的萌发；但是，在红光或者白光下，PHYB以Pfr的形式转移到细胞核中，使PIFl快速的发生 磷酸化并通过26S蛋白酶系统降解PIF1，进而HDA15-PIF1从目的基因上解离出来，从而起 始种子萌发。
[0011] 本发明的拟南芥组蛋白脱乙酰化酶基因HDA15编码的HDA15是RPD3/HDA1亚家族 的成员，其作为负调控因子参与了PHYB介导的光起始种子萌发过程。超表达HDA15基因后 抑制种子萌发，而HDA15的T-DNA插入突变体hdal5种子具有高萌发率，HDA15基因在调控 种子萌发过程中起重要作用。本发明揭示了HDA15调控PHYB依赖调控种子萌发的机制， 提供了HDA15在植物品种改良中的应用方向，对于培育高萌发率的转基因植物具有重要价 值。
【附图说明】
[0012] 图1是HDA15负调控PHYB介导光起始种子萌发过程。其中，A是PHYB激活（PHYB on，FR/R)和失活（PHYBoff，FR)种子萌发流程，WL为白光，FR/R为5分钟远红光后5分钟 红光，Dark为黑暗，FR为5分钟远红光；B是野生型（Col)、HDA15突变体hdal5-l和HDA15 超表达株系（35S:HDA15-TAP15和35S:HDA15-TAP19)在PHYB激活（FR/R)种子萌发条件 下的萌发情况；C是B中处理的种子萌发率统计，每个处理3个生物学重复；D是野生型和 hdal5-l突变体在PHYB失活状态不同强度远红光（FR)处理下的萌发率，每个处理3个生物 学重复。
[0013] 图2是HDA15与PHYB的遗传关系验证。其中，A是野生型（Col)、hdal5-l、phyB-9 和hdal5phyB在PHYB激活（FR/R)条件下的萌发率；B是在PHYB失活（FR)条件下的萌发 率，每个处理3个生物学重复。
[0014] 图3是HDA15与PIFl的遗传关系验证。其中，A是是野生型（Col)、pil5-l、 HDA15-GFP和HDA15-GFPpifl(即图中的HDA15-GFPpil5-l)在PHYB激活（FR/R)条件下 的萌发率；B是在PHYB失活（FR)条件下的萌发率，每个处理3个生物学重复。
[0015] 图4是HDA15与PIFl在体内和体外互作验证。其中，A是PIFl和HDA15蛋白结 构示意图；B是酵母双杂交验证HDA15与PIFl在体内互作；C是pull-down验证HDA15与 PIFl在体外互作；D是双分子荧光互补实验验证HDA15与PIFl在体内互作。
[0016] 图5是HDA15与PIFl共同调控的光起始种子萌发过程基因分析。其中，A是Venn 图显示HDA15-PIF1共同调节的基因数；B是聚类分析HDA15、PIF1和光调控基因，柱子颜色 表示倍数变化；C是Venn图显示HDA15-PIF1抑制调节和光共同被调节的基因数；D是DAVID 数据库功能聚类分析HDA15-PIF1共同调控基因。
[0017] 图6是HDA15-PIF1共同抑制的吸胀种子中植物激素和细胞过程相关基因分析。其 中，A是HDA15-PIF1共同抑制各种细胞过程、激素、环境和发育途径中已知代表基因；B是 qRT-PCR分析野生型（Col)、hdal5-l、pil5_l和hdal5pifl中PINs、XTHs和EXPs基因的表 达水平，PP2A作为内参，3个生物学重复。
[0018] 图7是PIFl-GFP转基因植株表型分析。其中，A是野生型（Col)、pil5_l(即图中 的pifI)、PIFl-GFP-I和PIF1-GFP-3在PHYB失活（FR)种子萌发条件下的表型；B是A中 处理的种子萌发率统计，每个处理3个生物学重复。
[0019] 图8是PIF1-HDA15共同作用的生长素运输和细胞松弛相关基因启动子。其中，A是 ChIP-qPCR分析PIFl作用于EXPs、XTHs和PINs基因启动子的G-box区域，PIFl-GFP-I株 系用于分析，anti-GFP抗体用于免疫共沉淀；B是ChIP-qPCR分析HDA15作用于EXPs、XTHs 和PINs基因启动子的G-box区域，HDA15-GFP和HDA15-GFPpifl(即图中的HDA15-GFP/ pil5-l)株系用于分析，anti-GFP抗体用于免疫共沉淀，3个生物学重复。
[0020] 图9是HDA15-PIF1降低目的基因的H3乙酰化水平结果。其中，A是qRT-PCR分 析在FR和R下野生型中AUX1、PINs、EXPs和XTHs基因的表达水平，PP2A作为内参；B是 ChIP-qPCR分析在FR和R下野生型中AUX1、EXPs和XTHs基因启动子（P)和外显子区（E) 的H3乙酰化水平，ACTIN2作为内参；C是ChIP-qPCR分析在FR下野生型（Col)、hdal5、 pil5-l(即图中的pifl)和hdal5pifl中AUX、EXPs和PINs基因启动子和外显子区的H3乙 酰化水平，ACTIN2作为内参；D是ChIP-qPCR分析在FR和R下EXP3、EXP9、XTH4和PINl启 动子区域的G-box的PIFl的丰度，野生型和PIFl-GFP株系用于分析，anti-GFP作为免疫 共沉淀的抗体，3个生物学重复。
[0021] 图10是HDA15-PIF1调控光依赖种子萌发途径示意图。
【具体实施方式】
[0022] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0023] 下列实例中未注