维生素b12在促进念珠藻降解多氯联苯中的应用及方法
【专利摘要】本发明提供了维生素B12在促进念珠藻降解多氯联苯中的应用，以及一种促进念珠藻降解多氯联苯的方法。本发明通过向脱氯功能蓝藻Nostoc?PD-2降解PCBs的反应体系中添加VB12的方法来促进其对多氯联苯的降解。本发明的有益效果主要体现在：将VB12添加到脱氯功能蓝藻——念珠藻属（Nostoc?sp.）PD-2降解多氯联苯（PCBs）的反应体系中，可有效提高珠藻属PD-2对多氯联苯的降解能力，对多氯联苯的脱氯作用效果显著、成本低、生态环保，为多氯联苯污染土壤的原位生物修复技术提供了技术基础。
【专利说明】维生素BI2在促进念珠藻降解多氯联苯中的应用及方法(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及维生素B12 (VB12)在促进念珠藻降解多氯联苯中的应用，以及一种促进念珠藻降解多氯联苯的方法。
(二)【背景技术】
[0002]多氯联苯(PCBs)是一类理化性质极为稳定的持久性有机氯代污染物，于20世纪中期广泛应用于绝缘油、润滑油、电容器等工业领域。虽然PCBs已被禁止使用与生产多年，但由于其难以被降解，广泛存在与土壤中。目前，在众多的工业发达国家已有不同程度高PCBs检出。其中，我国长江三角洲电子拆解业发达地区土壤中PCBs的检出浓度为10~1000ng/kg之间。同时，PCBs可以沿着食物链进行富集放大，在浙江省台州PCBs污染地区的水稻不同器官中均有PCBs的检出。同时，PCBs对生物体具有“三致”毒效应，对人类的健康存在严重的安全风险。1968年日本发生的米糠油事件中，10000多人患病，16人死亡。因此，研究高效降解多氯联苯的方法对PCBs污染土壤的原位生态修复成为目前的研究热点问题。
[0003]目前修复多氯联苯污染的方法有多种，常见的物理降解法有高温热分解法、零价铁法等；化学降解法有超零界水法、“脱氯分解”法等；微生物降解法中常采用分枝杆菌(Mycobacterium sp.)、曲霉属(Aspergillus fumigators)、铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)等。相比于物理化学法,微生物方法具有无二次污染,操作简便、经济的优势。其中申请号:200810041050.9提供了一种表皮葡萄球菌对多氯联苯的降解方法。该方法采用从污水厂活性污泥中筛选出来的葡萄球菌，将其接种于含有多氯联苯的培养基，28~32°C摇床培养24~120h，其降解 效率为62.4%。同时，该方法通过添加碳源的方法提升多氯联苯的降解效率。
(三)
【发明内容】
[0004]本发明目的是提供维生素B12在促进念珠藻降解多氯联苯中的应用，以及一种促进念珠藻降解多氯联苯的方法。
[0005]维生素B12在促进念珠藻降解多氯联苯中的应用。优选的，所述念珠藻为念珠藻属(Nostoc sp.) CCTCC No:M2013397，分类命名为念珠藻属(Nostoc sp.)TO_2，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期:2013年9月8日，已作为新菌株提交了专利申请。此藻种属于蓝藻门念珠藻目，念珠藻属(Nostocsp.)，藻体为多细胞丝状体，有藻丝，具胶鞘，能固定无机氮。
[0006]一种促进念珠藻降解多氯联苯的方法，所述方法为:在念珠藻属(Nostoc sp.)CCTCC No:M2013397降解多氯联苯的反应体系中，加入100~2000 μ g/L的维生素B12以促进多氯联苯的降解。所述反应体系为适宜念珠藻属生长的溶液体系，例如无氯BGll培养基体系，在多氯联苯含量2mg/L时，念珠藻属(Nostoc sp.) Η)_2在pH6.9~7.1、25±2°C、1500~2000Iux光照强度(光暗比为12h:12h)条件下培养7天，与不添加VB12相比，其降解率可提闻10%以上。
[0007]无氯BGll培养基组成如下:硝酸钠1.5g/L，MgSO4.7H200.075g/L,乙二胺四乙酸二钠 0.001g/L, K2HPO4.3Η200.04g/L,碳酸钠 0.02g/L,柠檬酸 0.006g/L,柠檬酸铁铵
0.006g/L, A5溶液lmL/L，溶剂为水；
[0008]A5 溶液组成为:硼酸 2.86g/L，氯化锰 1.81g/L，ZnSO4.7Η200.222g/L，CuSO4.5H200.079g/L, NaMoO4.2H200.39g/L, Co (NH3) 2.6H200.39g/L，溶剂为水。
[0009]优选的，所述降解在pH6.9?7.1、25±2°C、1500?2000lux光照强度(光暗比为12h:12h)下进行，降解时间优选为7d以上。
[0010]本发明是通过添加一种辅酶VB12来促进固氮念珠藻Nostoc PD-2降解多氯联苯。VB12是广泛存在于肝脏中的抗恶性贫血因子，目前主要运用于医学领域。本发明对脱氯功能藻种Nostoc PD-2降解多氯联苯起到明显的促进效应，可推广应用于土壤环境的原位生物修复领域。
[0011]本发明的有益效果主要体现在:将VB12添加到脱氯功能蓝藻——念珠藻属(Nostoc sp.)PD-2降解多氯联苯(PCBs)的反应体系中，可有效提高珠藻属Η)_2对多氯联苯的降解能力，对多氯联苯的脱氯作用效果显著、成本低、生态环保，为多氯联苯污染土壤的原位生物修复技术提供了技术基础。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为不同DTT浓度下培养7天后的PBs降解率比较；
[0013]图2为不同DTT浓度和培养时间下的PBs降解率比较。
(五)【具体实施方式】
[0014]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0015]实施例1:脱氯功能藻样Nostoc PD-2 (B卩CCTCC No:Μ2013397)对PCB28的降解分析
[0016]将Nostoc sp.PD-2(即 CCTCC No:M2013397)藻种在 25°C，1500 ?20001ux 光照(光暗比12h:12h)下置于锥形瓶中用BGll无机盐培养基培养至对数生长期(680nm条件下，藻液吸光度约为0.38)，另取洁净锥形瓶每瓶加入20mL前述藻液，每个锥形瓶中加入溶解于甲醇的PCB28工作液的初始浓度为100mg/L，加入400 μ L，使PCB28在体系中的浓度为2mg/L，在25±2°C，1500?20001ux光照强度，光暗比为12h:12h的光照培养箱中培养7天。
[0017]将培养过后的藻液4000转/分离心10分钟，抽滤，提取该反应体系上清液。采用硫氰酸汞高铁分光光度法测定吸光度:绘制氯化钾标准曲线；取抽滤得到的上清液5.0mL于洁净比色管中，加去离子水至10.0mL，由绘制的标准曲线计算得到暴露体系中的氯离子含量，进而分析脱氯功能藻种Nostoc PD-2的脱氯效果。
[0018]分析发现7天脱氯功能藻样ro-2对PCB28的降解百分率为64.7%，见图1。
[0019]实施例2:不同浓度VB12对功能藻种Nostoc PD-2降解效果的动力学实验
[0020](I)将 Nostoc sp.PD-2 (即 CCTCC No:M2013397)藻种在 25。。，1500 ?20001ux 光照(光暗比12h:12h)下置于锥形瓶中用BGll无机盐培养基培养至对数生长期(680nm条件下，藻液吸光度约为0.38)，另取洁净锥形瓶每瓶加入20mL前述藻液，每个锥形瓶中加入溶解于甲醇的PCB28工作液的初始浓度为100mg/L，加入400μ L，使PCB28在体系中的浓度为2mg/L ;分别向降解反应体系中添加10、100 μ g.L-1的VB12 ；
[0021](2)将降解反应体系置于25±2°C，1500~20001ux光照强度，光暗比为12h:12h的光照培养箱中分别培养0、0.5、1、1.5、3、4.5、6、7.5、9天；
[0022](3)提取反应体系上清液，采用硫氰酸汞高铁分光光度法测定吸光度，由吸光度计算得到体系中氯离子含量。结果分析发现添加浓度为?οομ g.L—1的VB12的体系中脱氯百分比明显高于所加VB12浓度为10 μ g.I/1的降解体系，9天后添加100 μ g.L-1VB12的体系中脱氯百分比为83.8%，见图2。
[0023]实施例3:不同浓度梯度下VB12对脱氯功能藻种Nostoc PD-2降解PCB28的影响
[0024](I)将 Nostoc sp.PD-2 (即 CCTCC No:M2013397)藻种在 25。。，1500 ~20001ux 光照(光暗比12h:12h)下置于锥形瓶中用BGll无机盐培养基培养至对数生长期，另取洁净锥形瓶每瓶加入20mL前述藻液，每个锥形瓶中加入溶解于甲醇的PCB28工作液的初始浓度为100mg/L，加入400yL，使PCB28在体系中的浓度为2mg/L ;分别向该降解反应体系中添加10、100、1000μ g.Ι^3个浓度的VB12。在25±2°C，1500~2000Iux光照强度，光暗比为12h:12h的恒温培养箱中培养7天；
[0025](2)将培养过后的藻液4000转/分离心10分钟，抽滤，提取该反应体系上清液，采用硫氰酸汞高铁分光光度法测定吸光度；
[0026](3)由其吸光度计算得到氯离子含量，检测添加不同浓度的VB12条件下脱氯功能藻样Η)-2对PCB28的降解效果，分析发现7天后添加1000 μ g -L-1的VB12体系中脱氯功能藻样ro-2对PCB28的降解百分率为79.6%，参见图1。
【权利要求】
1.维生素B12在促进念珠藻降解多氯联苯中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述念珠藻为念珠藻属(Nostocsp.) CCTCCNo:M2013397o
3.一种促进念珠藻降解多氯联苯的方法，其特征在于:在念珠藻属(Nostoc sp.)CCTCCNo:M2013397降解多氯联苯的反应体系中，加入100?2000 μ g/L的维生素B12以促进多氯联苯的降解。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述降解在pH6.9?7.1、25±2°C、1500?20001uX光照强度下进行。
【文档编号】C12N1/12GK104028552SQ201410125778
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年3月31日 优先权日:2013年12月28日
【发明者】张杭君, 鲁莉萍, 肖文丰, 蒋晓军 申请人:杭州师范大学