专利名称：检测维生素c二步发酵中细胞内代谢物变化的方法
技术领域：
本发明属于工业微生物领域，涉及一种检测维生素C 二步发酵中细胞内代谢物的变化的方法。
背景技术：
细胞内小分子代谢物是细胞代谢的重要组成部分，中糖类物质是重要的能源物质，脂肪酸则主要用于细胞的能量储备和构成细胞膜，氨基酸是构成蛋白质的基础结构，核苷酸类物质除了构成DNA和RNA之外也参与细胞的信号转导和能量转化过程。随着质谱技术的发展，细胞内小分子代谢物，包括有机酸，氨基酸，醇类化合物，胺类化合物，芳香族化合物及糖类等可以被高通量的检测。由于这种高通量的特点，可以从整体水平上检测细胞在发酵过程中产生的包含上述各类物质的整体代谢水平上的变化。维生素C的二步发酵是由巨大芽孢杆菌和酮古龙酸杆菌共同作用完成发酵的，其内在调控机理尚不明确，这就使优化工业生产过程变得困难，也增加了生产中控制发酵过程的难度，如果通过高通量的代谢物组学的手段了解混菌发酵过程中的物质迁移规律，将有利于揭示两种菌在发酵过程中的相互关系，从而有利于弥补现有过程中的上述不足。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种检测维生素C 二步发酵中细胞内代谢物变化的方法。本发明的技术方案概述如下一种检测维生素C 二步发酵中细胞内代谢物变化的方法，包括下述步骤(1)对维生素C 二步发酵中所用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(GluconcAacter oxydans)细胞内的小分子代谢物进行测定①细胞收集及淬灭将所述巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌进行发酵，在发酵过程中选3-5个时间点， 所述时间点位于所述发酵过程的前期、中期和后期，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨细胞以除去样品中大量的水分，并破碎细胞，获得3-5份破碎细胞；②提取细胞内小分子代谢物取步骤①获得的3-5份破碎细胞20_100mg分别置于离心管中，加入 0. 5-2. 0ml-40°C保存的体积浓度为50 %的甲醇水溶液为提取液，并加入10 μ 1_20 μ 1的 0. 07-0. 14mg/ml氘标记的丁二酸的水溶液为内标物，混勻；置于液氮中反复冻融2_4次，每次冻0. 5-3. Omin ；离心收集上清得到A液；再次加入体积浓度为50%的甲醇水溶液为提取液0. 5-2. 0ml，混合均勻，离心收集上清，得到B液，将所述A液和B液混勻，并冷冻干燥；③衍生化向步骤②获得的冻干的样品中加入40-60 μ 1的20mg/ml甲氧基胺盐酸盐吡啶溶
3液，30-40°C水浴，进行肟化反应60-100min ；再加入50-100 μ 1的N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，35-40°C水浴，进行硅烷化反应30-80min ；④用气相色谱-飞行时间质谱联用仪测定步骤③获得样品成分及相对含量将1μ 1步骤③获得样品进到气相色谱中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30mX0.25mm i. d.，进样口温度250°C _280°C，载气为高纯氦气，柱温箱升温程序为初始 50°C -80°C保持 anin-5min，以 4°C /min_8°C /min 的速度升到 260°C -300°C，保持;3min-8min，使用EI电离源，源温230°C _260°C，检测器电压2300V-2700V，电离电压 60eV-80eV,电流30 μ Α-50 μ A ；质谱检测范围50_800m/z ；小分子代谢物的鉴定使用NIST 数据库，质谱数据的处理和小分子代谢物相对含量的测定使用Masslynx 4. 1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到维生素C 二步发酵过程中细胞内各个小分子代谢物的相对含量；(2)主成分分析①将步骤⑴获得的各个小分子代谢物的相对含量的数据进行标准化；②用Markerlynx软件对步骤O)中步骤①获得的标准化后的数据进行主成分分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图和载荷图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，用来比较生产过程中各个阶段内细胞内小分子代谢物的相似和差异；在载荷图中，每个点表示各个小分子代谢物，距离中心点距离越远的小分子代谢物，其在维生素C发酵生产过程中的差异就越大，可作为重要的候选代谢物进行分析；⑶过程分析将步骤( 得到的候选代谢物中对细胞生理状态具有重要意义物质的含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些物质变化的规律，进而发现其在维生素二步发酵过程中的作用，即对发酵过程改进的提示性意义。利用本发明的方法可以快速地、准确地将维生素C 二步发酵过程中的重要的代谢物检测出来，这些代谢物含量的变化规律为了解发酵过程的内在机理提供依据，对发酵过程的改进具有提示性意义。从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量，降低环境污染提供理论基础。同时也为其他混菌发酵过程的优化提供新的思路和方法。
图1，图1-1为维生素C二步发酵中不同时期的细胞内胞内小分子代谢物的主成分分析结果，图1-2为维生素C 二步发酵过程的主成分分析载荷图。图2为维生素二步发酵过程中与细胞生理状态密切相关的氨基酸的变化图。图3为维生素二步发酵过程中与巨大芽孢杆菌生理状态密切相关的吡啶二羧酸的变化图。图4为维生素二步发酵过程中与吡啶二羧酸变化相似的氨基酸的变化图。图5为维生素二步发酵过程中与细胞内主要核酸类物质变化图。图6为维生素二步发酵过程中与吡啶二羧酸变化相似的核酸类物质降解产物的变化图。
具体实施例方式下面的实施例可以使本领域的技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明实施例1一种检测维生素C 二步发酵中细胞内代谢物变化的方法，包括下述步骤(1)对维生素C发酵过程中巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC No 1. 459和氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC No 1. 110细胞内的小分子代谢物进行测定①细胞收集及淬灭将所述巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌进行发酵，在发酵过程中选5个时间点，所述时间点位于所述发酵过程的前期、中期和后期，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨细胞以除去样品中大量的水分，并破碎细胞，获得5份破碎细胞；②提取细胞内小分子代谢物取步骤①获得的5份破碎细胞50mg分别置于离心管中，加入1.0ml-40°C保存的体积浓度为50%的甲醇水溶液为提取液，并加入20 μ 1的0. 07mg/ml氘标记的丁二酸的水溶液为内标物，混勻；置于液氮中反复冻融3次，每次冻2. Omin ；离心收集上清得到A液；再次加入体积浓度为50%的甲醇水溶液为提取液1. Oml，混合均勻，离心收集上清，得到B液，将所述A液和B液混勻，并冷冻干燥；③衍生化向步骤②获得的冻干的样品中加入50 μ 1的20mg/ml甲氧基胺盐酸盐吡啶溶液， 31°C水浴，进行肟化反应90min ；再加入80 μ 1的N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，37°C 水浴，进行硅烷化反应30min ；④用气相色谱-飞行时间质谱联用仪测定步骤③获得样品成分及相对含量将1 μ 1步骤③获得样品进到气相色谱中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为 30mX0. 25mm i. d.，进样口温度280°C，载气为高纯氦气，柱温箱升温程序为初始70°C保持2min，以5°C /min的速度升到290°C，保持6min，使用EI电离源，源温250°C，检测器电压M00V，电离电压70eV，电流40 μ A ；质谱检测范围50-800m/z ；小分子代谢物的鉴定使用 NIST数据库，质谱数据的处理和小分子代谢物相对含量的测定使用Masslynx 4. 1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到维生素C 二步发酵过程中细胞内各个小分子代谢物的相对含量；(2)主成分分析①将步骤(1)获得的各个小分子代谢物的相对含量的数据进行标准化；②用Markerlynx软件对步骤O)中步骤①获得的标准化后的数据进行主成分分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图和载荷图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，用来比较生产过程中各个阶段内细胞内小分子代谢物的相似和差异；在载荷图中，每个点表示各个小分子代谢物，距离中心点距离越远的小分子代谢物，其在维生素C发酵生产过程中的差异就越大，可作为重要的候选代谢物进行分析。(3)过程分析从图1-1 (维生素C 二步发酵中不同时期的细胞内胞内小分子代谢物的主成分分析)结果中可以得到维生素C二步发酵中的不同阶段发酵样品有较大差异，且在发酵进行到18小时时所得的样品里其他样品差异最为明显，这说明发酵过程的差异主要发生在发酵中期(芽孢产生前后)，而且通过产酸曲线可以发现18小时以后，产物2酮古龙酸大量积累，说明18小时的细胞生理状态严重影响产酸的时间。可以通过调节发酵的工艺过程和参数来缩短过程中产酸时间。从图1_2(维生素C 二步发酵过程的主成分分析载荷图)区分个时段的代谢物主要是一些氨基酸类和核酸类物质，及少量糖类和有机酸类物质，包括，丙氨酸，缬氨酸，4氨基丁酸，5-酮脯氨酸，等氨基酸，腺嘌呤，鸟嘌呤等核酸类物质及其衍生物， 还有吡啶二羧酸，核糖木酮糖等。从图2中可见，绝大多数氨基酸(半胱氨酸，缬氨酸和赖氨酸)的含量在发酵过程中的不同阶段的细胞内差别明显，其主要在11小时时达到较高水平，并维持到18小时，自 18小时以后含量开始大幅度降低。图5中可见，构成DNA的主要核酸物质鸟嘌呤，腺嘌呤， 胸腺嘧啶，胞嘧啶等与图2中各种氨基酸变化趋势一致。通过该结果可知由于巨大芽孢杆菌的生长上述物质开始在细胞内富集，在11-18小时阶段巨大芽孢杆菌生长分裂迅速是上述物质保持高浓度的原因。从图3中可见，我们发现吡啶二羧酸(DPA)的含量在18小时达到极值，由于已知吡啶二羧酸是芽孢杆菌产生芽孢过程中必要的代谢物，且该代谢物只在芽孢产生过程中出现，说明18小时时巨大芽孢杆菌的产孢过程已经开始。而后在18小时后吡啶二羧酸的含量的大幅下降则是因为芽孢形成后吡啶二羧酸与钙离子结合形成聚合的不溶的吡啶二羧酸钙，从而导致游离的吡啶二羧酸含量降低。从图4中，有4种代谢物(谷氨酸，4氨基丁酸，鸟氨酸，5酮脯氨酸)与吡啶二羧酸的含量变化规律一致，说明这些物质在芽孢杆菌产孢过程中被大量积累在细胞内，考虑到其共同组成的谷氨酰循环可以推测在芽孢杆菌产生芽孢的过程中细胞内在进行着氨基酸的转移，其方向很可能是将氨基酸转移到氧化葡萄糖杆菌中。图6中的核酸类衍生物(黄嘌呤，尿酸，尿嘧啶)属于核酸补救或者核酸降解过程中的代谢物，其含量的峰值同样出现在 18小时，说明在芽孢产生的过程中，伴随有核酸类物质的降解过程，而这些未完全降解的核酸类物质同样有机会成为氧化葡糖酸杆菌生长的必要中间代谢物，促进其生长。综上所述，结合细胞生长和产物积累曲线图可知，以吡啶二羧酸激增为标志的巨大芽孢杆菌的产孢过程在这个发酵过程中起到至关重要的作用，这一过程中细胞内众多代谢物的含量发生了明显的变化，说明两种细胞的生理状态发生了重大的变化，而正是这一变化导致了氧化葡萄糖杆菌的加速生长从而达到积累产物的目的。故而本发明的发现为今后调控发酵过程缩短发酵时间提高产量提供了可能的靶点，和大量的代谢物水平的理论基石出。表1实施例1中测得的细胞内的代谢物的种类
权利要求
1. 一种检测维生素C 二步发酵中细胞内代谢物变化的方法，包括下述步骤(1)对维生素C二步发酵中所用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(GluconcAacter oxydans)细胞内的小分子代谢物进行测定①细胞收集及淬灭将所述巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌进行发酵，在发酵过程中选3-5个时间点，所述时间点位于所述发酵过程的前期、中期和后期，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心， 收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨细胞以除去样品中大量的水分，并破碎细胞，获得3-5份破碎细胞；②提取细胞内小分子代谢物取步骤①获得的3-5份破碎细胞20-100mg分别置于离心管中，加入0. 5-2. 0ml-40°C保存的体积浓度为50%的甲醇水溶液为提取液，并加入10 μ 1-20 μ 1的0. 07-0. 14mg/ml氘标记的丁二酸的水溶液为内标物，混勻；置于液氮中反复冻融2-4次，每次冻0. 5-3. Omin ；离心收集上清得到A液；再次加入体积浓度为50 %的甲醇水溶液为提取液0. 5-2. Oml，混合均勻，离心收集上清，得到B液，将所述A液和B液混勻，并冷冻干燥；③衍生化向步骤②获得的冻干的样品中加入40-60 μ 1的20mg/ml甲氧基胺盐酸盐吡啶溶液， 30-40°C水浴，进行肟化反应60-100min ；再加入50-100 μ 1的N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，35-40°C水浴，进行硅烷化反应30-80min ；④用气相色谱-飞行时间质谱联用仪测定步骤③获得样品成分及相对含量将Iyl步骤③获得样品进到气相色谱中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30mX0. 25mm i. d.，进样口温度250°C _280°C，载气为高纯氦气，柱温箱升温程序为 初始 50 "C -80 "C 保持 anin-5min，以 4 °C /min-8 "C /min 的速度升到 260 "C -300 "C，保持;3min-8min，使用EI电离源，源温230°C _260°C，检测器电压2300V-2700V，电离电压 60eV-80eV,电流30 μ Α-50 μ A ；质谱检测范围50_800m/z ；小分子代谢物的鉴定使用NIST 数据库，质谱数据的处理和小分子代谢物相对含量的测定使用Masslynx 4. 1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到维生素C 二步发酵过程中细胞内各个小分子代谢物的相对含量；(2)主成分分析①将步骤(1)获得的各个小分子代谢物的相对含量的数据进行标准化；②用Markerlynx软件对步骤( 中步骤①获得的标准化后的数据进行主成分分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图和载荷图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，用来比较生产过程中各个阶段内细胞内小分子代谢物的相似和差异；在载荷图中，每个点表示各个小分子代谢物，距离中心点距离越远的小分子代谢物，其在维生素C发酵生产过程中的差异就越大，可作为重要的候选代谢物进行分析；(3)过程分析将步骤( 得到的候选代谢物中对细胞生理状态具有重要意义物质的含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些物质变化的规律，进而发现其在维生素二步发酵过程中的作用。
全文摘要
本发明公开了一种检测维生素C二步发酵中细胞内代谢物变化的方法，包括下述步骤(1)对维生素C二步发酵中所用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)细胞内的小分子代谢物进行测定；(2)主成分分析；(3)过程分析；利用本发明的方法可以快速地、准确地将维生素C二步发酵过程中的重要的代谢物检测出来，这些代谢物含量的变化规律为了解发酵过程的内在机理提供依据，对发酵过程的改进具有提示性意义。从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量，降低环境污染提供理论基础。同时也为其他混菌发酵过程的优化提供新的思路和方法。
文档编号C12R1/11GK102174634SQ20111006506
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者元英进, 周剑, 孙君伟, 崔永涛 申请人:天津大学, 河北维尔康制药有限公司