专利名称：猪视黄醇结合蛋白基因(rbp4)真核表达载体的构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种真核表达载体的构建，具体的说是构建了猪视黄醇结合蛋白基因
的真核表达载体。
背景技术：
视黄醇结合蛋白(retinol bindingprotein， RBP)是体内将维生素A从肝中转运 至靶组织的特异的运载蛋白。自从1968年Knnai等人首次发现步并分离出视黄醇结合蛋 白后，RBP的临床应用就受到广泛的关注。它是研究维生素A代谢机制的关键蛋白质分子， 也是研究疏水小分子结合蛋白结构的模型分子。由于RBP半哀期短，生物特异性高，血浆中 RBP含量与多种疾病相关。维生素A的摄入不足以及由肝病，肾病，多器官功能衰竭或一些 应激状态引起的复杂生理和病理变化，都会引起血浆RBP和视黄醇水平的变化。所以在临 床应用上RBP就成为评价营养不良、甲状腺功能亢进、维生素A缺乏、肝脏疾病和肾功能障 碍的辅助指标。为了得到RBP，目前有两种方法，一种是从血浆中分离纯化，但需样品量大， 步骤繁琐，成本昂贵；另一种方法是利用基因工程的方法。其中的酵母基因工程方法具有如 下优点1)属于真核生物，大多具有较高的安全性。2)繁殖速度快，能高密度培养，大规模 生产，降低基因工程产品成本的潜力。3)采用高表达的启动子，高效表达目的基因，可诱导 调控。4)作为真核生物，提供了翻译后加工和分泌的环境，使得产物与天然蛋白一样或类 似。5)酵母菌可在分泌过程中对表达的蛋白进行糖基化修饰。6)不会形成不溶性的重组 蛋白包涵体，易于分离提纯。7)能移去起始甲硫氨酸。 猪不仅是我们日常生活中所消费的红肉的主要来源，更是一种模式动物，可为人
类疾病治疗以及新药开发等提供试验素材。通过构建猪的视黄醇结合蛋白基因的真核表达 载体，可以为下一步诱导表达、蛋白纯化以及蛋白功能研究奠定基础。
发明内容
鉴于上述存在的问题，本发明的目的是利用已有的毕赤酵母真核表达载体，通过
基因工程的方法，构建猪的视黄醇结合蛋白基因的真核表达载体。 为了实现上述目的，本发明的技术方案是 首先，对毕赤酵母的转录系统进行了研究。Pichia. pastoris作为一种转录系统对 外源基因具有一些结构上的限制。第一，在目的蛋白中不能含有PEST(Pro-Glu-Ser-Thr) 这样的序列，因为这一序列是钙离子激活的蛋白水解酶的作用底物。第二，在目的蛋白中不 能含有XFXRQ (X-Phe-X-Arg-Gin)和QRXFX (Gln-Arg-X-Phe-X)这样的序列(其中X为任何 氨基酸)，因为这一序列极易受到溶酶体的切割。为得到分泌型转录产物，我们选择含a因 子信号肽序列的pPICZaC作为转录载体。这要求目的蛋白不能含有a因子信号肽酶切割 序列Glu-Lys-Arg*Glu-Ala*Glu-Ala。氨基酸序列分析证实RBP4中不存在这样的结构。 在结构上符合Pichia. pastori系统的要求。 其次，对RBP4基因的自身的序列情况进行分析。RBP4基因全长606bp， l_54bp编码信号肽，55-603bp编码成熟肽，终止密码子是TAG,后跟248bp的3' UTR。本试验在去掉
信号肽后剩下的CDS区设计了一对引物，用重组PCR法扩增出目的基因，使其两端分别带上
Cla I和Xba I的酶切位点，电泳图上显示出一条单一明亮的DNA条带。 再次，目的基因和载体双酶切后用T4DNA连接酶连接，重组质粒转化入大肠杆菌
JM109。在LB-Amp+平板上生长。 最后，分别采用了 PCR法，双酶切法和测序法三种方法进行筛选和鉴定阳性菌落。首先，用自行设计的引物进行PCR扩增快速筛选阳性菌落，经琼脂糖凝胶电泳检测，菌落能扩增出与目的基因大小相符的基因片段，再用质粒pPICZaC上的特征引物(5' AOX引物和3' A0X引物)进行PCR扩增，结果获得的片段大小与预计的相符，大小基本等于载体上AOX基因的大小+插入的外源基因大小。其次，用Cla I和XbaI对从阳性菌落中提取的质粒进行双酶切，得到了两个片段， 一个是3kb左右的载体和一个600bp左右的外源基因片段。最后，测序结果也显示重组质粒序列与GenBank中目的片段的序列是一致的。以上这些实验结果联合证明了目的基因已插入pPICZ a C载体，重组质粒构建成功。
图1为表达载体构建流程图。 图2为RT-PCR扩增RBP4基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。图中第1，2泳道为PCR产物；C为阴性对照；M为DL2000Marker
图3为PMD18-T-RBP4双酶切鉴定结果。 图4pPICZa C-RBP4的PCR检测结果。图中M为DL2000 ;第1泳道为P3、 P4引物扩增结果；第2泳道为P1、P2引物扩增结果
图5pPICZ a C-RBP4的双酶切鉴定结果。
具体实施例方式
—、实验材料 1.实验动物 大白猪1头，屠宰后取肝脏组织，立即放于液氮中保存。 2.菌株 大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a购自北京鼎国生物技术有限责任公司。 T0P10F'菌株购自Invitrogen公司。 3.分子克隆主要相关试剂 (l)BamHI、 EcoRI、 HindiII等限制性内切酶、rTaq酶、dNTP、 DL2000Marker、
pMD-18T载体连接试剂盒，均购自大连宝生物工程有限公司。 (2) EasySelect 毕赤酵母表达试剂盒购自Invitrogen公司。 (2)酵母基因组提取试剂盒、山梨糖醇购自上海华舜生物工程有限公司。 (3)细菌培养用胰蛋白胨利酵母提取物均购自Oxid公司。 (4)琼脂糖、溴化乙锭、Tris等购自Sigma公司。 (5)其他试剂均为分析纯的国产生化试剂。 (6)E卯endorf管和移液器枪尖等塑料耗材均购自哈尔滨伊事达生物技术有限公司。 二、实验方法
( — ) RNA的提取 1.研磨组织样取100mg组织样于装有液氮的研钵中，充分研磨，研磨后加入装有lml Trizol的EP管中，充分振荡。 2.分相15-3(TC温育2-5min以完全解离核蛋白复合体，2-8 °C 12000rpm离心10min，上清移至新EP管，加0. 2ml氯仿用力摇动15sec， 15_30°C放置2_3min， 12000rpm2-8。C离心15min。 3. RNA沉淀移水相于 一 新EP管，加0. 8ml异丙醇混匀，室温放置10_15min，2-8°C 12000rpm离心lOmin。4.洗涤RNA沉淀弃上清，加lml 75%乙醇洗涤RNA， 2-8°C 7500rpm离心5min。
5.RNA重溶弃乙醇，离心机甩下液滴并小心吸弃液滴，空气中干燥或真空干燥5-10min，加适量0. 1% DEPC处理水溶解总RNA。
(二)引物的设计与合成
1.克隆用引物 根据GenBank上已发表的猪的视黄醇结合蛋白(RBP4)的mRNA序列(GenBank登录号M68860)，用DNAMAN和Primer5. 0软件在其完整的阅读框架内，去掉信号肽后的核苷酸序列上自行设计了 1对上、下游引物，同时在上游引入Cla I酶切位点，下游引入XbaI酶切位点
上游引物(Pl)30bp :5'
GAAGCATCG GAGCGCGACTGCCGAGTGAGC—3'
下游引物(P2) 34bp : 5'打TTCTAGAAl CTACAAAATGTTTCTTTCCGATTTG-3'
注引物中加框的碱基为引入的酶切位点序列2.鉴定重组菌用引物
上游引物(P3)21bp :5—-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3—下游引物(P4)27bp :5—-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3—(三)RNA反转录成cDNA1.反转录反应体系
2XBca 1st Buffer 10. 0 ii 1
25,1/L MgS04 4. Oil 1
d證Mixture 1. Oil 1
RNAse Inhibitor (40U/ul) 0. 5 ii 1
BcaBEST Polymerase (22U/ ii 1) 1. 0 ii 1Oligo dT Primer 1. Oil 1
RNA Sample 1. Oil g
RNAse Free dH90 1. 5ii 1
Total
2.反转录反应条件
65 °C lmin
20. Oil 1
4
30°C 5minI15-30min内匀速升温65 °C 25min
98 °C 5min
5°C 5min
(四)RBP4基因成熟肽的cDNA序列克隆和测序1. PCR反应体系10XPCR Bufferd證Mixturer-Taq(5U/ii 1)Forward Primer(1Opmo1 /Reverse Primer(1Opmo1,RT—Products
y 1)y 1)
Water
2. 5ii 12. Oil 1
0. 2ii 1
1. Oil 11. Oil 11. Oil 117. 3ii 1
25. Oil 1
7min
30sec
30sec
50sec
lOmin
to 2 25循环
Total
2. 反应条件预变性94°C
变性94°C退火58°C延伸72°C孵育72°C
4°C
3. PCR扩增产物的电泳检测及鉴定
反应结束后，取PCR产物5 ill上样于1 %琼脂糖凝胶，同时在一点样孔中加3. 0 illDNA DL2000Maker作对照，电泳20 30min，在计算机凝胶成像系统上观察，如果PCR产物无其它杂带，且扩增片段大小与设计相符，就可以用于回收、测序。
4. PCR扩增片段的纯化 (1)将含目的片段条带的琼脂糖块割下，放入1. 5ml的离心管中。 (2)按每lOOmg琼脂糖加入300-600 y 1的比例加入SI液，置55。C水浴10min，使
琼脂糖块完全溶化，每2min颠倒混匀一次。 (3)加入1/3S1体积的异丙醇，混匀，55"温育lmin。 (4)将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，离心lmin。倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。 (5)在吸附柱中加入450iU Wl液，静置lmin后，离心15sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
(6)在吸附柱中加入450 ill Wl液，离心15sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱
放入同一个收集管。 (7)离心lmin。 (8)将吸附柱放入一个干净的1. 5ml的离心管中，在吸附柱的中央加30 Tl液，静置lmin后，离心lmin。将1. 5离心管中的DNA贮存于-20。C中。
5.PCR回收产物与T载体连接反应
:0097] 连接体系如下
:0098] pMD 18-T Vector (50ng/ul) 0. 5ul
:0099] DNA 20_40ng
:0100] Solution 1 5ul
:0101] 加去离子水至 10ul 将上述反应液在16t:反应30min或14。C过夜。 6.感受态细胞的制备(CaCl2法) (1)挑取DH5 a大肠杆菌原种，在LB琼脂板上划线培养。 (2)挑取新鲜的单菌落，接种到3ml LB培养基中，37。C培养过夜。 (3)取lml培养好的菌液，接种到100ml LB培养基中，37。C 300rpm强烈振荡培养
2h，使细胞浓度达到5X 107个细胞/ml，此时，细菌的0D6。。 一般在0. 5 0. 6之间，为对数
生长期。 (4)将培养物在冰上放置10min，转移到2个50ml预冷的离心管中，4000rpm4t:离
心5min。去上清，倒置离心管，使残液流尽，回收细菌沉淀。 (5)加入20ml冰预冷的0. 1M CaCl2悬浮细菌沉淀，然后冰浴30min。 (6)4000rpm，4t:离心10min，去上清，倒置离心管，回收细菌沉淀。 (7)加入4ml 0. lmol/L CaCl2溶液重悬细菌沉淀，这时的细胞可直接用于转化实验。 (8)加甘油至终浓度为15% 20%，混匀，分装成200111/份，冻存于-801:。 7.转化入大肠杆菌感受态细胞内 (1)从-7(TC冰箱中取出一管感受态细胞(200iU感受态细胞)，在冰上放置10min助溶。 (2)将lOiU连接产物加到感受态细胞中，轻轻旋转以混匀内容物，在冰上放置30min。 (3)将管放到预加温到42t:的水浴锅中，热激90sec。 (4)快速将离心管转移到冰浴中，冷却1 2min。 (5)加入400iULB培养基，37t:温和振荡(100 150rpm)培养45min，使细菌复苏。 (6)取lOOiil菌液铺于含AMP(100iil/ml)培养基上，37"倒置培养12 16h。 8.阳性菌落的鉴定与培养 (1)用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取单菌落。 (2)以单菌落作为模板，加入PCR反应液(不含模板)中，用获得该片段的PCR条
件进行扩增。
(3)琼脂糖凝胶电泳检测，鉴别T载体上是否含有目的片段。 (4)若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40mlLB液体培养基中，培养基中预先加入O. 1% (V/V)的Amp(100mg/ml)，37t:过夜振荡培养，用于质粒回收。 9.质粒DNA的小规模提取 (1)接种一单菌落于3ml含50ug/ml Amp的LB液体培养基中，以37°C 220rpm培养过夜。 (2)取1. 5ml菌液于离心管中，4， OOOrpm离心5min，弃去上清液，收集菌体。
(3)在细菌沉淀中加入250 ill PI液，震荡至彻底悬浮。 (4)加入250 1 P2液，立即温和颠倒离心管5_10次以混匀管中液体，室温静止4min。 (5)加入350 ii 1 P3液，立即温和颠倒离心管5_10次以混匀管中液体。 (6) 12， OOOrpm离心10min，将上清液小心移入吸附柱，离心15sec。倒掉收集管中
的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 (7)向吸附柱中加入500iU Bl液，离心15sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 (8)向吸附柱中加入500iU Wl液，离心15sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 (9)向吸附柱中加入500ii1 Wl液，静止lmin后，离心15sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，再离心lmin。 (10)将吸附柱放入一个干净的1. 5ml离心管中，在吸附膜中央加入50iU Tl液，
室温静止lmin，离心lmin。将1. 5ml离心管(DNA溶液)-20中。C保存。 10.双酶切鉴定质粒 (1)双酶切反应体系 HindIII 0. 80 ii 1 BamHI 0. 80 ii 1 10 XK Buffer 2. 00 ii 1 H20 13. 4 ill Plasmid 3. 00 ii 1 _ Total 20.0 ill (2)反应条件37°C 2 3h。
(3)酶切产物的电泳检测 制备1 %的琼脂糖凝胶，把酶切产物20 ii 1全部加到点样孔中，120V电泳30min，检测到大小相符的目的基因片段后，将重组质粒PMD18-T-RBP4寄往测序公司测序。
(五)RBP4基因真核表达载体的构建
1. RBP4基因转录片段的获得 以PMD18-T-RBP4质粒为模板，进行Clal和Xbal的双酶切。
(1)双酶切反应体系
Clal 0.80 ill Xbal 0.80 ill 10 XK Buffer2. 00 ii 1 H20 13. 4 ill Plasmid 3. 00 ii 1 _ Total 20.0 ill (2)反应条件37。C 2 3h。 (3)浓度测定 1%琼脂糖凝胶电泳观察结果，回收酶切产物，用分光光度计测0D26。的值，并根据
DNA的浓度=0D26。X稀释倍数X50(ng/iU)测出浓度。 2. pPICZ a C载体质粒DNA的处理 将载体pPICZ a C用Clal和Xbal酶切。 (1)双酶切反应体系 Clal 0.80 ill Xbal 0.80 ill 10XK Buffer2. 00 ii 1 H20 14. 4 ill Plasmid 2. 00 ii 1 Total 20.0 ill (2)反应条件37°C 2 3h。 (3)浓度测定 1%琼脂糖凝胶电泳观察结果，回收酶切产物，用分光光度计测0D26。的值，并根据 DNA的浓度=0D26。X稀释倍数X50(ng/iU)测出浓度。 3.构建转录载体pPICZ a C-RBP4 将回收的RBP4基因的PCR产物与pPICZaC载体按3 : l比例混合，作连接反应。 (l)连接反应体系
:0176] RBP4 1 ii 1
:0177] pPICZ a C Vector 0. 5 ii 1
:0178] 5 X Buffer 3. 0 ii 1
:0179] T41ignase 1.5ul
:0180] H20 14. Oil 1
:0181] _
:0182] total 20.0ul (2)反应条件16。C 3 4h。
4.转化和测序 将连接产物转化入T0P10F'菌株，培养基为25 y g/ml的Zeocin 低盐LB培养基，
挑选阳性克隆双酶切鉴定。 (1)双酶切反应体系
Cla I 0. 8ii 1
Xbal 0. 8 ii 1
10 XK Buffer 2. 0 ii 1
H20 15. 4 ill
plasmid of pPICZ a C—RBP4 1. 0 ii 1
20. Oil 1
total
(2)反应条件37。C 3 4h。
将正确的重组质粒pPICZ a C-RBP4送往上海生工测序，检测插入是否正确。 三、实验结果与分析 1.RBP4基因片段的获得
以肝脏组织总RNA为模板进行RT-PCR，扩增出一条大约550bp的特异性目的条带， 与预期条带551bp大小相符，初步确认为RBP4基因。取阳性重组质粒PMD18-T-RBP4分别 用Hindlll和BamHI (载体上的酶切位点)进行双酶切鉴定，获得两个片段，分别为约3kb 的PMD18-T载体和600bp左右的目的片段。测序结果表明，所扩增的序列与GenBank上公 布的猪RBP4基因序列完全相符，证明所得序列无误。
2.重组质粒pPICZ a C-RBP4的鉴定 以重组质粒pPICZ aC-RBP4为模板，用引物Pl、P2和P3、P4进行PCR鉴定，扩增 出一条约1. lkb左右的条带和一条约550bp左右的条带。取阳性重组质粒分别用Clal和 Xbal (载体上的酶切位点)进行双酶切鉴定，获得两个片段，分别为约3. 6kb的pPICZ a C载 体片段和约550bp的RBP4基因。克隆测序结果也显示RBP4基因已经插入到正确位置。说 明猪RBP4基因的真核表达载体构建成功。
猪的RBP4基因成熟肽氨基酸序列 1 21 41 61 81 101 121 141 161 181
GluArgAspCysArgValSerSerPheArgValLysGluAsnPheAspLysAlaArgPhe SerGlyThrTrpTyrAlaMETAlaLysLysAspProGluGlyLeuPheLeuGlnAspAsn IleValAlaGluPheSerValAspGluAsnGlyHisMETSerAlaThrAlaLysGlyArg ValArgLeuLeuAsnAsnTrpAspValCysAlaAspMETValGlyThrPheThrAspThr
AsnAspAspHisTrpIlelleAspThrAspTyrAspThrTyrAlaAlaGlnTyrSerCys ArgLeuGlnAsnLeuAspGlyThrCysAlaAspSerTyrSerPheValPheAlaArgAsp ProHisGlyPheSerProGluValGlnLysIleValArgGlnArgGlnGluGluLeuCys LeuAlaArgGlnTyrArgLeuIleThrHisAsnGlyTyrCysAspGlyLysSerGluArg AsnlleLeu
权利要求
一种猪成熟肽RBP4基因真核表达载体，其特征在于猪RBP4基因的重组载体pPICZαC-RBP4，是通过以下方法构建获得的(1)猪RBP4基因全长cDNA的克隆测序取猪的肝脏组织，用Trizol试剂提取总RNA，用BcaBEST试剂盒合成cDNA，连入pMD18-T载体，BamH I和HindIII双酶切鉴定后，寄往测序公司测序。(2)RBP4基因转录片段的获得以PMD18-T-RBP4质粒为模板，进行ClaI和XbaI的双酶切，将酶切下来的片段用胶回收试剂盒回收，用于和pPICZαC的连接反应。(3)pPICZαC质粒的提取、酶切提取pPICZαC质粒后，进行Cla I和XbaI双酶切，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用回收试剂盒进行大片段的回收，-20℃备用。(4)连接RBP4基因片段和pPICZαC载体片段按3∶1摩尔比例，在T4 DNA连接酶的作用下，4℃16小时进行连接反应。(5)将连接产物转化入TOP10F’菌株，培养基为25μg/ml的ZeocinTM低盐LB培养基，挑选阳性克隆双酶切鉴定。将正确的重组质粒pPICZαC-RBP4送往测序公司测序，检测插入是否正确。
全文摘要
本发明涉及猪视黄醇结合蛋白基因(RBP4)真核表达载体的构建，从大白猪的肝脏组织的cDNA中，PCR扩增出猪RBP4成熟蛋白编码核苷酸序列，产物全长549bp，即为猪RBP4成熟蛋白183个氨基酸序列。构建了大白猪RBP4成熟蛋白编码序列的真核表达载体pPICZαC-RBP4，经PCR、酶切和测序检测分析，片段大小与理论相符，证明构建成功。可为进一步表达具有生物活性的猪视黄醇结合蛋白奠定基础，也可为深入研究RBP4基因的生物学特性和功能提供一个方便有效的基本材料。
文档编号C12N15/81GK101724648SQ200810172949
公开日2010年6月9日 申请日期2008年10月24日 优先权日2008年10月24日 公开号200810172949.发明者刘娣 申请人:刘娣;张冬杰