专利名称：Rna的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种RNA的检测方法。更具体地说，本发明涉及一种RNA的检测 方法，该方法能够迅速、简便、并且高灵敏度地检测微量的RNA，而且被污染的危险性 也较低。
背景技术：
在分子生物学的研究和临床诊断过程中，核酸的扩增方法作为一种用于检测微 量的核酸所必须的技术，在广泛的领域中得以应用。现在，核酸的扩增方法也被积极地 用作检测微量RNA的方法。作为RNA的检测方法，通常所采用的RT-PCR法为这样的 方法首先，使RNA与逆转录酶发生作用以制备与该RNA互补的DNA;然后，对目标 基因采用具有特异性的引物的PCR(聚合酶链反应)法，对所制备的DNA进行扩增。为 了对作为目标的目标核酸序列进行扩增，PCR法由以下3个工序构成将作为模板的双 链DNA变性为单链DNA的工序(变性工序)；将引物退火到单链DNA上的工序(退火工 序)；以及，以引物作为起点使互补链延伸的工序(延伸工序)。在通常的PCR法中，在 使用扩增仪(Thermal Cycler)时，变性工序、退火工序、延伸工序分别在不同的温度下进 行。但是，在3种不同的温度下进行核酸扩增反应时，温度控制麻烦，并且还会造成这 样的问题消耗的时间会随着循环次数的增加而成比例地增加。 因此，人们开发了一些可以在恒温状态下实施的核酸扩增方法以代替PCR法。 例如可以列举，RCA(滚环扩增，Rolling Circle Amplification,参见文献Proc.Natl.Acad. Sci， vol.92， 4641-4645(1995))、 ICAN(恒温和嵌合引物引发的核酸扩增，Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)、 LAMP(环介导的DNA恒温扩增， Loop-Mediated Isothermal Amplification ofDNA，参见文献Bio Industry,第18巻、第2期 (2001))、 NASBA(基于核酸序列的扩增方法，Nucleic acid Sequence-based Amplification method,参见文献Nature， 350， 91 (1991》、TMA(转录介导的扩增方法，Transcription mediated amplification method,参见文献J.Clin Microbiol.第31巻、3270 (1993))等。
SDA法(日本特开平5-130870号公报)是采用外切核酸酶的循环分析法，其为利 用聚合酶延伸反应使靶核酸片段的目的部位扩增的一种方法。该方法是这样一种方法 以特异性地杂合到靶核酸片段的目的部位上的引物作为起点进行聚合酶延伸反应，同时 使5' —3'外切核酸酶发生作用，从而将引物从相反方向降解。新的引物代替降解的 引物进行杂合，并再次通过DNA聚合酶进行延伸反应。这种通过聚合酶进行的延伸反应 与通过外切核酸酶(该外切核酸酶将之前已延伸的链除去)进行的降解反应依次地、周期 性地反复进行。这里，通过聚合酶进行的延伸反应与通过外切核酸酶进行的降解反应可 以在恒温条件下进行。但是，该方法中除了聚合酶外，还必须使用外切核酸酶，这样一 来消耗成本，同时还必须花费精力来设计引物。 LAMP法是近年开发的对于靶核酸片段的目的部位进行扩增的方法。该方法 中，通过使用至少4种引物(该至少4种引物互补地识别靶核酸片段的至少6个特定部位)和链置换型的BstDNA聚合酶(该聚合酶为在5' —3'方向上没有核酸酶活性、而且边 使模板上的双链DNA解离为单链DNA边催化延伸反应的聚合酶)，在恒温条件下，将靶 核酸片段的目的部位扩增为特别结构。不过，这种方法需要使用至少4种引物以识别6 个特定部位，而引物的设计非常困难。 ICAN法也是近年开发的对于靶核酸片段的目的部位进行扩增的方法。该方法 为这样一种方法采用RNA-DNA嵌合引物、具有链置换活性和模板交换活性的DNA聚 合酶和RNaseH，进行恒温的基因扩增。嵌合引物与模板结合后，通过DNA聚合酶可以 合成互补链。之后，RNaseH将来源于嵌合引物的RNA部分切断，从切断的部分开始进 行延伸反应，同时伴随有链置换反应和模板交换反应，这样的反应反复进行，基因由此 得以扩增。不过，该方法也必须用到被称作嵌合引物的特殊引物，而引物的设计非常困 难。 在日本特表平11-509406号公报中，记载了在具有链置换能力的DNA聚合酶存 在下，采用至少1组寡核苷酸引物，将目的区域中的DNA在恒温条件下反应，由此扩增 的方法。不过，日本特表平11-509406号公报中记载的方法存在着需要比较长的反应时 间这样的问题。 在日本特开2002-233379号公报中，记载了在具有链置换能力的DNA聚合酶存 在下，采用至少1组寡核苷酸引物，将目的区域中的DNA在恒温条件下反应，由此扩增 的方法。不过，日本特开2002-233379号公报中记载的方法存在着显著生成非特异性的 扩增产物这样的问题。[非专利文献l]Proc.Natl.Acad.Sci， vo1.92， 4641-4645(1995)[非专利文献2]Bio Industry,第18巻，第2期(2001)[非专利文献3]Nature， 350， 91 (1991)[非专利文献4]J.Clin Microbiol.第31巻，3270 (1993)[专利文献1]日本特开平5-130870号公报[专利文献2]日本特表平11-509406号公报[专利文献3]日本特开2002-233379号公报
发明内容
发明要解决的问题 为了解决上述问题，本发明提供一种RNA的检测方法，该方法能够迅速、简 便、并且高灵敏度地检测微量的RNA，而且被污染的危险性也较低。为了解决上述问 题，本发明还提供一种通过更为简单的引物设计来检测RNA的方法。
解决问题所采用的手段 为了解决上述问题，本发明人进行了深入的研究。结果发现首先，通过使目 标RNA与逆转录酶发生作用以制备与该RNA互补的DNA;然后，将该DNA转移到含 有脱氧核苷三磷酸、具有链置换能力的DNA聚合酶、二价阳离子、表面活性剂、寡核苷 酸引物的反应溶液中，在基本上恒温的条件下进行孵育，从而以上述引物的3'末端作 为起点进行聚合酶反应，由此能够在短时间内高效地扩增核酸、并可以对其进行检测。 而且，本发明中所用的寡核苷酸引物的最大特征在于，其不具有在以往的恒温扩增法中所采用的那样的复杂结构。例如，不必具有在ICAN法中所采用的那样的嵌合结构或在 LAMP法中所采用的那样的环结构。 此外，由于本发明人发现了同时具有逆转录酶活性以及具有链置换能力的DNA 聚合酶活性的反应液组成，从而成功地在一个反应容器中连续进行以RNA为模板制备互 补的DNA的工序、以所制备的DNA为模板对核酸进行扩增的工序、以及检测扩增产物 的工序。基于以上发现完成本发明。 g卩，本发明提供一种核酸的扩增方法，其包括下列工序 (i)使RNA与逆转录酶发生作用以制备核酸片段的工序；以及， (ii)将含有至少一种脱氧核苷三磷酸、至少一种具有链置换能力的DNA聚合酶、
二价阳离子、至少0.01%以上的表面活性剂、至少两种寡核苷酸引物、以及通过上述工
序(i)而获得的作为模板的核酸片段的反应溶液，在基本上恒温的条件下进行孵育，以上
述引物的3'末端作为起点进行聚合酶反应，从而对该核酸片段进行扩增的工序。 优选的是，使RNA与逆转录酶发生作用以制备核酸片段的工序 与对该核酸片
段进行扩增的工序(ii)在同一反应容器中连续进行。优选的是，所述逆转录酶为选自源自禽类骨髓细胞瘤病病毒的AMVRTase; 源自Molony鼠白血病病毒的MMLV RTase ;作为源自Molony鼠白血病病毒的逆转录 酶、并且RNase H活性缺失而形成的变异体Superscript II ;以及源自Rous相关病毒-2的 RAV-2RTase中的逆转录酶。 优选的是，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。
优选的是，所述非离子型表面活性剂的HLB值在12以上。
优选的是，所述非离子型表面活性剂的HLB值在14以上。 优选的是，所述非离子型表面活性剂选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类、聚 氧乙烯烷基醚类。 优选的是，所述聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类的非离子型表面活性剂为聚氧 乙烯失水山梨醇单脂肪酸酯。 优选的是，所述非离子型表面活性剂以下述化学式表示，
<formula>formula see original document page 6</formula>(式中，x+y+z+w = 20， R表示碳原子数为12 18的烷基。)
优选的是，所述聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类的非离子型表面活性剂选自聚 氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20) 失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯中的至少一种。
优选的是，所述反应溶液中还含有解链温度调节剂。
优选的是，所述解链温度调节剂为二甲基亚砜、甜菜碱、甲酰胺或甘油，或者 它们当中两种以上的混合物。 优选的是，所述反应溶液中含有的每种脱氧核苷三磷酸的浓度均为1.0mM以 上。 优选的是，所述反应溶液中含有1 P M以上的寡核苷酸引物。 优选的是，所述寡核苷酸引物与通过上述工序 获得的模板核酸片段的一部分 基本上互补。 优选的是，所述寡核苷酸引物只有3'末端区域与通过上述工序(i)获得的模板 核酸片段的一部分基本上互补。 优选的是，所述寡核苷酸引物只与通过上述工序(i)获得的模板核酸片段的一部 分中的一处连续核苷酸基本上互补。 优选的是，所述至少一种的具有链置换能力的聚合酶为选自来源于嗜热脂肪芽 孢杆菌的5' —3'外切核酸酶缺失的Bst.DNA聚合酶、来源于热坚芽孢杆菌的5' —3' 外切核酸酶缺失的BcaDNA聚合酶、来源于Thermococcus litoralis的5' —3'外切核酸 酶缺失的Vent.DNA聚合酶、及来源于酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的
DNA聚合酶中的聚合酶。优选的是，将所述反应溶液在5(TC以上的基本上恒温的条件下进行孵育。
优选的是，在上述工序(ii)中，在基本上恒温的条件下进行孵育的时间为60分钟 以内。 根据本发明，能够提供一种检测目标RNA的方法，该方法包括实施上述本发明 的核酸扩增方法。 在上述的检测目标RNA的方法中，优选的是，上述工序(ii)包含以下的工序
(l)将反应溶液在基本上恒温的条件下进行孵育的工序，其中所述反应溶液中含 有至少一种脱氧核苷三磷酸、至少一种具有链置换能力的DNA聚合酶、二价阳离子、至 少一种表面活性剂、至少两种含有变异位点的寡核苷酸引物、以及作为模板的含有目标 RNA逆转录反应产物的核酸片段；以及， (2)根据是否发生核酸扩增反应来判断有无发生变异的工序，其中所述核酸扩增 反应是以所述引物的3'末端作为起点进行聚合酶链式反应。
发明效果 通过本发明，可以发现首先，使RNA与逆转录酶发生作用以制备与该RNA 互补的DNA;然后，将该DNA转移到含有脱氧核苷三磷酸、具有链置换能力的DNA聚 合酶、二价阳离子、表面活性剂、寡核苷酸引物的反应溶液中，在基本上恒温的条件下 进行孵育，从而以上述引物的3'末端作为起点进行聚合酶反应，由此能够在短时间内高 效地扩增核酸，并对其进行检测。 此外，由于扩增核酸的工序能够在恒温下进行，所以不必周期性地上下改变温 度，从而可以采用简便的装置来实施上述工序。 而且，本发明中所用的寡核苷酸引物的最大特征在于，其不具有在以往的恒温 扩增法中所采用的那样的复杂结构(例如，不必具有在ICAN法中所采用的那样的嵌合结 构或在LAMP法中所采用的那样的环结构)。
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另外，上述工序可以在一个反应容器内实施，在这种情况下可以使得操作进一 步简便化、迅速化。另外，本发明的方法是一种被污染的危险性较低的RNA检测方法。 并且，由于本身利用的是核酸的扩增反应，所以也是一种灵敏度高的RNA检测方法。
图1显示的是实施例中所用的引物相对于P-肌动蛋白mRNA的逆转录的 DNA(及其互补链)的位置关系的详细情况。 图2显示的是通过本发明的扩增反应而得到的扩增产物的荧光检测结果。
图3显示的是通过本发明的扩增反应而得到的扩增产物的荧光检测结果。
图4显示的是通过比较例的扩增反应而得到的扩增产物的荧光检测结果。
具体实施例方式
以下对本发明进行详细说明。 本发明的检测目标RNA的方法的特征在于首先，使逆转录酶与目标RNA进 行作用以制备与该RNA互补的DNA;然后，将该DNA转移到含有脱氧核苷三磷酸、具 有链置换能力的DNA聚合酶、二价阳离子、表面活性剂、寡核苷酸引物的反应溶液中， 在基本上恒温的条件下进行孵育，从而以上述引物的3'末端作为起点进行聚合酶反应。
此外，上述工序也可以在同一个反应容器内实施。
以下对本发明中所采用的成分进行说明。
(1)脱氧核苷三磷酸 采用脱氧核苷三磷酸作为延伸反应的底物。具体地说，优选使用dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP的混合物。作为脱氧核苷三磷酸，也可以含有dNTP的类似物(例如，7-脱 氮-dGTP等)。 此外，脱氧核苷三磷酸(dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP的混合物)的最终浓度均 在O.lmM 3.0mM的范围内，优选在0.75mM 3.0mM的范围内，更优选在l.OmM 2.0mM的范围内，特别优选在l.OmM 1.5mM的范围内。
(2)逆转录酶 在本发明中采用逆转录酶。对于逆转录酶没有特别限定，只要其具有以目标 RNA为模板来合成DNA的活性即可，例如可以使用源自禽类骨髓细胞瘤病病毒的逆转录 酶(AMV RTase);源自Molony鼠白血病病毒的逆转录酶(MMLV RTase);源自Rous相关 病毒-2的逆转录酶(RAV-2RTase)等。此外，也可以使用兼有逆转录活性的链置换型DNA 聚合酶。 (3)用于逆转录的寡核苷酸引物 在逆转录反应中使用的引物，可以是具有与特定的模板RNA互补的碱基序列的 引物，也可以是具有寡聚dT的引物或具有无规序列的引物。用于逆转录的引物的长度优 选为3 100个左右核苷酸的长度，更优选为6 50个左右核苷酸的长度。
(4)DNA聚合酶 在本发明中采用DNA聚合酶。作为DNA聚合酶，优选使用具有链置换能力的 聚合酶。在本说明书中，所谓"链置换能力"是指具有这样的活性在根据作为模板的核酸序列进行DNA复制时，通过置换DNA链来进行链置换，以使退火到模板链上的互 补链解离，即，具有能够进行链置换(strand displacement)的活性。作为具有链置换能力 的聚合酶的具体例子，可以列举来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的 5' —3'外切核酸酶缺失的Bst.DNA聚合酶、来源于热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax) 的5' — 3' 外切核酸酶缺失的Bca DNA聚合酶、来源于Thermococcus litoralis的 5' —3'外切核酸酶缺失的Vent.DNA聚合酶、及来源于酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的DNA聚合酶等，但并不局限于此。具有链置换能力的聚合酶，既可以 是来源于天然的，也可以是通过基因工程制造的重组蛋白质。
(5)二价阳离子 在本发明中，根据所使用的酶的金属需求性等，使用二价阳离子。作为所述二 价阳离子，可以使用镁盐、钙盐和其他的金属盐，例如，可以使用氯化镁、醋酸镁、硫 酸镁等。所述二价阳离子的最终浓度优选在ImM 20mM的范围内，更优选在2mM 10mM的范围内。 [OO73](6)表面活性剂 在本发明中，向反应溶液中添加表面活性剂。通过使用表面活性剂，可以达到 防止发生非特异性的核酸扩增这样的有利效果。对于本发明中可以使用的表面活性剂的 种类没有特别的限定，例如可以使用烷基苯磺酸盐、十二烷基硫酸酯盐(SDS)、磺基琥珀 酸辛酯盐、硬脂酸皂类等阴离子(anion)型表面活性剂；失水山梨醇脂肪酸酯、POE失水 山梨醇脂肪酸酯(Tween等)、POE烷基醚(Brij等)、POE烷基苯基醚(Triton等)、壬基 酚、月桂醇、聚乙二醇、聚氧乙烯'聚氧丙烯嵌段共聚物、POE烷基胺、POE脂肪酸双 苯基醚等非离子(nonion)型表面活性剂；氯化十六烷基吡啶鎗、十二烷基二甲基苄基氯 化铵、硬脂基三甲基氯化铵等阳离子(cation)型表面活性剂；并且，还可以使用烷基二甲 基氧化胺、烷基羧基甜菜碱之类的双性(两性)表面活性剂等。对于表面活性剂的用量 没有特别的限定，只要能够达到本发明的效果即可，但是优选为0.01%以上，更优选为 0.05%以上，进一步优选为0.1%以上。对表面活性剂的用量的上限没有特别的限定，通 常在10%以下，优选在5%以下，更优选在1%以下。 在表面活性剂中，特别优选使用非离子型表面活性剂。在非离子型表面活性剂 中，优选亲水性较强的表面活性剂，用HLB值表示的话，优选HLB值在12以上。更优 选HLB值在14以上，优选HLB值的上限为20。另外，优选HLB值在17以下，更优选 HLB值为14以上17以下。从结构上来说，所述表面活性剂优选选自聚氧乙烯失水山梨 醇脂肪酸酯类、聚氧乙烯烷基醚类。还有，在聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯中，优选的 化合物是聚氧乙烯失水山梨醇单脂肪酸酯。例如，可以用以下的结构式来表示。
(式中，x+y+z+w = 20。
R表示碳原子数为12 18的烷基。) 对于烷基的位置没有特别的限定，但是可以优选使用以下的结构式所表示的化
合物。
x+y+z+w = 20 R表示碳原子数为12 18的烷基 作为此类表面活性剂，就物质名称而言，聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类非离 子型表面活性剂可以列举聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨 醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸 酯等。可以列举商品名分别为Tween 20、 Tween 40、 Tween 60和Tween 80等的表面活 性剂。此外，对于表面活性剂的用量也没有特别的限定，但是优选为0.01%以上，更优 选为0.05%以上，进一步优选为0.1%以上。
(7)用于核酸扩增的寡核苷酸引物 在本发明的核酸扩增反应中使用的寡核苷酸引物具有与模板DNA基本上互补的 碱基序列，并且从该引物的3'末端可以进行DNA链的延伸。由于寡核苷酸引物具有与 模板DNA基本上互补的碱基序列，所以可以将其退火到作为模板的DNA上。作为本发 明使用的寡核苷酸引物，可以使用由脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸构成的物质，也可以 是含有修饰的核糖核苷酸或修饰的脱氧核糖核苷酸的物质。 此外，上述寡核苷酸引物无需具有在以往的恒温扩增反应中所用的那样的复杂 设计。本发明的最大特征在于，采用通常的PCR反应中所使用的至少一组以上的引物就
10可以进行恒温扩增反应。具体地说，这些引物不必具有在LAMP法等中所采用的那样的 5'末端与从3'末端延伸出来的部分互补而形成环状结构那样的结构。S卩，引物的3' 末端的连续区域与模板核酸是互补的。还有，本发明的寡核苷酸引物也不具有在SDA法 和ICAN法中所采用的那样复杂结构，该复杂结构为在反应过程中引物被切断，被切断后 的3'末端成为新的合成起点。 对于寡核苷酸引物的长度没有特别的限定，但是一般来说，为10 100个左右 核苷酸的长度，优选为15 50个左右核苷酸的长度，更优选为15 40个左右核苷酸的 长度。可以使用市售的DNA合成仪(例如，美国应用生物系统公司(Applied Biosystem Inc.)制造的DNA合成仪-394型等)，根据亚磷酰胺法来合成所述寡核苷酸引物。
在反应溶液中，寡核苷酸引物的用量优选为0.1iiM以上，更优选为1PM以 上，特别优选为1.5iiM以上。
(8)作为模板的RNA在本发明中，作为模板的RNA可以是mRNA、总RNA、 rRNA、 siRNA、病毒
的基因组RNA等中的任意一种。既可以使用从有可能含有作为模板的RNA的试样中所 制备的RNA，也可以直接使用有可能含有作为模板的RNA的试样。对于含有作为模板 的RNA的试样的种类没有特别的限定，例如可以列举体液(例如，全血、血清、尿、脑 脊髓液、精液、唾液等)，组织(例如，癌组织等)，用拭子采取的试样，来源于细胞培养 物之类的生物体的试样，诸如病毒、细菌、真菌、酵母菌、植物和动物之类的含有RNA 的试样，有可能混入有微生物的试样(例如，食品等)，或者诸如土壤、废水之类的环境 中的试样。在从上述试样中制备RNA时，对于制备方法没有特别的限定，例如，可以采 用表面活性剂处理、超声处理、用玻璃珠进行精制等本领域的技术人员公知的方法。对 于从试样中精制RNA，可以采用苯酚提取法、色谱法、凝胶电泳法或密度梯度离心分离 等方法进行。(9)对模板RNA的预处理 本发明中的模板RNA，可以在经过预处理工序之后使用。 预处理用的试剂可以含有(例如)表面活性剂、抗凝剂、蛋白质分解酶、脂类分 解酶。作为试剂的液性，可以是酸性，也可以是碱性。 作为预处理工序，可以包括在高温(例如98°C )下进行加热的工序或者采用变性
处理剂进行处理的工序。而且，在高温加热后，可以包括骤冷至4t:以下的工序。 (10)解链温度调节剂 在本发明的反应溶液中，可以添加解链温度调节剂。作为解链温度调节剂的具 体例子，可以列举二甲基亚砜(DMSO)、甜菜碱、甲酰胺或甘油、四烷基铵盐或它们中的 2种以上的混合物。对于解链温度调节剂的用量没有特别的限定，然而，在使用DMSO 或甲酰胺、甘油的情况中，通常它们在反应溶液中的含量为10%以下。
甜菜碱或四烷基铵盐的添加量为0.2M 3.0M，优选为0.5M 1.5M左右。
(ll)缓冲成分 在本发明的反应溶液中，可以含有缓冲成分。对于缓冲成分没有特别的限定， 可以使用例如N， N-二(羟乙基)甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷和磷酸盐(磷酸钠、磷酸钾等)等。缓冲成分的最终浓度在5mM lOOmM的范围内，特别优选在10mM 50mM的范围内，此外，pH是对于扩增反应中 使用的酶的最佳pH， 一般来说为6.0 9.0，特别优选使用pH 7.0 9.0的缓冲成分。
(12)荧光色素 在本发明的反应溶液中，可以含有荧光色素。对于荧光色素没有特别的限定， 例如可以使用SYBR Green I等。 由本发明的核酸扩增方法所得到的扩增产物，可以采用本领域的技术人员公知 的方法来进行检测。例如，采用凝胶电泳法，通过用溴化乙锭进行凝胶染色，可以检测 特定大小的反应产物。用于检测扩增产物的检测体系，可以使用荧光偏振法、免疫检测 法、荧光能量转移法、酶标记法(例如，过氧化酶、碱性磷酸酶等)、荧光标记法(例如， 荧光素、罗丹明等)、化学发光法或生物发光法等。也可以利用Taqmanprobe或Molecular Beacon检测。通过使用用生物素等标记的标记核苷酸也可以检测扩增物。在这种情况 中，可以采用荧光标记亲合素或酶标记亲合素等来检测扩增产物中的生物素。此外，通 过使用本领域的技术人员公知的氧化还原型嵌入剂(intercalator)，也能够由电极来检测扩 增产物。而且，也可以使用SPR来检测扩增产物。也可以通过检测焦磷酸镁来检测核酸的扩增。在这种情况下，可以采用根据浑 浊度进行的检测、以及本领域的技术人员公知的其他方法来进行检测。
通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例 <实施例1>总RNA中的P -肌动蛋白mRNA的检测
(1)通过逆转录反应制备与目标RNA互补的DNA 向0.1iig的Human Liver Total RNA(Clonetech公司制造)、100皮摩尔的6核苷 酸随机引物(Random 6mer Primer)(TaKaRa公司制造)、10纳摩尔的dNTP Mixture中加入
纯水使总体积为13 y L，在65t:下加热5分钟。 向上述反应液中加入4iiL的已浓縮5倍的逆转录缓冲液、2iiL的100mM的l， 4- 二硫苏糖醇(D池iothreitol)，在42。C下加热2分钟。 向上述反应液中加入1 y L的Superscript II(Invitrogen公司制造)，在25。C下加热 IO分钟、在42t:下加热50分钟、在7(TC下加热10分钟。
(2)以由(1)所制备的DNA作为模板进行核酸扩增反应
为了进行序列特异的核酸扩增，使用以下的引物。
<引物> 使用13 -肌动蛋白mRNA进行逆转录而得到的DNA(及其互补序列)作为目标进 行引物的设计。各引物的序列如下所示。
引物(l)(正向引物): 5， -GGGCATGGGTCAGAAGGATT-3'(序列编号1)
弓l物(2)(反向引物) 5， -CCTCGTCGCCCACATAG-3'(序列编号2) 上述引物相对于由P-肌动蛋白mRNA进行逆转录而得到的DNA(及其互补序 列)的位置关系具体如图1所示。
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采用具有如下所示组成的反应液，在6(TC下反应60分钟，以实施扩增反应。酶 使用的是NEB公司的Bst.DNA Polymerase。 <反应液的组成> lOXBst缓冲液 2.5 iiL MgSO4(100mM) 1.5 Tween 20(10% (v/v)) 0.25 y L DMSO1.25 iiL dNTP(25mM，每种) 1.4 SYBR Green I(稀释2000倍) 0.5 y L 50iiM引物(1) 1.6 iiL 50iiM引物(2) 1.6 iiL Bst.Polymerase 1.0 上述步骤(l)所得到的反应溶液1.0 iiL 纯化水 12.4 iiL _ 25.0 UL (3)扩增产物的检测 采用实时荧光检测装置(Mx3000p， Stratagene公司制造)对上述步骤(2)中的扩 增反应进行荧光检测。结果如图2所示。 可以看到，来自RNA试样的样品发生了核酸的扩增。在此，采用Mx3000p分 析软件，计算在上述的图中荧光量达到250时所需要的时间(Ct值)。该Ct值为28.2分 钟、28.3分钟(n = 2的实验)。 <实施例2>在同一个反应容器中进行RNA的检测 (I)逆转录反应及核酸扩增反应 <目标RNA〉 使用0.1 ii g的Human Liver Total RNA(Clonetech公司制造)作为目标RNA。 为了进行序列特异的核酸扩增，使用以下的引物。 <引物> 使用|3 -肌动蛋白mRNA进行逆转录而得到的DNA(及其互补链)作为目标进行 引物的设计。各引物的序列如下所示。 引物(l)(正向引物): 5' -GGGCATGGGTCAGAAGGATT-3'(序列编号l) 引物(2)(反向引物) 5' -CCTCGTCGCCCACATAG-3'(序列编号2) 采用具有如下所示组成的反应液，在25t:下反应IO分钟、在42t:下反应50 分钟、在6(TC下反应60分钟，以实施扩增反应。酶使用的是NEB公司的Bst.DNA Polymerase 。 <反应液的组成> 模板RNA(0.1 y g/ u L) 1.0 ii L
Random 6mer Primer(100 u M) 1.0 u L
Dithiothreitol(O.l ii M) 2.0 ii L lOXBst缓冲液 2.5 iiLMgSO4(100mM) 1.5
Tween 20(10% (v/v)) 0.25 ii L DMSO 1.25 iiL dNTP(25mM，每种) 1.8
SYBR Green I(稀释2000倍)0.5 ii L
50iiM引物(1) 1.6 iiL 50iiM引物(2) 1.6 iiLRTase(SuperScript II) 1.0 ii LBst.Polymerase 1.0
纯化水 17.0 iiL _ 25.0 UL (2)扩增产物的检测 采用实时荧光检测装置(Mx3000p， Stratagene公司制造)对上述步骤(1)中的扩 增反应进行荧光检测。结果如图3所示。 可以看到，来自RNA试样的样品发生了核酸的扩增。采用Mx3000p分析软件，
计算在上述的图中荧光量达到250时所需要的时间(Ct值)。该Ct值为18.6分钟、19.3
分钟(11 = 2的实验)。此外，对于该Ct值，将在6(TC下开始反应时的时间记为0分钟。 与实施例1相比，检测时间縮短了 10分钟左右。<比较例 > 采用PCR法进行总RNA中13 -肌动蛋白mRNA的检测 (1)通过逆转录反应制备与目标RNA互补的DNA 向0.1iig的Human Liver Total RNA(Clonetech公司制造)、100皮摩尔的6核苷 酸随机引物(Random 6mer Primer)(TaKaRa公司制造)、10纳摩尔的dNTP Mixture中加入
纯水使总体积为13 y L，在65t:下加热5分钟。 向上述反应液中加入4iiL的已浓縮5倍的逆转录缓冲液、2iiL的100mM的l， 4- 二硫苏糖醇(D池iothreitol)，在42。C下加热2分钟。 向上述反应液中加入1 y L的Superscript II(Invitrogen公司制造)，在25。C下加热 IO分钟、在42t:下加热50分钟、在7(TC下加热10分钟。
(2)以通过步骤(1)制备的DNA作为模板进行PCR
为了进行序列特异的核酸扩增，使用以下的引物。
<引物> 使用P-肌动蛋白mRNA进行逆转录而得到的DNA(及其互补链)作为目标进行 引物的设计。各引物的序列如下所示。
引物(l)(正向引物): 5， -GGGCATGGGTCAGAAGGATT-3'(序列编号1)
引物(2)(反向引物):
5， -CCTCGTCGCCCACATAG-3'(序列编号2) 采用具有如下所示组成的反应液进行PCR。
<反应液的组成> IOXPCR缓冲 10.0 iiL 10mMdNTP，每种 4.0 ii L 50iiM引物(1) 0.25 iiL 50iiM引物(2) 0.25 iiL
SYBR Green I(稀释1000倍)0.5 ii LTaq Polymerase 0.5 u L 纯化水 37.5 iiL _ 50.0 UL 按以下的温度循环进行PCR。
善
94 SC 60 C 7 2
4'C 此外，采用实时荧光检 时，每1次循环为2.1分钟。
(3)扩增产物的检测 采用实时荧光检测装置(Mx3000p， Stratagene公司制造)对上述步骤(2)中的扩 增反应进行荧光检测。结果如图4所示。 可以看到，来自RNA试样的样品发生了核酸的扩增。采用Mx3000p分析软件，
计算在上述的图中荧光量达到250时所需要的循环数(Ct值)。该Ct值为19.7个循环、
19.7个循环(n二2的实验)。S卩，换算成时间的话，为41.4分钟、41.4分钟。 与实施例l相比，检测时间延长了 13分钟左右。此外，与实施例2相比，检测
时间延长了 22分钟左右。 序列表 <110>富士胶片株式会社
<120>RNA的检测方法
<130>FI-081492-59 : 56
<150>JP 2007-288214
<151>2007-11-06
<160>2
15
分钟
20秒 30秒 30秒
^循环35次
J装置(Mx3000p， Stratagene公司制造)进行该温度循环
<170>Patentln version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>1gggcatgggt cagaaggatt<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>2cctcgtcgcc cacatag
权利要求
一种核酸的扩增方法，其包括下列工序(i)使逆转录酶与RNA发生作用以制备核酸片段的工序；以及，(ii)将含有至少一种脱氧核苷三磷酸、至少一种具有链置换能力的DNA聚合酶、二价阳离子、至少0.01％以上的表面活性剂、至少两种寡核苷酸引物、以及通过上述工序(i)而获得的作为模板的核酸片段的反应溶液，在基本上恒温的条件下进行孵育，以所述引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应，从而对该核酸片段进行扩增的工序。
2. 权利要求1所述的方法，其特征在于，(i)使所述逆转录酶与RNA发生作用以制备核酸片段的工序与(ii)对该核酸片段进行扩增的工序在同一反应容器中连续进行。
3. 权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述逆转录酶为选自来源于禽类骨髓细胞瘤病病毒的AMV RTase ;来源于Molony鼠白血病病毒的MMLV RTase ;来源于Molony鼠白血病病毒的逆转录酶、并且RNase H活性缺失而形成的变异体Superscript II ;以及来源于Rous相关病毒-2的RAV-2RTase中的逆转录酶。
4. 权利要求1 3中任意一项所述的方法，其中，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。
5. 权利要求4所述的方法，其特征在于，所述非离子型表面活性剂的HLB值在12以上。
6. 权利要求4所述的方法，其特征在于，所述非离子型表面活性剂选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类、聚氧乙烯烷基醚类。
7. 权利要求4所述的方法，其特征在于，所述非离子型表面活性剂以下述化学式表示，<formula>formula see original document page 2</formula>式中，x+y+z+w = 20， R表示碳原子数为12 18的烷基。
8. 权利要求1 7中任意一项所述的方法，其中，所述反应溶液中还含有解链温度调节剂。
9. 权利要求1 8中任意一项所述的方法，其中，所述寡核苷酸引物与通过上述工序 获得的模板核酸片段的一部分基本上互补。
10. 权利要求1 9中任意一项所述的方法，其中，所述寡核苷酸引物只有3'末端区域与通过上述工序 获得的模板核酸片段基本上互补。
11. 权利要求1 10中任意一项所述的方法，其中，所述的至少一种具有链置换能力的聚合酶为选自来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的5' —3'外切核酸酶缺失的Bst.DNA聚合酶、来源于热坚芽孢杆菌的5' —3'外切核酸酶缺失的BcaDNA聚合酶、来源于Thermococcuslitoralis的5' —3'外切核酸酶缺失的Vent.DNA聚合酶、及来源于酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的DNA聚合酶中的聚合酶。
12. 权利要求1 11中任意一项所述的方法，其中，将所述反应溶液在5(TC以上的基本上恒温的条件下进行孵育。
13. 权利要求1 12中任意一项所述的方法，其中，在上述工序(ii)中，在基本上恒温的条件下进行孵育的时间为60分钟以内。
14. 一种检测目标RNA的方法，其包括实施权利要求1 13中任意一项所述的核酸扩增方法。
15. 权利要求14所述的方法，其中，所述工序(ii)包括以下工序(1) 将反应溶液在基本上恒温的条件下进行孵育的工序，其中所述反应溶液中含有至少一种脱氧核苷三磷酸、至少一种具有链置换能力的DNA聚合酶、二价阳离子、至少一种表面活性剂、至少两种含有变异位点的寡核苷酸引物、以及作为模板的含有目标RNA逆转录反应产物的核酸片段；以及，(2) 根据是否发生核酸扩增反应来判断有无发生变异的工序，其中所述核酸扩增反应是以所述引物的3'末端作为起点进行聚合酶链反应。
全文摘要
本发明提供一种RNA的检测方法，该方法能够迅速、简便、并且高灵敏度地检测微量的RNA，同时被污染的危险性较低。本发明的检测方法包括将核酸扩增的方法，该扩增方法包括下列工序(i)使逆转录酶与RNA进行作用以制备核酸片段的工序；以及，(ii)将含有至少一种脱氧核苷三磷酸、至少一种具有链置换能力的DNA聚合酶、二价阳离子、至少0.01％以上的表面活性剂、至少两种寡核苷酸引物、以及通过上述工序(i)而获得的作为模板的核酸片段的反应溶液，在基本上恒温的条件下进行孵育，以所述引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应，从而对该核酸片段进行扩增的工序。
文档编号C12P19/34GK101691592SQ200810172660
公开日2010年4月7日 申请日期2008年11月6日 优先权日2007年11月6日
发明者三好隼人, 岩木义英, 森寿弘 申请人:富士胶片株式会社