检测水产品中重要致病菌的基因芯片和试剂盒的制作方法

专利名称：：检测水产品中重要致病菌的基因芯片和试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种基因芯片和检测用试剂盒，尤其涉及检测水产品中重要致病菌的基因芯片和试剂盒。
背景技术：
：食品质量与食品安全关系人类健康，因而受到世界各国的高度重视。微生物引起的食源性疾病是食品安全的主要问题。细菌污染造成的食源性疾病(食物中毒)是我国食品安全中最突出的问题。据卫生部统计，2000年共收到重大食物报告达150起，中毒6237人，死亡135人；2001年共发生重大食物中毒事件185起，15715人中毒，116人死亡。2005年全国各地上报的食物中毒事件中，微生物食物中毒人数最多，占总数的43.0%。国家食源性疾病监测网个案报告的资料分析表明微生物性病原占46.4%，微生物性食源性疾病暴发中，副溶血性弧菌导致的疾病暴发占40.1%，变形杆菌占11.3%，葡萄球菌肠毒素占9.4%，蜡样芽孢杆菌占8.6%，沙门氏菌占8.1%，致病性大肠杆菌占4%。我国食物中毒的高危食品为肉类、粮食、水产品、水果蔬菜、鸡蛋、豆类、奶。这一排序是基于国家食源性疾病监测网部分资料的分析的动态情况。其中水产品排名第三，是重要的食物中毒高危食品。水产品致病菌导致的食源性疾病影响的国家范围广、危急健康人群多，而且还给国家之间相关的食品贸易带来危机，这使得水产品安全问题受到了空前的关注。这些事实也可以充分说明尽管现代科技已经发展到了相当高的水平，但水产品致病菌导致的疾病不论在发达国家还是在发展中国家，都没有很好的被控制，仍然危害着人民的健康。水产品中的致病菌主要有以下两类一是其自身原有致病菌，这类细菌广泛分布于水中，如冷源性细菌单核细胞增生李斯特氏菌，噬热性细菌如副溶血弧菌和霍乱弧菌等；二是非自身原有致病菌，即生产过程中被污染的致病菌，主要存在与人和动物肠道内及被人或动物粪便污染的水环境中，常见的包括沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌等(杨文鹆，孙翠玲，潘云娣，等.水产品中致病微生物的快速检测方法.中国食品学报，2006，6(1):402406)。统计了卫生部公布的国内近十年公布的微生物性食物中毒病例，综合国家食源性疾病监测网部分资料的分析的动态情况，天津出入境检验检疫局提供的调查统计数据，确定水产品致病菌检测芯片检测范围为下列常见的IO类菌化脓性链球菌，志贺氏菌(包含福氏志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、鲍氏志贺菌和痢疾志贺氏菌共4个种)，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，副溶血弧菌，霍乱弧菌，单增李斯特菌，奇异变形杆菌，潘氏变形杆菌和普通变形杆菌。我国目前对于水产品的病原菌检测、鉴定手段仍停留常规的微生物学检验水平，通常以分离培养、生化试验及血清学试验为主，具有操作复杂、手工劳动量大、检验周期长(6-7天)、特异性不强等缺点，在相当大的程度上限制了对食源性疾病病源水产品的快速检测鉴定能力，并且在判断是否为阳性时只靠实验人员肉眼观察，没有足够可靠的依据，降低实验结果的准确性，不能达到新鲜水产品贮藏时间短、需要快速检测的要求。一些简单的分子生物学的方法如PCR、ELISA都有较高的假阳性结果出现，并且运用PCR和ELISA得出3的结果都不能作为最终的检测依据。日前丹麦、澳人利亚等一些欧洲和澳洲国家食源性病原菌的检测结果综合了实时荧光PCR和ELISA两种技术在DNA和蛋白质两种水平上检测的结果进行判断，并且实验操作只有lh左右。因此我国有必要建立起水产品致病菌的高通量、快速、准确的监测体系，以确保在相对较短的时间内正确判定水产品的安全性，这是有效地预防和控制食源性疾病的重要前提。只有这样才能在一定程度上提前消除由于水产品中的致病菌所造成的危害，提高我国食源性疾病的检测和控制能力，为加入WTO后尽早与其他国家达成通关协议搭建雄厚的技术平台。1997年7月，Affymetrix，Inc.(SantaClara，CA)公司的ThomasR.等人发明的第6，228，575号美国专利公开了以生物芯片技术对微生物进行定种和表型分析的方法。从二十世纪九十年代开始，基因芯片技术作为一种全新的核酸分析检测技术建立起来，并随着人类基因组计划的开展而逐步发展。该技术综合运用了分子生物学、集成电路制造、计算机、半导体、共聚焦激光扫描、荧光标记等技术，使检测过程具有敏感性高、特异性强、大规模集成化、自动化、操作简便快捷、效率高等特点，在基因表达相关研究和生物制药研究等方面得到普遍应用。因此，如果将基因芯片技术用于细菌的鉴定，不仅可以大大简化检测手段，提高检测速度，而且具有高准确性、高灵敏度、高通量、可重复性强等诸多优点。目前最常使用的微生物鉴定的靶分子是16SrRNA和23SrRNA，国内外已有很多文献报道。利用16SrRNA和23SrRNA可将细菌微生物鉴定至种或属，但是对于亲缘关系较近的细菌种或属的鉴定十分困难(BodrossyL，SessitschA.2004.Oligonucleotidemicroarraysinmicrobialdiagnostics.CurrentOpinioninMicrobiology.7:245-25)。目前利用16S-23SrRNA间区作为靶分子进行细菌的鉴定已经逐渐成为研究的热点(NubelU，SchmidtPM，ReiPE，etal.2004.OligonucleotidemicroarrayforidentificationofBacillusanthracisbasedonintergenictranscribedspacersinribosomalDNA.FEMSMicrobiologyLetters240:215-223.)，它的变异速率相当于16SrRNA或者23SrRNA的十倍，因此具有更高的分辨率，甚至可将细菌区分到型，对于亲缘关系较近的种属的区分具有16SrRNA和23SrRNA不可比拟的优势。同时两端是保守的16SrRNA基因和23SrRNA基因区，可在两端的保守区设计通用引物可避免了多对引物带来的引物二聚体的问题，长度在200bp-1000bp之间，大小易于操作，因而靶序列的扩增和标记过程更加简化，也更容易控制，符合操作简便快捷的实际要求。
发明内容本发明的一个目的是提供一种检测水产品中重要致病菌的基因芯片，以弥补传统常见水产品致病菌检测技术存在的费时耗力的缺陷，扩展病原菌检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，縮短检测周期。本发明所述的检测水产品中重要致病菌的基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其中所述固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针包含从以下序列中选取的一种或多种(1)从沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、潘氏变形杆菌的16S-23SrDNA间区以及志贺氏菌的ipaH(invasionplasmidantigengene)毒力基因中选取的DNA序列；(2)上述(1)中选取的DNA序列的互补DNA序列；(3)上述(1)或(2)中选取的DNA序列的互补RNA序列。本发明的优选实施例中，固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针具有SEQIDNO:2-SEQIDNO:26所示的DNA序列中的一种或多种。本发明所述的基因芯片，还包含阳性对照探针、阴性对照探针或荧光探针。本发明所述的基因芯片中，所述阳性对照探针选自细菌16SrDNA保守区中的DNA片段或者其互补的DNA或RNA序列。本发明的优选实施例中，所述阳性对照探针具有SEQIDNO:1所示的DNA序列。本发明还提供所述的基因芯片的应用，主要为在检测志贺氏菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、潘氏变形杆菌中至少一种致病菌的应用。上述应用中，包含使用检测引物，本发明的优选实施例中，所述检测引物具有SEQIDN0:27-SEQIDNO:30所示的DNA序列或其互补序列中的至少一种。本发明还提供一种试剂盒，其包含权利上述的基因芯片。本发明所述的试剂盒，还包括检测引物，本发明的优选实施例中，所述检测引物具有SEQIDN0:27-SEQIDNO:30所示的DNA序列或其互补序列中的至少一种。本发明还提供上述的试剂盒的应用，其主要为在检测志贺氏菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、潘氏变形杆菌中至少一种致病菌的应用。由上述的技术方案可见，本发明首次将基因芯片技术引入水产品中重要致病菌检测领域同时检测10类致病菌，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的全新的用于检测水产品中重要致病菌的基因芯片及其检测方法，利用本发明的基因芯片可以达到检测水产品中重要致病菌的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，可用于医学检验、食品安全检验、进出口检验检疫和流行病学调查。为保证本发明的上述和其它目的特征和优点更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。图l为本发明基因芯片的-图2为本发明基因芯片的-图3A为利用本发明的基因图3B为利用本发明的基因图3C为利用本发明的基因图3D为利用本发明的基因图3E为利用本发明的基因图3F为利用本发明的基因图3G为利用本发明的基因图3H为利用本发明的基因图31为利用本发明的基因-个实施例的外形示意图。-个实施例上单一点阵探针排布规律示意图,芯片检测化脓性链球时的杂交结果。芯片检测志贺氏菌时的杂交结果。芯片检测金黄色葡萄球菌时的杂交结果。芯片检测沙门氏菌时的杂交结果。芯片检测单增李斯特氏菌时的杂交结果。芯片检测副溶血弧菌时的杂交结果。芯片检测霍乱弧菌时的杂交结果。芯片检测奇异变形杆菌时的杂交结果。芯片检测潘氏变形杆菌时的杂交结果。图3J为利用本发明的基因芯片检测普通变形杆菌时的杂交结果。具体实施例方式实施例1探针的设i十和制备1.序列获得(1)细菌16SrDNA序列的获得从GenBank公共数据库下载得到十种菌的全部16SrDNA序列。(2)16S-23SrDNA间区序列的获得从GenBank公共数据库下载得到沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、及它们的近缘菌的所有16S-23SrDNA间区序列。为满足靶序列分析时种内保守种间特异的需要，针对ITS资源极少的变形杆菌属，选取了48株变形杆菌(包含该属全部4个种奇异变形杆菌22株，普通变形杆菌14株，潘氏变形杆菌10株，产粘变形杆菌2株)进行了间区的测序，测得831条ITS序列。用上述从16sSrDNA和23SrDNA序列设计的引物扩增间区，PCR产物纯化后连接到T载体上，后电转进DH5a感受态中，挑取含500bp-1000bp的质粒测序，测序仪ABI3700。测得的序列用StadenPackage软件拼接，从而得到奇异变形杆菌和普通变形杆菌及其近缘菌的间区序列。(3)ipaH基因序列的获得从GenBank公共数据库下载得到志贺氏菌四个种的全部ipaH基因序列。2.探针设计(1)细菌的通用探针10类菌全部的16SrDNA序列及其他菌的16SrDNA序列导入GlustalX软件中，选取靠近间区的一段16SrDNA保守序列作为探针，满足长度35士2bp，Tm75°C±_2°C。(2)间区探针分别将沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、潘氏变形杆菌的所有16S-23SrDNA间区序列导入GlustalX软件中，从而得知该菌的间区序列有几种类型，每种类型选取一条代表序列在公共数据NCBI中作Blastn比对，确定可否作为特异靶点以及特异靶点的位置。对照GlustalX比对结果，选取满足不同株间该区段都保守的性质，同时长度35±2bp，Tm75°C±2°C。(3)ipaH基因探针将上述从GenBank公共数据库下载得到的志贺氏菌四个种的ipaH基因序列用序列比对软件GlustalX比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入01igoArray2.0软件中，参数设定如下-n20;-130;-L40;-D3000;-t79;-T90;-sG5°G;—x65°G;—N2;—p33，—P65;—mGGGGGCCGGCTTTTTAAAAA;—g15。运行程序在线设计探针。从输出结果中选择长度在35bp士2bp，Tm值75t:士2t:的探针。3.探针合成将下表l中的探针序列的5'端延长10个T(表1所示的荧光探针序列中已包含了延长的IO个T)并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备用。4.探针筛选将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在玻璃片基上制成基因芯片，通过杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的探针。在本发明的优选实施例中，选择了28条长度在35bp士2bp、Tm75°C士2。C的探针，并通过360次杂交实验进行探针筛选，最终得到如表1所示的探针。其中，编号为NO.l(SEQIDN0:1)的探针序列选自所有细菌的16SrDNA，作为阳性对照用来检测是否有细菌，编号为NO.2的探针作为荧光探针，编号为NO.3的探针为多聚T片段，用作阴性对照，编号为N0.4的探针为50X的DMS0，用作空白对照，编号N0.5-N0.25的21条探针序列(SEQIDNO:2-SEQIDN0:22)选自常见致病菌(沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、潘氏变形杆菌)的16S-23SrDNA间区，编号NO.26-NO.29(SEQIDNO:23-SEQIDNO:26)的4条探针序列选自志贺氏菌的ipaH基因。表1:本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的致病菌探针编号SEQID探针序列(5'-3')可检测出的致病菌NO.1NO:1TTGTACACACCGCCCGTCACACCAT细菌正对照NO.2Gy3mmmmmmmm荧光探针TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTNO.3==丽丽丽阴性对照NO.450%DMSO空白对照NO.5NO:2GGCTCCATCAGGATACAATCCTACTAAACTT化脓性链球菌NO.6NO:3CACATGGTCAGATTCCTAATTTTCTACAGA化脓性链球菌NO.7NO:4GCTAAAGCGAGCGTTGCTTAGTATCCTA化脓性链球菌NO.8NO:5GCTTATGCGAGCGCTTGACAATCTATTCT金黄色葡萄球菌NO.9NO:6TAAAGCAGTATGCGAGCGCTTGACTAAA金黄色葡萄球菌NO.10NO:7ATGTGAACGTTTGACTTATAAAAATGGTGG金黄色葡萄球菌7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例2引物的设i十和制备1.序列获得同前设计探针的序列。2.设计引物:(1)扩增间区序列引物的设计从公共数据库NCBI中下载得到的十种细菌的16SrDNA用序列比对软件GlustalX比对后，选取靠近间区的一段16SrDNA保守序列作为上游引物，长度符合Tm值50。C士5。C、长度17bp士2bp、Hairpin:NONE、Dimer:NONE、FalsePriming:NONE、CrossDimer:NONE，且包含细菌通用探针序列在内。(2)扩增ipaH基因序列引物的设计将上述从GenBank公共数据库下载得到的志贺氏菌四个种的ipaH基因序列用序列比对软件GlustalX比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入引物设计软件PrimerPremier5.0软件中，相应参数设定如下SearchFor:PCRPrimers,Searchtypes:Both.SearchRanges:SensePrimer1to672，Anti_sensePrimer1to672，PCRProductSize:100bptolOOObp.PrimerLength:20bp±2bp.SearchMode:Automatic。从输出结果中选取Tm值50。C±5°C、长度17bp士2bp、Hairpin:顯E、Dimer:顯E、FalsePriming:顯E、CrossDimer:顯E且包含探针序列在内的引物。3.引物合成将下表2中的引物序列委托引物合成公司(北京奥科)合成，备用。4.引物筛选将合成好的引物溶解并适量稀释，一方面通过PCR反应分别扩增16S-23SrDNA间区和志贺氏菌ipaH基因序列检测引物的扩增性，另一发面，两对引物同时对IO类菌的不同菌株进行扩增检测两对引物的相容性，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的引物。在本发明的优选实施例中，选取了既包含探针又适合同时使用2对引物扩增10类水产品中重要致病菌(志贺氏菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、潘氏变形杆菌)DNA的引物4条，为适应同时两对引物的PCR，经生物信息学初筛并通过大量PCR实验筛选，筛选出如表2所示的适用引物。表2用于肠道中10类常见致病菌检测DNA的PCR扩增的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>棚列3細猛燃——K鹏1.溶解探针将实施例1中合成的探针分别溶解于50%匿SO溶液中，稀释使探针的终浓度达到IPg/iil。2.加板将溶解好的探针加入384孔板的相应位置，每孔10。3.点样将如图1所示的57.5mmX25.5mmXlmm(长X宽X高)的洁净的醛基化玻片(C即italBioCorp.，China)放到芯片点样仪(Spotarray72)的载物台上，使用SpotArray的控制软件(Telechemsmp3stealtypin)，运行程序，按图2所示的排布方式点在醛基化的玻片上4.5mmX4.5mm的点样区内，构成中低密度DNA微矩阵，玻片上的六个点阵区内阵列排布规律相同。点阵区域尺寸3mmX2mm，该点阵内点间距250ym，矩阵12X8，12X250iim=3mm，8X250iim=2mm，标准片基尺寸75.5mmX25.5mmXlmm。4.干燥将点好的芯片室温下过夜干燥，然后在45t:烘箱干燥2小时。5.交联用交联仪(uvpcl-2000MultracioletCrosslinker)600J交联2次。将交联好的芯片放回洁净芯片盒中，备用。由图2可见，每个点样区内为12(行)X8(列)个探针点。NO.l框区示意的位置为检测细菌的正对照探针，NO.2框区示意的位置为荧光探针，NO.3框区示意的位置为负对照探针，N0.4框区示意的是空白对照，其它为各致病菌的特异探针(对应于表1中的相应探针编号)。輔你l4糊細総,翻^口口口巾魏致儲1.样品处理按照国标的操作方法，用灭菌棉签，无菌操作，涂抹鱼、虾、蟹等水产品的腮和肠道等部位，放入配制好的2YT培养基中，37°C，200rpm过夜振荡培养。2.提取基因组lml过夜培养的样品8000rpm离心5分钟沉淀可能存在的致病菌菌体，弃上清(尽量空干)。向沉淀中加入100ul去离子水重悬，8000rpm，离心5分钟，去除上清。加入100ul的裂解液(配方如下)，IO(TC沸水浴15分钟，12000rpm离心3分钟，上清即为粗提的DNA模板。附裂解液配方1XPCR缓冲液(含Mg+)0.5%的NP400.5%的Tween203.扩增靶序列取上述基因组提取方法提取的3ul中层上清作为模板加入PCR反应混合液中，PCR反应混合液配方如下表3所示。(注以下表3-表4中的PCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合物，Taq酶均购自Sangon公司)表3MultiplexPCR反应混合液配方成分浓度加样量(W)ddH20-3610xPCR缓冲液10xMgCl225mMdNTP混合物10mM0.5P-l和P-2各lP-3和P-4lO(iM各0.3Taq酶5U/pl0.5注表中P-l至P-2以及P-3和P-4为表2中所列的引物。将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下94°C5分钟94。C30秒50°C30秒72°C1分钟回到第二步，共35个循环72°C5分钟4°C20分钟3.纯化将上述获得的PCR扩增产物用纯化柱(MILIPORE公司)纯化，具体步骤如下(1)将PCR产物转移至纯化柱中，加水补足至400ill。(2)25。C、6000rpm离心15分钟，丢弃收集管。(3)将纯化柱转移到新的1.5ml的离心管中，加入25iU的超纯水(MilliQ)，37°C放置5分钟。(4)将纯化柱倒置放在1.5ml的离心管上，6000rpm离心2分钟，收集产物。4.标记靶序列取12ill纯化产物，加入标记混合液中，标记反应混合液配方如下表4所示。表4标记混合液配方浓度加样量成分ddH20-9.310xPCR缓冲液3MgCl225mM3dNTP混合物10mM0.3P-2和P-4IOjiM各0.6Cy3-dUTP25nM0,3Taq酶5，0.3注表中P-2和P-4为表2中所列的引物。将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下94°C5分钟94°C30秒50°C30秒72°C1分钟回到第二步，共35个循环72"C5分钟4。C20分钟5.烘干将标记产物置65t:烘箱烘干。6.杂交向杂交盒(博奥公司)内预加入70ii1ddH20以保持湿度。12ill杂交液(配方如下所示)回溶烘干产物并加在实施例三中制备的肠道中常见致病菌检测基因芯片的探针阵列区域，盖上定制的盖片(博奥公司)(注意盖片和载玻片之间不能有气泡)，盖紧杂交盒，4(TC水浴锅中杂交16小时。7.洗涤杂交到时，取出杂交盒，去除盖片，将基因芯片依次在洗液A中洗涤3分钟，洗液B中洗涤3分钟，洗液C中洗涤90秒，空气中风干。杂交液配方10%硫酸葡聚糖(dextranSulfate);25%甲酰胺(formamide);0.1%SDS(十二烷基硫酸钠)；6XSSPE洗液A:1XSSC(氯化钠-柠檬酸钠溶液)；0.1%SDS洗液B:0.05XSSC洗液C:95X乙醇8.扫描用GenePixpersonal4100A生物芯片扫描仪(AXONinstrument)扫描，所用参数如下12软件及版本GenePixPro6.0officialname:575DF35PMTGain:550扫描分辨率10iim扫描结果存为JPG、TIF、GPR格式用本发明的基因芯片分别检测常见的肠道中致病菌(志贺氏菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、潘氏变形杆菌)时的杂交扫描结果如图3A-3J所示。9.分析判读由于此芯片检测的目标菌有10种，探针28条，属于低密度芯片，检测结果可由肉眼判断。根据扫描出的杂交图像，以正对照探针的位置作为图像坐标，判断出现荧光信号的特异探针的位置，对照点阵排布图判断出致病菌。若只有正对照探针有信号，则不存在此io种致病菌。輔你l5乂寸細猛则滩鼎赫翻对实施例3中制备的水产品中重要致病菌检测基因芯片的特异性进行鉴定如下总计用197株致病菌的代表性菌株和检出株以及他们的近缘菌株来鉴定实施例3中制备的水产品中重要致病菌检测基因芯片的特异性。在该特异性鉴定试验中，使用的所有菌株情况见表5。利用本发明的基因芯片和上述检测方法进行杂交检测，均显示了正确的杂交结果，这说明本发明的基因芯片具有良好的特异性。表5:特异性试验用到的菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>a，流行病学微生物学研究所(IEM)，中国预防医学研究会。b，澳大利亚医学与兽医学研究所(MVS)。c，中科院微生物研究所(As)。d，中国医学微生物菌种保藏中心(CMCC)。e，台湾苏州大学。f，中国农业微生物菌种保藏中心(ACCC)。g，瑞典哥德堡大学培养物保藏中心(CCUG)。h，捷克典型菌种保藏中心(Prk)。i，波兰罗兹大学微生物学和免疫学研究所。j，捷克微生物保藏中心(CCM)。k，美国典型菌种保藏中心(ATCC)。l，澳大利亚新南威尔士州疾病感染和微生物中心(CIDM)。m，比利时菌种中心(LMG)。n，中国兽医学菌种国家保藏中心(CVCC)。o，来自天津出入境检验检疫局的检出株。p，来自于天津中医药大学的临床菌株。q，来自于天津人民医院的临床菌株。r，来自于天津一中心医院的临床菌株。s，来自于天津三中心医院的临床菌株。t，来自于天津儿童医院的临床菌株。u，来自于天津南开医院的临床菌株。v，来自于天津血液研究所的临床菌株。w，来自于天津胸科医院的临床菌株。x，来自于天津医科大学第二附属医院的临床菌株。对实施例3中制备的水产品中重要致病菌检测基因芯片的灵敏度进行检测如下该基因芯片的检测灵敏度经过153次杂交实验的验证，0.lng的微量基因组DNA或104cfu/ml纯菌样品中菌落就可保证上述IO种致病菌具有稳定、良好的杂交结果，这说明本发明的基因芯片具有很高的检测灵敏度。根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可以做出各种可能的等同改变或替换，而所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。序列表〈110〉天津生物芯片技术有限责任公司〈120〉检测水产品中重要致病菌的基因芯片和试剂盒〈130>8P13002-CN〈160>30〈170>PatentInversion3.2〈210>1〈211>25〈212>DNA〈213〉阳性探针序列〈400>1ttgtacacaccgcccgtcacaccat〈210>2〈211>31〈212>DNA16〈213〉用于检测化脓性链球菌的寡核苷酸探针序列〈400>2ggctccatcaggatacaatcctactaaactt31〈210>3〈211>30〈212>DNA〈213〉用于检测化脓性链球菌的寡核苷酸探针序列〈400>3cacatggtcagattcctaattttctacaga30〈210>4〈211>28〈212>DNA〈213〉用于检测化脓性链球菌的寡核苷酸探针序列〈400>4gctaaagcgagcgttgcttagtatccta28〈210>5〈211>29〈212>DNA〈213〉用于检测金黄色葡萄球菌的寡核苷酸探针序列〈400>5gcttatgcgagcgcttgacaatctattct29〈210>6〈211>28〈212>DNA〈213〉用于检测金黄色葡萄球菌的寡核苷酸探针序列〈400>6taaagcagtatgcgagcgcttgactaaa28〈210>7〈211>30〈212>DNA〈213〉用于检测金黄色葡萄球菌的寡核苷酸探针序列〈400>7atgtgaacgtttgacttataaaaatggtgg30〈210>8〈211>27〈212>DNA〈213〉用于检测沙门氏菌的寡核苷酸探针序列〈400>8gaggttctgactacacgatggggctat27〈210>9〈211>25〈212>DNA〈213〉用于检测单增李斯特氏菌的寡核苷酸探针序列〈400>9aggcactatgcttgaagcatcgcgc25〈210>10〈211>33〈212>DNA〈213〉用于检测单增李斯特氏菌的寡核苷酸探针序列〈400>10gagaggttagtacttctcagtatgtttgttctt33〈210>11〈211>30〈212>DNA〈213〉用于检测副溶血弧菌的寡核苷酸探针序列〈400>11aatggttacttcattagaagtgattagctc30〈210>12〈211>26〈212>DNA〈213〉用于检测副溶血弧菌的寡核苷酸探针序列〈400>12ccgattagctccaccactgacttcct26〈210>13〈211>28〈212>DNA〈213〉用于检测霍乱弧菌的寡核苷酸探针序列〈400>13ttttcgctgagaatgtttaaaaatggtt28〈210>14〈211>27〈212>DNA〈213〉用于检测霍乱弧菌的寡核苷酸探针序列〈400>14ctttaagcgttttcgctgagaatgttt27〈210>15〈211>32〈212>DNA18〈213〉用于检测奇异变形杆菌的寡核苷酸探针序列〈400>15gccttgcctaaagaaaaagcttcttattat32〈210>16〈211>35〈212>DNA〈213〉用于检测奇异变形杆菌的寡核苷酸探针序列〈400〉16gaataactaagctaattcaaatgagttatcttact35〈210>17〈211>31〈212>DNA〈213〉用于检测奇异变形杆菌的寡核苷酸探针序列〈400>17ccacccagatagtctttgaaagagacacttt31〈210>18〈211>33〈212>DNA〈213〉用于检测奇异变形杆菌的寡核苷酸探针序列〈400〉18朋朋gg3gtggttetecgggtette朋3C3tte33〈210>19〈211>35〈212>DNA〈213〉用于检测潘氏变形杆菌的寡核苷酸探针序列〈400>19朋3gg朋c3tttccgat朋g3朋g朋3gctgagte35〈210>20〈211>35〈212>DNA〈213〉用于检测潘氏变形杆菌的寡核苷酸探针序列〈400>20gaatagttaagataattcgatgagttattttacct35〈210>21〈211>27〈212>DNA〈213〉用于检测潘氏/普通变形杆菌寡核苷酸探针序列〈400>21agcgcacagtcagcgcaacatacatta27〈210>22〈211>27〈212>DNA〈213〉用于检测普通变形杆菌的寡核苷酸探针序列〈400>22cccagacgtc3tt朋g朋g3朋catct27〈210>23〈211>27〈212>DNA〈213〉用于检测志贺氏菌的寡核苷酸探针序列〈400>23gataatgataccggcgctctgctctcc27〈210>24〈211>30〈212>DNA〈213〉用于检测志贺氏菌的寡核苷酸探针序列〈400>24agatagaagtctacctggccttccagacca30〈210>25〈211>26〈212>DNA〈213〉用于检测志贺氏菌的寡核苷酸探针序列〈400>25aggaaatgcgtttctatggcgtgtcg26〈210>26〈211>27〈212>DNA〈213〉用于检测志贺氏菌的寡核苷酸探针序列〈400>26accatggcatgctgtactgaagcgtac27〈210>27〈211>17〈212>DNA〈213>16S-23SrDNA间区上游引物〈400>27tgtacacaccgcccgtc17〈210>28〈211>21〈212>DNA20〈213>16S-23SrDNA间区下游引物〈400>28ggtacttagatgtttcagttc〈210>29<211>17〈212〉DNA〈213〉志贺氏菌ipaH基因上游引物〈400>29tgaccgcctttccgata17〈210>30〈211〉19〈212>DNA〈213〉志贺氏菌ipaH基因下游引物〈400>30gccagtacctcgtcagtca19权利要求一种检测水产品中致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于所述固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针包含从以下序列中选取的一种或多种(1)从沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、潘氏变形杆菌的16S-23SrDNA间区以及志贺氏菌的ipaH毒力基因中选取的DNA序列；(2)上述(1)中选取的DNA序列的互补DNA序列；(3)上述(1)或(2)中选取的DNA序列的互补RNA序列。2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针具有SEQIDN0:2-SEQIDNO:26所示的DNA序列中的一种或多种。3.根据权利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于还包含阳性对照探针、阴性对照探针或荧光探针。4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述阳性对照探针选自细菌16SrDNA保守区中的DNA片段或者其互补的DNA或RNA序列。5.根据权利要求4所述的基因芯片，其特征在于所述阳性对照探针具有SEQIDN0:1所示的DNA序列。6.权利要求5所述的基因芯片的应用，其特征在于在检测志贺氏菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、潘氏变形杆菌中至少一种致病菌的应用。7.根据权利要求6所述的基因芯片的应用，其特征在于包含使用检测引物，其中所述检测引物具有SEQIDN0:27-SEQIDNO:30所示的DNA序列或其互补序列中的至少一种。8.—种试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的基因芯片。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于还包括检测引物，其中所述检测引物具有SEQIDN0:27-SEQIDNO:30所示的DNA序列或其互补序列中的至少一种。10.权利要求8或9所述的试剂盒的应用，其特征在于在检测志贺氏菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、潘氏变形杆菌中至少一种致病菌的应用。全文摘要本发明涉及检测水产品中重要致病菌的基因芯片和试剂盒，该基因芯片包括固相载体和寡聚核苷酸探针，该寡聚核苷酸探针包含以下序列中选取的一种或多种(1)从沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、潘氏变形杆菌的16S-23SrDNA间区以及志贺氏菌的ipaH毒力基因中选取的DNA序列；(2)上述(1)中选取的DNA序列的互补DNA序列；(3)上述(1)或(2)中选取的DNA序列的互补RNA序列。利用本发明的基因芯片和试剂盒检测水产品中的致病菌，操作简便，准确性高，重复性强。文档编号C12Q1/14GK101724686SQ200810172398公开日2010年6月9日申请日期2008年11月3日优先权日2008年11月3日发明者刘蕾,曹勃阳,王敏,王磊申请人:天津生物芯片技术有限责任公司