一种低温溶磷中华根瘤菌及其菌剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种低温溶磷中华根瘤菌及其菌剂，菌种名称为ATHC?2，分类命名为中华根瘤菌属Sinorhizobium sp.，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.10651，保藏日期为：2015年3月20日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明所述菌株ATHC?2能够耐受低温对其生长的影响，且具有较强溶磷活性。通过施用耐低温根瘤菌剂缓解低温胁迫对农业生产中大豆结瘤固氮的影响，提高土壤肥力，减少化肥使用量，提高大豆等农作物产量与品质。CGMCC No. 1065120150320
【专利说明】
一种低温溶磷中华根瘤菌及其菌剂
技术领域
[0001] 本发明属于种植业与肥料相关领域，涉及一种低温溶磷中华根瘤菌及其菌剂。
【背景技术】
[0002] 我国农业生产长期以来采用高投入高产出的发展模式，导致农业生产对化学肥料 严重依赖。化学肥料的大量使用不仅增加农业生产成本，而且易于引起土壤板结，造成农作 物减产。大量未被利用的氮、磷、钾等养分随降雨进入到地下水与江河等生态环境中，导致 江河水体富营养化，生态失衡与环境污染，对农业可持续发展造成威胁。
[0003] 生物固氮具有提高作物产量，培肥土壤维持生态系统平衡的作用，豆科植物与根 瘤菌共生体固氮能力很强，是大豆氮素的重要来源之一。根瘤菌与豆科植物共生体系具有 很强的固氮能力。豆科植物与根瘤菌形成共生固氮体系，占生物固氮量的65%以上，它为豆 科植物提供生长必须氮素营养，增加了作物产量、改善作物品质。豆科植物接种高效固氮根 瘤菌能够减少氮肥使用量，从而降低生产成本增加农民收入，有助于减少大量使用化肥带 来的环境污染风险。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于通过分离我国高炜度低温区大豆根瘤菌，研究其低温条件下结 瘤固氮能力，通过制备耐低温根瘤菌剂缓解低温胁迫对农业生产中大豆结瘤固氮的影响， 提高土壤肥力，减少化肥使用量，提高大豆等农作物产量与品质。
[0005] 本发明实现目的的技术方案如下：
[0006] -种低温溶磷中华根瘤菌，菌种名称为ATHC-2,分类命名为中华根瘤菌属 Sinorhizobium sp.，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号 为CGMCC No.10651，保藏日期为：2015年3月20日，保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号 院3号。
[0007] 含有上述低温溶磷中华根瘤菌的生物菌剂，在含有菌株ATHC-2的发酵液中添加体 积百分比为1-5%羧甲基纤维素，制得有效活菌数量达到2-5亿个/毫升的液体菌剂。
[0008] 含有上述低温溶磷中华根瘤菌的生物菌剂粉末，将权利要求2所述的液体菌剂经 低温冷冻干燥制得粉末菌剂，其有效活菌数量达到1-2亿个/克。
[0009] 本发明的优点和积极效果是：
[0010] 1.本发明所述根瘤菌ATHC-2革兰氏阴性（G-)，能够在Pikovskays's培养基和 NBRIP培养基生长，具有较强溶磷活性。
[0011 ] 2.本发明所述根瘤菌ATHC-2能够在4 °C，7 °C和15 °C条件下在YMA培养基生长，能够 耐受低温对其生长的影响。7 °C和15°C培养条件下，菌株ATHC-2在Ashby无氮固体培养基上 能够正常生长，表明菌株ATHC-2能够在低温下固氮酶保持活性，有利于防范低温对农业生 长造成的危害。
[0012] 3.温室盆栽试验和田间小区实验结果表明，接种权利要求书2所述菌剂能够增加 供试大豆根系结瘤数量，提高大豆地下部与地上部生物量，显著增加供试大豆产量。
[0013] 4.本发明所述菌株ATHC-2能够耐受低温对其生长的影响，且具有较强溶磷活性。 温室盆栽试验与田间小区实验结果表明，与不施用氮肥组及施用50%氮肥组相比，添加本 发明所述菌剂能够增加供试大豆根系结瘤数量，提高大豆地下部与地上部生物量，显著增 加供试大豆产量。该菌剂的使用有助于缓解低温对我国高炜度低温区大豆等农作物生产的 不利影响。通过制备耐低温根瘤菌剂缓解低温胁迫对农业生产中大豆结瘤固氮的影响，提 高土壤肥力，减少化肥使用量，提高大豆等农作物产量与品质。
【附图说明】
[0014] 图1为施用本发明的菌剂对供试大豆品种（黑河68)不同器官生物量的影响，图中 不同小写字母表示各处理间差异显著(p〈〇.05);
[0015] 图2为施用本发明的菌剂对供试大豆品种(科丰6)不同器官生物量的影响，图中不 同小写字母表示各处理间差异显著(p〈〇.05)。
【具体实施方式】
[0016] 下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术 手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发 明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背 离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改 动也属于本发明的保护范围。
[0017] -种低温溶磷中华根瘤菌，筛选及鉴定过程如下：
[0018] 本发明菌株ATHC-2分离自吉林省延吉市安图县大豆根瘤。将实地采集大豆新鲜根 瘤，放置与无菌离心管中迅速带回实验室，通过无菌水大量冲洗去除根瘤表面附着泥土，加 95 %乙醇浸泡2-3min后，加入70 %乙醇浸泡5min，弃去乙醇加入3 %次氯酸钠浸泡6min，弃 去次氯酸钠溶液，大量无菌水冲洗4-5次。将表面消毒后根瘤在准备好的YMA培养基上挤碎 涂布，28 °C培养3-7d，设置无菌水冲洗液对照。将YMA培养基上长出菌落，通过形态观察挑选 与根瘤菌菌落形态特征相似菌落通过平板划线法分离纯化，挑选单菌落进行斜面与甘油管 保藏待用。通过形态学和16S rDNA序列分析鉴定结果表明，菌株ATHC-2属于中华根瘤菌属 (Sinorhizobium sp.)，现保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保 藏号为CGMCC No. 10651，保藏日期为：2015年3月20日，分类命名为中华根瘤菌属 (Sinorhizobium sp.)，保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0019] 本发明通过分离筛选到的耐低温溶磷中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)，ATHC_2， 实验室生理生化特性研究表明，菌株ATHC-2能够在Pikovskays ' s培养基和NBRIP培养基生 长，具有较强溶磷活性。低温胁迫试验结果表明，菌株ATHC-2能够在4°C_15°C低温条件下正 常生长，且能够保持固氮酶活性。温室盆栽试验及田间小区实验结果表明，接种含有ATHC-2 的菌剂能够增加供试大豆根系结瘤数量，提高大豆地下部与地上部生物量，显著增加供试 大豆产量。
[0020]本发明还提供一种含有上述低温溶磷中华根瘤菌的固体生物菌剂，制作方法如 下:通过添加羧甲基纤维素（1 % -5 % v/v)制得含有菌株ATHC-2有效活菌数量达到2-5亿个/ 毫升，液体制剂经真空低温冷冻干燥法制得，制成品体积小，质量轻，便于运输保存，其有效 活菌数量达到1-2亿个/克。
[0021]本发明还提供一种液体根瘤菌剂的制备方法，大豆根瘤菌Sinorhizobium sp.ATHC-2的活化，将-80°C甘油保藏根瘤菌菌种在超净工作台中室温融化，用移液枪吸取 融化后菌液1〇〇μ1，滴加于250ml三角瓶中的无菌液体TY培养基，置于摇床中28°C，180rpm条 件下培养48h。吸取活化后菌液100μΙ，分别滴加与三只准备好的无菌YMA平板，恒温培养箱 中28°C培养3d，待菌落形成，采用划线法与常规染色检测菌株纯度与活性。
[0022]通过镜检确定菌株ATHC-2纯度后，吸取上述TY培养基菌株培养液，按1 %接种量接 种于3瓶500ml灭菌后冷却至室温TY培养基，28°C，180rpm条件下培养72h，将菌液无菌条件 下转移至灭菌后50ml离心管中，离心法收集菌体（10000rpm，10min)，重复上述操作。将收集 到的菌体加入无菌水反复震荡洗涤三次，离心弃去上清液，加入0.9 %无菌生理盐水，震荡 后悬浮所得菌体备用。无菌条件下吸取上述悬浮液4ml，测定其600nm下吸光度，同时进行梯 度稀释平板法检测活菌数量。通过上述制备过程得菌液添加粘附剂甲基纤维素（1%-5%ν/ v)浓缩制得不同规格的液体制剂密封包装，有效活菌数量达到2-5亿个/毫升。
[0023]菌剂的使用方法为:液体菌剂稀释50-100倍，浸泡植物种子0.5-1小时后播种。固 体制剂按1:20比例溶解于水中，浸泡种子0.5-1小时后播种。
[0024] 本发明筛选的菌及制备的菌剂的相关特性试验如下：
[0025] -、试验处理
[0026] 温室盆栽与田间小区实验处理：
[0027]⑴未接菌对照组(盆栽）；
[0028]⑵添加菌剂ATHC-2组(盆栽）；
[0029] (3)不施用氮肥组（田间）；
[0030] ⑷施用50 %氮肥组（田间）；
[0031] (5)不施用氮肥添加菌剂ATHC-2组（田间）。
[0032] 每个处理设5个重复。上述处理分别在温室盆栽和田间小区完成。其中人工气候室 培养条件为：日光照时长为14h，黑夜时长10h，白昼时段温度为26 ± 2°C，黑夜时段温度为20 ± 2 °C，湿度为 60 %-70 %。
[0033] 1.根瘤菌ATHC-2溶解无机磷酸盐试验
[0034] 菌株ATHC-2溶磷试验采用添加 0 · 5 %磷酸三钙的Pikovskays ' s培养基和NBRIP培 养基（Γ1: : glucose，10g:Ca3(P04)2,5g;MgC12W6H20,5g;MgS047H20,0.25g ;KCl，0.2g; (NH4)2S04,0. lg;琼脂粉15g)。配制上述培养基分装于250ml三角瓶中每瓶100ml，121°C， 30min灭菌室温冷却后滴加，对数期菌种悬液(0D6m = 1.0)。30 °C，培养3d，7d后观察记录。每 组实验设3个重复。
[0035] 2.根瘤菌ATHC-2低温生长与固氮试验
[0036] 接种对数期菌株ATHC-2于YMA固体平板，4 °C和7 °C下连续培养，分别于3d和7d观察 生长情况并记录。将菌株ATHC-2接种于Ashby无氮固体培养基，4°C，7°C和15°C下连续培养， 分别于3d和7d观察生长情况并记录。
[0037] 3.温室条件下接种根瘤菌ATHC-2试验
[0038]挑选饱满健全大豆品种:科丰6号和黑河68各约100粒，以无菌水冲洗去种子所带 泥土，自来水漂洗去掉泥土，3%NaC10表面消毒15min，无菌水漂洗5次。将表面消毒后种子 浸泡于稀释100倍的菌体悬浮液中，置于恒温培养箱28°C，培养lh。分别捞出两种大豆种子， 室温阴干后播种。以无菌水浸泡作为对照组。温室大棚培养30d取样收获。
[0039] 5.田间小区实验
[0040]通过拌种法接种权利要求书2中所述菌剂，在天津滨海新区中塘镇南台村开展田 间小区实验。供试大豆品种:科丰6号，试验小区采用随机区组设计方法，小区面积约6500平 方米。试验密度:40万株/公顷。播种方法:人工开沟单粒点播，人工覆土镇压。收获方法:去 边行全区人工收获，人工脱粒，淸杂去水后统计地上部与地下部生物量，产量等指标。
[0041 ]通过对本发明所述菌剂实验室生理特性研究表明，菌株ATHC-2能够耐受低温对其 生长的影响，且具有较强溶磷活性，有利于防范我国北方地区低温对农业生长造成的危害。 温室盆栽试验与田间小区实验结果表明，与不施用氮肥组及施用50%氮肥组相比，添加本 发明所述菌剂能够增加供试大豆根系结瘤数量，提高大豆地下部与地上部生物量，显著增 加供试大豆产量。该菌剂的使用有助于缓解低温对我国高炜度低温区大豆等农作物生产的 不利影响。通过制备耐低温根瘤菌剂缓解低温胁迫对农业生产中大豆结瘤固氮的影响，提 高土壤肥力，减少化肥使用量，提高大豆等农作物产量与品质。
[0042]二、结果与分析
[0043] 1.菌株ATHC-2溶磷特征分析
[0044] 菌株ATHC-2能够在Pikovskays ' s培养基NBRIP培养基生长，通过30°C，3d和7d培养 结果表明，菌株G1能够在上述两种添加难溶性无机磷酸盐的培养基中正常生长，且溶磷活 性显示为阳性，表明菌株G1具有溶解难溶性无机磷酸盐的能力。
[0045] 2.菌株低温生长与固氮研究
[0046] 通过YMA培养基在4°C，7°C和15°C条件下生长与固氮研究结果表明，菌株ATHC-2能 够在7 °C和15 °C条件下在YMA培养基正常生长，而在4 °C条件下长势较弱。7 °C和15 °C培养条 件下，菌株ATHC-2在Ashby无氮固体培养基上能够正常生长，表明菌株ATHC-2能够在低温下 固氮。
[0047] 3.添加根瘤菌对不同品种大豆生物量的影响
[0048] ⑴通过温室盆栽试验研究添加 ATHC-2菌剂对两种大豆不同器官生物量的影响。结 果表明，添加 ATHC-2菌剂能够增加供试大豆黑河68根系，茎，叶片和豆荚干重，其中根，茎和 豆荚与对照比达显著水平(P〈〇.05)。与未接菌对照相比，添加 ATHC-2能够显著增加供试大 豆科丰6号根，茎和叶片生物量(p〈0.05)。如图1，2所示。
[0049] ⑵田间小区实验结果表明。添加 ATHC-2菌剂能够增加供试大豆根系结瘤数量，提 高大豆地下部与地上部生物量，显著增加供试大豆产量。如表1，2所示。
[0050] 表1田间小区实验处理大豆鲜重、干重及收获物干重表(单位:g)
[0051]
[0052] 注:0 % N为不施用氮肥组;50 % N为施用50 %氮肥组；
[0053] 表2添加 ATHC-2菌剂对大豆株高及产量影响
[0054]
[0055] 注:0 % N为不施用氮肥组;50 % N为施用50 %氮肥组·
[0056] ATHC-2的 16S rDNA序列如下：
[0057] GGGCGGCAGGCTTACACATGCAAGTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTA CCCTTTTCTACGGAATAACGCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGAGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGGAAA GGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGG ATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGC GCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATG ACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGG AATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATTGTTAAGTGAGGGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCC TTTCATACTGGCAATCTAGAGTCCAGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGA GGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCTGGAACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATT AGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCAGTTTACTGTTCGGTGGCGCAGCTAACG CATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG GAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATCCCGATCGCGGATACGAGAGATCG TATCCTTCAGTTCGGCTGGATCGGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAG TCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGC CGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGA CAGTGGGCAGCGAGACCGCGAGGTCGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGT GCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCC CGTCACACCATGGGAGTTGGTTCTACCCGAAGGTAGTGCGCTAACCGCAAGGAGGCAGCTAACCACGGTAGTCAGCG AAT
【主权项】
1. 一种低温溶磷中华根瘤菌，其特征在于:菌种名称为ATHC-2，分类命名为中华根瘤菌 属Sinorhizobium sp.，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏 号为CGMCC No.10651，保藏日期为：2015年3月20日，保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1 号院3号。2. 含有权利要求1所述的低温溶磷中华根瘤菌的生物菌剂，其特征在于：在含有菌株 ATHC-2的发酵液中添加体积百分比为1-5%羧甲基纤维素，制得有效活菌数量达到2-5亿 个/毫升的液体菌剂。3. 含有权利要求1所述的低温溶磷中华根瘤菌的生物菌剂粉末，其特征在于:将权利要 求2所述的液体菌剂经低温冷冻干燥制得粉末菌剂，其有效活菌数量达到1-2亿个/克。
【文档编号】C12R1/01GK105838655SQ201610415006
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】郭军康, 郭瑾, 卢书华, 冯人伟, 王瑞刚, 丁永祯
【申请人】农业部环境保护科研监测所, 天津吉麦生态农业技术研究院