专利名称：骨骼肌细胞的诱导分化方法
技术领域：
本发明涉及一种从骨髓基质细胞(骨髄間質細胞)诱导分化为骨骼肌细 月包的方法。
背景技术：
目前针对肌肉疾病、尤其是作为骨骼肌肉病变性疾病的肌肉营养不 良症等尚无有效治疗方法。如果可以由患者本身的骨髓基质细胞制造骨 骼肌细胞，便有可能进行自身移植，并成为一种有效治疗方法。另外， 由患者自身的骨髓基质细胞生成的骨骼肌细胞的用途不仅仅局限于上 述再生性疗法的治疗方面，还可以利用于推测将在未来开发的人工器官 等工程方面的用途中。由于在培养水平可容易的制备肌肉细胞，因此还 可以被用于制造杂交型的人工器官等。由骨髓基质细胞诱导分化为骨骼肌的方法，已知有特开2003 -1441"号公报中记载的方法。该方法包括以下几个必需的步骤(1) 从骨髓分离培养骨髓基质细胞的步骤；(2)添加脱曱基化剂(5-氮杂 胞嘧啶核苷)的步骤；(3 )添加cAMP增强作用性药物或者cAMP类 似物(弗司扣林(forskolin ))、及/或细胞分化生长作用性因子(bFGF、 PDGF-AA、 Heregulin)的步骤；(4)在细胞中导入Notch基因及/或 Notch信号传导相关基因进行培养的步骤；(5)将导入基因的细胞与未 导入基因的细胞共同培养的步骤；及(6)添加cAMP增强作用性药物 或cAMP类似物(弗司扣林)的步骤。但是，上述方法含有6个步骤，存在操作非常繁瑣的问题。因操作 繁瑣要进行大量步骤而增加了不确定性因素，导致诱导率降低。另外，于选择性的诱导分化骨骼肌的方法。此外，在该方法中还使用含有肌肉 细胞之外的要素的混合体系，因此从安全性考虑，该方法诱导的骨骼肌 细胞在临床应用时存在问题。
发明内容
本发明的目的为提供一种从骨髓基质细胞诱导分化为骨骼肌细胞的方法。更具体而言，本发明的目的为提供一种相比在特开2003 -144155号公报中公开的方法更加有效和方便、且再现性好的从骨髓基质 细胞诱导分化为骨骼肌细胞的方法。本发明人为了解决上述课题进行了深入的研究，结果发现在从骨髓 基质细胞诱导分化为骨骼肌细胞的过程中，可以通过省略作为在特开 2003 - 144155号公报中公开的方法中所必需的步骤的(2)添加脱曱基 化(5-氮杂胞嘧啶核苷)的步骤、(5)将导入基因的细胞与未导入基 因的细胞共同培养的步骤、及(6 )添加cAMP增强作用性药物或cAMP 类似物(弗司扣林)的步骤，以及如上所述地对全部步骤的操作进行简 化，能够飞跃性地提高诱导分化的效率，从而有效的制备骨骼肌细胞。 本发明是基于上述发现而完成的。也即，通过本发明可提供一种方法，是从骨髓基质细胞诱导分化为 骨骼肌细胞的方法，其包含下述步骤(a)在骨髓基质细胞(其中，该骨髓基质细胞为未经过脱曱基化 剂处理的细胞)的培养物中，添加选自环状AMP (以下也简称为 "cAMP")增强作用性药物、cAMP类似物、及细胞分化生长作用性因 子中的1种或以上的物质进行培养的步骤；(b )在上述(a )步骤中得到的细胞中导入Notch基因及/或Notch信号传导相关基因进行培养以获得成肌细胞培养物的步骤(其中，上述 培养物不包含导入基因的细胞和未导入细胞的共同培养物)；以及(c)在上述步骤(b)中得到的成肌细胞培养物中添加Notch 配体而进行培养的步骤。通过上述发明的优选的方案，可提供一种在上述步骤(c)中使用 Jaggedl蛋白作为Notch配体的上述方法、以及将上述步骤(c)在无血 清培养基中进行操作的上述方法。另外，从其它角度出发，通过本发明可提供一种方法，是从骨髓基 质细胞诱导分化为成肌细胞的方法，其包含以下步骤(a)在骨髓基 质细胞(其中，该骨髓基质细胞为未经脱甲基化剂处理的细胞)的培养 物中，添加cAMP增强作用性药物、cAMP类似物、及细胞分化生长作 用性因子中的1种或以上的物质进行培养的步骤；以及(b)在上述步
进行培养的步骤(其中，上述培养物不包含导入基因的细胞和未导入细 胞的共同培养物)。进一步从其它角度出发，通过本发明可提供一种方法，是从成肌细 胞诱导分化为骨骼肌细胞的方法，其包含在成肌细胞培养物中添加Notch配体进行培养的步骤。另外，通过本发明可提供通过上述方法得到的骨骼肌细胞或成肌细 胞、以及含有该骨骼肌细胞或成肌细胞的用于肌肉疾病的治疗的的医药 组合物、以及用于上述医药组合物的制造的上述骨骼肌细胞或成肌细胞 的使用用途。进一步，通过本发明可提供一种方法，是治疗肌肉疾病的 方法，其包含针对必须进行骨骼肌细胞或成肌细胞的给药的患者，将通 过上述方法得到的骨骼肌细胞或成肌细胞以有效剂量进行局部给药或 全身性给药的步骤；还提供一种上面所述的方法，其骨骼肌细胞或成肌 细胞为由患者自身或其他来源的骨髓基质细胞诱导分化而成的细胞。
具体实施方式
本发明的方法为从骨髓基质细胞诱导分化为骨骼肌细胞的方法，其 包含下述步骤(a)在骨髓基质细胞(其中，该骨髓基质细胞为未经 脱曱基化剂处理的细胞)的培养物中，添加cAMP增强作用性药物、 cAMP类似物、及细胞分化生长作用性因子中的l种或以上的物质进行 培养的步骤；以及(b)在上述步骤(a)中得到的细胞中导入Notch基 因及/或Notch信号传导相关基因进行培养的步骤(其中，上述培养物 不包含导入基因的细胞和未导入细胞的共同培养物)；以及(c)在上 述步骤(b)中得到的成肌细胞培养物中添加Notch配体进行培养的步 骤。本发明的方法的特征为，不含有在已记载的骨骼肌细胞诱导分化方 法(含有同公报第
段落等中记载的6步骤的方法)中所必需的 步骤的(2)添加脱曱基化剂(5-氮杂胞嘧啶核苷)的步骤；(5)将 导入基因的细胞与未导入基因的细胞共同培养的步骤、及(6 )添加cAMP 增强作用性药物或cAMP类似物(forskolin)的步骤。特别是不含有将 导入基因的细胞与未导入基因的细胞共同培养的步骤是本发明的主要 特征。本发明的方法可用于包含人在内的哺乳动物的骨骼肌细胞的制 备，优选的对象为人。本发明的个步骤的细节可通过参照上述特开2003-144155号公报，得到更深入的理解。上述公报中公开的全部参照内容 被包含于本说明书所7>开的内容中。本发明的方法中使用的骨髓基质细胞意指存在于骨髓中的除造血 系统以外的间充质细胞，可被认为是可以分化为骨骼、软骨、或脂肪细 胞等的细胞。骨髓基质细胞可通过Thyl及2为"+ "，或者(3 1-交联 为"+ "、以及CD34为"-"等标准进行识别。骨髓基质细胞的制备 方法在特开2003 - 144155号公报中有详细且具体的说明，本领域人员 可以容易的获得骨髓基质细胞。例如，从骨髓提取骨髓基质细胞，通过 在标准的基础培养基中加入血清的培养基中对上述细胞进行培养可制 备骨髓基质细胞的培养物。例如，优选对骨髓基质细胞进行3~4代传代培养后，制备例如细胞密度调节为noo细胞/cn^左右的培养物。作为标准的培养基，例如可使用Eagle's oc改进的极限必需培养基(a -MEM)等，可使用胎牛血清作为血清，或如果是人的情况下使用人血清。 本发明的方法中使用的骨髓基质细胞没有必要进行特开2003 - 144155 号公报中记载的方法中采用的用脱曱基化剂进行处理的操作。本发明的的步骤，从而可以有效地分化诱导骨骼肌细胞。例如可以使用弗司扣林作为cAMP增强作用性药物或cAMP类似 物，但并无限定，可适当的采用1种或2种以上的cAMP增强作用性药 物或cAMP类似物。cAMP增强作用性药物或cAMP类似物的浓度并无 特别限定，例如可以为0.001nM~ 100juM左右，优选为500nM ~ 50 ju M 。可以用例如石成基性成纤维细胞生长因子(basic-Fibroblast growth factor ( bFGF ))、血小板来源生长因子(platelet-derived growth factor-AA(PDGF-AA))、或Neuregulin (商品名Heregulin)等作为细胞分化生 长作用性因子，还可以组合使用它们的2种或2种以上的组合。细胞分 化生长作用性因子的浓度并无特别限定，例如可为0.001ng/ml~ lOOy g/ml左右，优选为0.5ng/ml 2jug/ml左右。还优选组合使用cAMP增 强作用性药物或cAMP类似物与细胞分化生存作用性因子。例如，将弗 司扣林(5 ju M ) 、 bFGF ( 10ng/ml) 、 PDGF - AA ( 5ng/ml) 、 Neuregulin(200ng/ml )添加至含有10 %胎牛血清(FBS )的MEM Eagle Modification 培养基中进行骨髓细胞的培养。此阶段做为骨骼肌千细胞的标记的Pax7 被表达，以此为指标进行上述药物的添加及培养即可。Notch基因及/或Notch信号传导相关基因的导入，可以通过例如 使用哺乳动物表达载体的脂质体转染法进行，但并不限于该方法，还可 采用其它适当的基因导入方法。例如，还可导入含有Notch细胞质结构 域(NICD ) cDNA的pCI-neo-NICD质粒(特开2003 - 144155号/>报的 实施例1中记载的质粒)。进行上述基因导入以后，优选对导入了基因 的细胞进4亍选4奪。该选择例如可基于通过添加碌u酸G418引入的新霉素 耐性进行选择，通常经过10-14天左右完成。选择的细胞优选培养至 细胞达到100%汇合的状态。如上所述获得的细胞为成肌细胞集落，细 胞的形态发生变化，作为骨骼肌标记的MyoD、 Myogenin等的转录因子 将变得可被检出。即在于特开2003 - 144155号公报中的方法中，采用 了在导入基因或进行上述选择以后，导入基因后的细胞与未导入基因的 细胞共同培养的步骤，但在本发明的方法中不进行上述共同培养。本发 明的另一个特征为，省略了从前认为是必须的上述共同培养的步骤，从 而可以有效的诱导分化骨骼肌细胞。因此，本发明的方法中，在进行上 述基因导入或上述选择以后，不进行共同培养而进行步骤(c)。接下来，根据步骤(c),进行用于从得到的成肌细胞诱导分化成 熟骨骼肌细胞的融合诱导。该步骤可通过在成肌细胞的培养物中添加 Notch配体进行培养而进行。Notch配体可使用例如Jagged 1蛋白(Lindsell， C.E.et.al.， Cell, 80， pp.909-917， 1995 ) 。 Jaggedl蛋白的 浓度并无特别限定，例如可为1 20^ig/ml左右，优选为5 Mg/ml左右。 培养基的种类并无特别限定，可使用常用的基础培养基，例如MEM Eagle Modification培养基等。可在培养基中添加10%左右的FBS等血 清，可优选使用无血清培养基。例如通过使用TTS - serum free medium(Yoshida， N.et.al.， J.CellSci.， 111， pp.769 - 779, 1998)等无血清培 养基可以制备适用于临床的骨骼肌细胞。通过上述融合诱导， Myf6/MRF4等成熟标记被表达，且诱导分化了肌球蛋白重链(Myosin heavy chain )或骨骼肌球蛋白(skeletal myosin)呈阳性的多核的骨骼肌 细胞。该骨骼肌细胞在培养下显示自发的收缩运动。在特开2003 -144155号公报中记载的方法中，将导入基因后的细胞与未导入基因的细 胞进行共同培养后，在培养物中加入cAMP增强作用性药物或cAMP类 似物以进行成熟骨骼肌细胞的分化诱导，在本发明的方法中，不必在培 养物中添加cAMP增强作用性药物或cAMP类似物。本发明的另一特征 为，省略了从来认为必需的cAMP增强作用性药物或cAMP类似物的添 加，仍然能够充分的诱导分化功能成熟的骨骼肌细胞。然后，通过将得到的骨骼肌细胞培养物以每1孔1细胞的比例进行 有限稀释可进行骨骼肌细胞的克隆化，可以从通常约90%左右的生长克 隆中再次得到具有收缩功能的骨骼肌细胞集落。该细胞集落为不含有其 它要素的基本上纯粹的肌肉细胞所构成的集落，可特别适用于治疗肌肉 疾病等用途。进一步，得到的细胞集落含有骨骼肌干细胞，即使进行多 次传代培养也可以稳定的制备肌肉细胞。通过本发明的方法得到的骨骼肌细胞，可用于以下的治疗用途例 如患有肌肉营养不良等肌肉疾病的患者的局部或全身性给药；交通外伤 或烫伤等引起的肌肉缺损或损伤时的肌肉填补；脑血管障碍、脊髓损 伤、神经病变性疾病引起的废用性肌肉萎缩症中的肌肉重建；或^I宛神经 麻痹等神经障碍伴随的肌肉萎缩的治疗等，但通过本发明得到的骨骼肌 细胞的用途并不限定与上述例举的特定的用途。例如，可使用从患者自 身提取的骨髓基质细胞通过本发明的方法制造骨骼肌细胞，对患者进行通过本发明的方法得到的骨骼肌细胞为含有干细胞的、基本上纯粹的骨 骼肌细胞集落，通过移植，干细胞在生物体上附着生长，可针对重复性 肌肉损伤进行再生，在临床应用中有着巨大的优点。实施例以下，通过实施例对本发明进行更深入具体的说明，但本发明的范 围并不局限于下述实施例。实施例1根据特开2003 - 144155号公报中记载的方法，从骨骼肌经诱导的 成体大鼠(Wister种)及人的骨髓中提取基质细胞(間質細胞)进行培养。 使用在Minimum Essential Medium ( MEM) Eagle Modification ( Sigma 公司，M4526)中添加了 15%胎牛血清(Biowhittaker公司，14 - 501F、 Lot#61 - 1012)的产品作为培养基。经过4代传代培养，在达到80-90 %的细胞密度的时间点时分散细胞将密度调节至1800 ~ 1900cell/cm2， 次日在添加了 5 y M弗司扣林(Calbiochem, 344273 ) 、 10ng/ml成纤维 细胞生长因子(P印rotechECLTD, 100-18B) 、 5ng/ml血小板来源生
长因子-AA ( Peprotech EC LTD， 369 - HB ) 、 200ng/ml Heregulin ( R &D Systems, 396 - HB )的培养基中交换培养3天。然后，按照特开2003 - 144155号公报实施例1中记载的方法在细胞中导入Notch细胞内结构 域的基因。在导入的第二天以200ng / ml的浓度添加G418石黄酸盐 (GibcoBRL, 83 - 5027 )进行10天的导入细胞的选择。细胞数恢复大 致达到100%汇合以后，通过在含有10 。/。FBS的MEM Eagle Modification 培养基中添力口 5 ju g/ml Jagged 1蛋白(recombinant Rat Jaggedl/Fc Chimera, GTTECHNE公司，3599 )培养5天进行融合诱导。在该培养中，在显 微镜水平下观察到细胞在局部出现的融合的多核的骨骼肌细胞并呈经 时性的增加，形成肌球蛋白重链及骨骼肌球蛋白呈阳性的多核骨骼肌细 胞，在培养下显示自发的收缩运动。在这些细胞中确认了 Myf6/MRF4 等成熟标记的表达。骨骼肌细胞的诱导效率在融合诱导第14天约为40 %。作为对照，采用特开2003 - 144155号公报中记载的经脱甲基化处 理、共同培养、以及其后伴随弗司扣林的添加的方法进4亍骨骼肌细胞的 诱导分化时，骨骼肌细胞的诱导率为20.8±3.5%。 实施例2按照和上述1同样的方法进行骨骼肌细胞的分化诱导。其中，在诱 导分化中使用无血清培养基。无血清培养基使用在含有lOpg/ml胰岛 素、5jug/ml铁传递蛋白、lOnmol亚硝酸钠、lmg/ml BSA、 60 ju g/ml 卡那霉素的DMEM (该培养基称为"ITS-serum free medium")中添力口 Jaggedl蛋白(recombinant Rat Jaggedl/Fc Chimera, GT TECHNE公司， 3599 )以使最终浓度为5 n g/ml的产品作为培养基。结果，在培养第1 天多核骨骼肌细胞的数目为每个35毫升的培养皿中16个，培养第5天 达到了 664。另一方面作为对照仅以上述无血清培养基(未添加Jaggedl 蛋白)进行培养时，在培养第一天为13，培养第5天为48入该结果显 示，通过在无血清培养基中添加Jaggedl蛋白，可诱导分化为成熟的骨 骼肌细胞。产业实用性通过本发明的方法，与特开2003 - 144155号公报中记载的骨骼肌 细胞的诱导分化方法相比筒化了整个步骤，可简便而有效的制备骨骼肌 细胞。另外，在本发明的方法中，通过步骤(b)对做为骨骼肌细胞的 前体细胞的成肌细胞进行诱导分化后，可对该成肌细胞阶^a性的i秀导分 化为成熟骨骼肌细胞，可对分化阶段及细胞增殖等进行控制。另外，在 本发明的方法中，未使用含有成肌细胞或骨骼月几细胞以外的细胞的混合 体系，可有效的制备基本上纯粹的骨骼肌细胞集落，所得到的骨骼肌细 胞在治疗肌肉疾病时可作为安全的医药品使用。
权利要求
1.一种从骨髓基质细胞诱导分化为骨骼肌细胞的方法，其包含下述步骤(a)在骨髓基质细胞的培养物中，添加选自环状AMP增强作用性药物、cAMP类似物、及细胞分化生长作用性因子中的1种或以上的物质进行培养的步骤，其中，该骨髓基质细胞为未经过脱甲基化剂处理的细胞；(b)在所述(a)步骤中得到的细胞中导入Notch基因及/或Notch信号传导相关基因进行培养以获得成肌细胞培养物的步骤，其中，所述培养不包含导入基因的细胞和未导入细胞的共同培养；以及(c)在所述步骤(b)中得到的成肌细胞培养物中添加Notch配体进行培养的步骤。
2. 如权利要求1所述的方法，其中Notch配体为Jaggedl蛋白。
3. 如权利要求1或2所述的方法，所述步骤(c)在无血清培养基 中进行。
4. 一种从骨髓基质细胞诱导分化为成肌细胞的方法，其包含以下 步骤(a) 在骨髓基质细胞的培养物中，添加cAMP增强作用性药物、 cAMP类似物、及细胞分化生长作用性因子中的l种或以上的物质进行 培养的步骤，其中，该骨髓基质细胞为未经脱曱基化剂处理的细胞；以 及(b) 在所述步骤(a)中得到的细胞中导入Notch基因及/或Notch信号传导相关基因进行培养的步骤，其中，所述培养不包含导入基因的 细胞和未导入细胞的共同培养。
5. —种从成肌细胞诱导分化为骨骼肌细胞的方法，其包含在成肌 细胞培养物中添加Notch配体进行培养的步骤。
6. 如权利要求5所述的方法，其中Notch配体为Jaggedl蛋白。
全文摘要
通过本发明可提供一种方法，是可以有效且简便、再现性好地从骨髓细胞诱导分化为骨骼肌细胞的方法，其包含以下步骤(a)在骨髓基质细胞(其中，该骨髓基质细胞为未经过脱甲基化剂处理的细胞)的培养物中，添加选自环状AMP增强作用性药物、cAMP类似物、及细胞分化生长作用性因子中的1种或以上的物质进行培养的步骤；(b)在所述(a)步骤中得到的细胞中导入Notch基因及/或Notch信号传导相关基因进行培养以获得成肌细胞培养物的步骤(其中，所述培养不包含导入基因的细胞和未导入细胞的共同培养)；以及(c)在所述步骤(b)中得到的成肌细胞培养物中添加Notch配体而进行培养的步骤。
文档编号A61P41/00GK101128578SQ20058004871
公开日2008年2月20日 申请日期2005年12月22日 优先权日2004年12月24日
发明者出泽真理, 星野干雄, 锅岛阳一 申请人:国立大学法人京都大学