专利名称：拟微绿球藻及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物工程领域，具体而言，本发明涉及一种拟微绿球藻 (Nannochloropsis sp)及其应用。
背景技术：
化石能源的大量使用，极大地加剧了大气环境污染和气候变化以及酸雨区面积的增大，寻找新的可持续的环境安全的生物资源来生产生物燃料以替代化石燃料势在必行。 生物柴油(Biodiesel)又是用未加工过的或者使用过的植物油以及动物脂肪通过不同的化学反应制备出来的一种被认为是环保的生物燃料。这种生物燃料可以像柴油一样使用。 生物柴油是已得到证明的燃料，其在能源性质方面可以部分替代化石柴油，是最具发展潜力的液体生物燃料之一。微藻是一类在水中生长的种类繁多且分布极其广泛的低等植物，它是有阳光驱动的细胞工厂，通过微藻细胞高效的光合作用，吸收CO2,将光能转化为脂肪或淀粉等化合物的化学能，并放出02。微藻是光合效率最高的微生物，也是自然界中生长最为迅速的一种低等生物，而且某些微藻可以生长在高盐、高碱环境的水体中，可充分利用滩涂、盐碱地、沙漠进行大规模培养，也可利用海水、盐碱水、工业废水等非农用水进行培养，还可利用工业废气中的co2。因此，微藻生物柴油成为了潜在的能源研究热点。拟微绿球藻(Narmochloropsis sp)细胞个体较小，生长速度快，可进行超高密度培养。在诱导的条件下，拟微绿球藻细胞中会大量积累三脂酰甘油(TAG)，它是生物柴油生产的最好原料。其营养价值丰富，含有较高不饱和脂肪酸和类胡萝卜素，特别是二十碳五烯酸(EPA)和独特的堇菜黄素，EPA含量占细胞含量的4%左右，EPA具有抗血栓形成、调节血脂、抗凝血、扩张血管、降血压、抗心律失常等作用，是中老年人保持健康血脂指标最佳选择。此外，拟微绿球藻被广泛用作为许多水产品幼体的开口饵料或轮虫的饵料。同时，拟微绿球藻可用作商业应用的色素、二十碳五烯酸(EPA)和维生素E的生产藻株。魏东，张学成等在名称为富含EPA的海洋微藻眼点拟微球藻的大规模培养(中国海洋药物，2003，1 :5-10)的文献中公开了一种眼点拟微绿球藻。该文献中的眼点拟微绿球藻在1999年10月间在83. 5m2户外池中大规模获得生物量的平均面积产率为1. 09g/m2 ·(!。
发明内容
由于现有技术中的微藻具有生长速度慢、生物量低，总油脂含量低、或是EPA等长链不饱和脂肪酸含量低等这些缺点，限制了微藻在产业上的应用。因此，本发明提供了一种新的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A，该藻株已于2011年8月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5148。本发明提供的拟微绿球藻(Narmochloropsis sp)ENN1003A的核苷酸序列包括序列1所示的核苷酸序列。序列1为
CCTACGGAAACCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCTAAATGATGAGGTTTAGATAACTTCTCACGCTGCCGACCGAGGCCAGTGGCGCAATCCGAA
AGCTTCACCGAATCATTCAATCGGTAAGTGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAATGCGAGCTGATGACTCGCGTTTACTAGGAATTCCTCGTTCAAGATTAATAGTTGCAATAATCTATCCCTATCACGATGCGCATTTCAAGATTACCCGGTCCTTCCGGACAAGGTTATAAACTCGTTGAACGCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGGACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCCCCAACTTCCTTCGGCCTAGCGCCGAAAGTCCCTCTAAGAAGTCTCTGGCAATGCTAAGCATTCCCAGTACTATTTAGCAGGCGGGGGTCTCGTTCGTTAACGGAATTAACCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCATAGAGTCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTACTATGTCTGGACCTGGTAAGT
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AACAACTTAATGCCAGAATCGCTCTCCCCAAGGATGACAGGAACCAACAATAGTACGGCCCCTTATCGGAACCGACCAGCCGTCCCTGCCAGAAATCCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAGTATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGATCCTCGATAAGGGATTTAAATTGTTCTCATTCCAATTGCCAGAGTTAAACCCCGGCATTGTTATTTATTGTCACTACCTCCCTGTGTCAGGATTGGGTAATTTACGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTCTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCCAATTCTCCGTTACCCGTTAGAGCCATGGTAGGCCAATACCCTACCATCCAAAGCTGATAGGGCAGAAACTTGAATGATTCGTCGCTGGCGAAAGCCGGCGATCCGCAAAGTTATCA
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序列2 为AAGGATCATTACCAAAACATTACATGCCTCCTGGCGTACGCTTCGAGGCATTACACTTCACAACCTGTGCATTGTTTACTCCTGTGAACGCTATACAAGCACGTGC TCCCGGCCACGCCCTGCGATGGTTGCTTTGGATGGTTCCTCGGAACACGTCGAAGCCGTGGCCGAATGTGGGAGGGC GTCTCTAAATATCCTCAAACACCATTCGCAACATTTTATCAACCTTTCCAAACCGATTGTTTATACCTCATTCAAGG CTTTTCTAGTCTTCCGACAGAAAAGCCTGGTGCATGTTTCCATGCGAAACGAGCGCCCGCAATGAAAATACAACTTT CAGCAACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGCGAATTGCAGAATTCC GCGAGTCATCAAACCTTTGAACGCACCTTGCGCTTTCGGGATATGCCCGTTAGCATGTTTGTTGGAGTGTCTGTTAA CCCCAATCACCACCTTGTTGTGACTTCAGAGTCATGCCAAGCAGTCGGTGGACGTTACTTGCTCCCGATACTTCGCC CGCTGCGAATTCTGTTGTCACCTCCTCTGACGAGGAACTGGCCAGAAGCTGGAGTGCGGGCGTGGAGTGAAGTAGGG CCGGCCACATACAGTCACTGGGACCACGCAACTCCTAGAGCTGCCCCCGTGAACGTGACGAGTCTTCTAATCAAGGC AATCCGTTTGCGGTCTAAAAGGTGCTCGTTTAACGGAAGCGCTAGTCTACACCAAACAGTTTCGACTTGGCGGCATC TTCTCGGTGACTTTTAACAAACACCGAGAAAGCCTTTGGACTGATCCTGGCACTCGTTGCCGTGTCATTCCATCTCC AATTCGGACCTCCAATCAAGCAAGGCTACCCGCTGAATTTAA。本发明提供的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A的形态特征为细胞大小为2 5 μ m ；细胞形状为球形或近球形；细胞颜色为绿色或黄绿色；细胞分裂形成两个似亲孢子；细胞内有红色眼点。根据本发明的一个方面，本发明提供的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp) ENN1003A在培养16天时干重达到9g/L ；该微藻的藻粉的总脂含量为藻粉干重的45. 9% (重量百分比)。本发明还提供了拟微绿球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A的以下用途在制备预防和治疗心脑血管疾病的药物或保健品方面的应用；在食品方面的应用；在生产生物燃料尤其是生物柴油中的应用；在废水处理、废气处理、CO2减排方面的应用；在生产色素、 水产品饵料、动物饲料、化妆品方面的应用。本发明通过自然界藻种分离纯化及筛选，获得一株性能良好的拟微绿球藻藻株。由于本发明提供的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp) ENN1003A在培养16天时干重可达到9g/L，10月间户外池中培养平均面积产率可达5 8g/m2 -d,因此具有生物量高、 生长速度快、培养密度高的优势，适合产业化应用。而且本发明提供的藻株的总油脂含量可达60% (重量百分比)，具有油脂含量高的特性，特别适合生物柴油的生产。本发明提供的藻株中的EPA含量为藻粉干重的3% 7. 5% (重量百分比)；花生四烯酸含量为藻粉干重的0.7% 3. 5% (重量百分比)，EPA具有抗血栓形成、调节血脂、 抗凝血、扩张血管、降血压、抗心律失常等作用，是中老年人保持健康血脂指标最佳选择，花生四烯酸具有酯化胆固醇、增加血管弹性、降低血液粘度，调节血细胞功能等一系列生理活性，对预防心血管疾病、糖尿病和肿瘤等具有重要功效，因此本发明提供的藻株可以用于开发用于预防和治疗心脑血管疾病的药物、保健品和食品。本发明提供的藻株中的蛋白质含量为藻粉干重的10 30% (重量百分比)，总油脂含量为藻粉干重的10 60% (重量百分比)，是做营养品的最佳原料来源。本发明提供的藻株作为生长迅速、富含EPA的拟微绿球藻可被广泛用作为许多水产品幼体的开口饵料或轮虫的饵料。此外，其富含蛋白质、各种不饱和脂肪酸和必须氨基酸，可用于开发生产动物饲料。
图1为拟微绿球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A的显微镜检图片。图2为不同藻株18S序列进化树。以莱茵衣藻，三角褐指藻，梅氏小环藻和部分拟微绿球藻(Nannochloropsis)的18S序列为基础，使用邻接法(Neighbor-Joining)制作进化树。图3示出不同藻株ITS序列进化树，以莱茵衣藻，三角褐指藻，梅氏小环藻和部分拟微绿球藻(Nannochloropsis)的ITS序列为基础，使用Neighbor-Joining法制作进化树。图4为Blast获得的部分拟微绿球藻(Nannochloropsis)藻株ITS序列进化树， 使用 Neighbor-Joining 法制作。图 5 示出 ENN1003A 与 UTEX LB2164 (Nannochloropsis oculata)的 OD75tl (Optical Density，在750nm处的吸光度)值变化曲线。图 6 示出 ENN1003A 与 UTEX LB2164 (Nannochloropsis oculata)的叶绿素 a 含量变化曲线。图 7 示出 ENN1003A与UTEX LB2164 (Nannochloropsis oculata)的干重变化曲线。图 8 示出 ENN1003A与UTEX LB2164 (Nannochloropsis oculata)的油脂含量变化。图9为不同水源ENN1003A生物量变化图。图10为不同气源ENN1003A干重变化曲线图。图11为不同气源ENN1003A0D75Q值变化曲线图。图12示出不同水源和气源对ENN1003A油脂累积的影响。图13示出不同水源和气源对ENN1003AEPA含量的影响。
具体实施例方式下面将详细描述本发明的具体实施方式
，这仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。实施例1藻种分离、纯化、筛选在青岛石老人附近海域取水样。向水样中加1/3体积的海水培养基，在25°C、光照强度为50ymOl/m2 · s的条件下培养10天左右，取该水样于显微镜下观察，判断水样中存在的主要物种。调整细胞浓度约为1000个/ml，取100μ 1水样铺于海水培养基的固体琼脂板上，在25°C、光照强度为50ymOl/m2 · s左右的条件下培养两周左右，即可看到单藻落长出，用接种环或无菌牙签挑取藻落接种于表1示出的海水培养基中培养。表1海水培养基配方
" 3 克/升
NaCl27.0
权利要求
1.一种保藏号为 CGMCC No. 5148 的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A。
2.根据权利要求1所述的拟微绿球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A，其核苷酸序列包括序列1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的拟微绿球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A，其核苷酸序列包括序列2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的拟微绿球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A，其细胞大小为 2 6μπι ；细胞形状为球形或近球形；细胞颜色为绿色或黄绿色；细胞内有红色色素点。
5.根据权利要求1所述的拟微绿球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A，其藻粉的总油脂含量为藻粉干重的10% 60%。
6.根据权利要求1所述的拟微绿球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A，其藻粉的EPA 含量为藻粉干重的3% 7.5%。
7.根据权利要求1所述的拟微绿球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A，其藻粉的花生四烯酸含量为藻粉干重的0. 7% 3. 5%。
8.根据权利要求1所述的拟微绿球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A，其藻粉的蛋白质含量为藻粉干重的10 30%。
9.权利要求1所述的拟微绿球藻(Nannochloropsissp) ENN1003A在制备预防和治疗心脑血管疾病的药物或保健品方面的应用。
10.权利要求1所述的拟微绿球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A在生产或制备食品方面的应用。
11.权利要求1所述的拟微绿球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A在生产生物燃料中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其中所述生物燃料为生物柴油。
13.权利要求1所述的拟微绿球藻(Nannochloropsissp) ENN1003A在废水处理、废气处理、(X)2减排方面的应用。
14.权利要求1所述的拟微绿球藻(Nannochloropsissp) ENN1003A在生产色素、水产品饵料、动物饲料、化妆品方面的应用。
全文摘要
一种保藏号为CGMCC No.5148的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A。本发明提供的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A具有生物量高的特性，该藻株具有生长速度快、培养密度高的优势，适合产业化应用。而且本发明提供的藻株由于油脂含量高而特别适合生物柴油的生产。本发明提供的藻株富含EPA等长链不饱和脂肪酸并且蛋白质脂肪含量总和达到60％以上，适合用于保健品、医药品、食品的开发。
文档编号A23L1/30GK102492626SQ201110425210
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者吴洪, 尹顺吉, 张成武, 王冰, 陈传红, 马建源 申请人:新奥科技发展有限公司