专利名称：一株富含十六碳二烯酸的海洋微拟球藻及提高其生物量和油脂含量的培养方法
技术领域：
本发明涉及一株富含十六碳二烯酸的海洋微拟球藻及提高其生物量和油脂含量的培养方法，属于海洋微藻生物技术领域。
背景技术：
随着经济的不断发展，以石油为基础的化石燃料已经不能满足人类日益增长的能源需求，同时化石燃料的枯竭及其使用引起的温室效应产生的环境问题，促使人们把目光转向新型清洁能源的开发利用。可再生生物能源的开发利用对于资源节约型环境友好型经济的可持续发展具有重要意义。以微藻为原材料生产生物柴油已经引起国内外的普遍关注。微藻是一个太阳光驱动的细胞工厂，通过高效的光合作用吸收CO2，将光能转换为化学能并释放氧气，微藻能源是缓解能源危机，降低温室效应的一种简单有效的途径。地球上有着丰富的海水资源，海洋微藻是海洋生态系统中有机物和能量的主要提供者，与其他原料相比，海洋微藻具有可以在海水中快速生长繁殖，不与粮争地，不与人争水的优点，从微藻生物柴油产业中脱颖而出。有报道利用工业生产中产生的CO2，将微藻作为细胞工厂来加工生产乙醇和某些高附值产物如丁醇和丙酮等。某些微藻在特定的培养条件下能产生一些天然无害的食品添加剂如omega-3脂肪酸，EPA, DHA等，同时也能在体内积累叶绿素或者类胡萝卜素等化妆品颜色添加剂。微藻油脂中多不饱和脂肪酸是不饱和脂肪酸的主要成分，其中十六碳二烯酸能提高细胞对低温的耐受性(Wada
H.,Gombos Z., Murata N., 1994.Contribution of membrane lipids to the abilityof the photosynthetic machinery to tolerate temperature stress.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.91，4273-4277)，并且抑制拓扑异构酶I活性及抗金黄色葡萄球菌能力(Carballeria N.M., Betancourt J.B., Orellano E.A., Gonzalez, 2002.Total synthesisand biological evaluation of(5Z, 9Z)-5, 9-hexadecadienoic acid, an inhibitorof human topoisomerase 1.J.Nat.Prod.65，1715-1718),另外，十六碳二稀酸单半乳糖二酸甘油还具有抗肿瘤活性(Morimoto T., Nagatsu A., Murakami N.et al., 1995.Ant1-tumour-promoting glyceroglycolipids from the green alga,Chlorellavulgaris.Phytochem.5, 1433-1437),但目前利用微藻大规模生产十六碳二烯酸的海很少报道。微藻本身可以通过发酵的方法生产清洁燃料，如甲烷，氢气等；另外，藻体本身也可用于畜牧水产养殖的饲料饵料。因此，微藻有着很高的综合利用价值。微拟球藻(拉丁名Nannochloropsis oceanica)是海洋微藻的一种，也普遍存在于淡水，主要作为养殖业中鱼饲料的生产，近年来，越来越多的研究表明，微拟球藻在氮饥饿的条件下油脂含量能达到68%，而且其中长链饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸是油脂的主要组成部分，是生物柴油生产的良好原料。但是，目前关于海洋微拟球藻的研究主要集中于水产养殖的饵料，对于油脂积累等报道较少。另外，许多研究表明氮源浓度在微拟球藻油脂积累中起着重要作用， 虽然氮限制的培养条件能获得较高的油脂含量，但是微藻在氮缺乏条件下的生物量却很低。因此，通过选择合适的培养条件在微拟球藻生物量和油脂积累中有着重要意义。有文献报道称通过连续置换一半的培养基或者在培养过程中添加新的营养物质，均可以提高生物量积累速率；但是大体积置换培养基会引起微藻较长时间重新适应培养环境的改变，而且连续置换培养基耗能并造成水资源的浪费，不适于工业大规模培养。因此在微拟球藻培养的后期，可考虑缩小置换体积。本发明针对以上问题，开发了微拟球藻高生物量和高油脂含量的培养基，并优化了连续培养的置换体积，提高了产油效率。本发明中的微拟球藻油脂含量较高，是具有开发前景的微藻藻种。
发明内容
本发明的目的在于提供一株富含十六碳二烯酸的海洋微拟球藻及提高其生物量和油脂含量的培养方法，提供在不同的培养基中，藻株油脂脂肪酸中长链饱和和不饱和脂肪酸含量和十六碳二烯酸含量，了解该藻株成为生物柴油炼制优质原料的重要性。本发明采用的技术方案是:一株具有高十六碳二烯酸含量的海洋微拟球藻藻株(Nannochloropsis oceanica),所述海洋微拟球藻藻株的登记入册编号为CGMCC N0.6443,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年8月21日。所述的一株具有高十六碳二烯酸含量的海洋微拟球藻藻株的培养方法，在用自然海水配置的f/2培养基中，培养温度为25±1°C，光暗比14/1011，光照强度μmol m-2s-1,每天手摇两次；在培养5-7天后，离心收集藻体并转移至含有不同硝酸盐浓度的f/2和BGll培养基中，25 ± 1 °C，光暗比14/10h，光照强度60 μ mol πΓΥ1，含有2%C02空气通气量为
0.2vvm,培养体积为1L ;通过1/5培养基置换，最后在含有37.5mg/L硝酸钠的f/2培养基中获得海洋微拟球藻藻株DUT01。本发明的有益效果是:上述的海洋微拟球藻藻株DUT01属于褐藻门，褐藻目，球藻属。藻株为绿色球形，直径2-5 μ m，生长速度快。通过1/5新鲜培养基置换，该藻株在含有37.5mg/L的f/2培养基中油脂含量能达到64.3%，在含油1.5g/L的BGll培养基中生物量能达到1.4g/L，油脂产率能达到30mg/L/d。在不同的培养条件下其油脂中长链饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸含量超过65%，适合用于生物柴油炼制。在不同的培养条件下其油脂中十六碳二烯酸相对含量均超过26%，最高可达32.7%。通过少量的培养基置换，既能提高微拟球藻油脂含量，又能增加该藻株的生物量，另外其油脂脂肪酸组成适于生物柴油炼制，使得该藻株成为生物柴油炼制的优质原料。
图1是DUT01藻株在不同培养基中的生物量。图2是DUT01藻株在不同培养基中的油脂产量和产率。
具体实施例方式实验材料和试剂1.藻株:藻株海洋微拟球藻(N.0ceanica)DUT01由本实验室在大连星海湾近海区域分离获得。
2.生化试剂:琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Solarbio公司，北京)；测序由大连宝生物工程有限公司完成；DNA聚合酶rTaq (大连宝生物工程有限公司)；IOxPCR Buffer (大连宝生物工程有限公司)；dNTP Mixture (大连宝生物工程有限公司)。提取藻株基因组DNA试剂:十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)溶液:2%CTAB,IOOmmoI/L Tris-HCl (ρΗ8.0)，
1.4mol/L NaCl, 10mmol/L EDTA, 2% β -疏基乙醇。PCI抽提液:苯酚/氯仿/异戊醇(￥八0 =25:24:1。TE 缓冲液:10mmol/L Tris-HCl (ρΗ7.5)，lmmol/L EDTA (ρΗ8.0)。3.培养基f/2 培养基(1L):NaN0375mg, NaH2PO4.H205mg, Na2SiO3.9H2020mg, Na2EDTA4.36mg,FeCl3.6H203.16mg, CuSO4.5H200.0lmg, ZnSO4.7H200.023mg, CoCl2.6H200.012mg,MnCl2 4Η200.18mg, Na2MoO4 *2H200.07mg，维生素 BI0.lmg，维生素 B120.5mg，生物素 0.5mg,自然海水pH (8.0左右)。BGll 培养基(IL) =NaNO3L 5g, MgSO4.7H2075mg, K2HP0440mg, CaCl2.2H2036mg,柠檬酸铁铵 6mg,柠檬酸 6mg, Na2EDTAlmg, Na2C0320mg, Η3Β032.86mg, MnCl2.4H201.81mg,ZnSO4.7H200.222mg, Na2MoO4.2H200.39mg, CuSO4.5H200.079mg, Co (NO3) 2.6H2O0.0494mg,pH8.00说明:以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1:本发明藻株的获得与鉴定从大连星海湾近海区域海水中取样，用f/2固体培养基培养筛选后，转接到f/2液体培养基中，培养温度为25± I°C，光暗比14/10h，光照强度60 μ mol πΓΥ1，每天手摇两次。通过显微镜以及扫描电镜观察其生理形态发现，本发明藻株为绿色球形，直径2-5 μ m，无鞭毛。该藻株于2012年8月21日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏号为CGMCC N0.6443。提取DUTOI基因组DNA:I)称取0.1g干燥藻粉至于5mL圆底离心管中，液氮研磨5_10min。2)将磨碎的样品转入1.5mL离心管中，加入600 μ L CTAB缓冲液，轻微震荡混匀，65°C 水浴 Ih。3)加入等体积PCI抽提液，轻微震荡混匀，4°C 12000rpm离心lOmin。4)将上清液转至新的离心管中，加入RNA酶至终浓度I μ g/mL，37°C下温浴30min。
5)重复步骤3。6)水相转移至新的离心管中，加入2倍体积无水乙醇，室温放置IOmin沉淀DNA，4°C 12000rpm 离心 20min。7)去上清，然后用70%乙醇洗涤DNA2次。晾干后，将DNA溶解于20 μ L TE缓冲液中。16SrDNA序列的获得:16SrDNA PCR 引物如下:上游引物18SF:5’ -AACCTGGTTATCCTGCCAGT-3，下游引物18SR:5’ -TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTACG-3’PCR反应条件如表I所示:表IPCR反应条件
权利要求
1.一株具有高十六碳二烯酸含量的海洋微拟球藻藻株(Nannochloropsis oceanica),其特征在于:所述海洋微拟球藻藻株的登记入册编号为CGMCC N0.6443，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年8月21日。
2.根据权利要求1所述的一株具有高十六碳二烯酸含量的海洋微拟球藻藻株的培养方法，其特征在于:在用自然海水配置的f/2培养基中，培养温度为25±1°C，光暗比14/10h,光照强度60 μ mol πΓ2^1，每天手摇两次；在培养5_7天后，离心收集藻体并转移至含有不同硝酸盐浓度的f/2和BGll培养基中，25± I°C，光暗比14/10h，光照强度60 μ molHT2S'含有2%C02空气通气量为0.2vvm，培养体积为IL ;通过1/5培养基置换，最后在含有.37.5mg/L硝酸钠的f/2培养基中 获得海洋微拟球藻藻株DUTOl。
全文摘要
一株富含十六碳二烯酸的海洋微拟球藻及提高其生物量和油脂含量的培养方法，属于海洋微藻生物技术领域。海洋微拟球藻藻株DUT01属于褐藻门，褐藻目，球藻属。藻株为绿色球形，直径2-5μm，生长速度快。通过1/5新鲜培养基置换，该藻株在含有37.5mg/L的f/2培养基中油脂含量能达到64.3%，在含油1.5g/L的BG11培养基中生物量能达到1.4g/L，油脂产率能达到30mg/L/d。在不同的培养条件下其油脂中长链饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸含量超过65%，适合用于生物柴油炼制。在不同的培养条件下其油脂中十六碳二烯酸相对含量均超过26%，最高可达32.7%。通过少量的培养基置换，既能提高微拟球藻油脂含量，又能增加该藻株的生物量，另外其油脂脂肪酸组成适于生物柴油炼制，使得该藻株成为生物柴油炼制的优质原料。
文档编号C12N1/12GK103146581SQ201310065178
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月28日 优先权日2013年2月28日
发明者赵心清, 万春, 白凤武 申请人:大连理工大学