专利名称：中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型及构建方法
技术领域：
本发明属于中枢神经系统保护与损伤修复药物研究模型构建技术领域，特别涉及一种基于中枢神经系统中毛细管内皮细胞(endothelial cells, E)、星形胶质细胞(astrocytes, A)及神经元细胞(neuron, N)三种基本细胞形成的中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型及构建方法。
背景技术：
中枢神经系统是世界上最重要、最复杂的生命组织，中枢神经系统疾病则是健康负担和医学难题之一，所以对于中枢神经系统保护与损伤修复药物研究一直是生物医药研究领域的热点和难点，其技术瓶颈即迫切需要建立一种既可以维持细胞在体内的正常形态及功能，又可以对其生长环境进行简单调节控制的细胞生长载体。在体内实验中，实验动物体内环境虽然能完整地保留细胞的各种 特征，但是过于复杂的体内环境和体内大量不可控因素以及动物之间的个体差异将导致相关的实验结果产生偏差，同时体内实验也很难实现对一种细胞进行基因组学、蛋白组学、代谢组学分析，这对以后的网络神经、精神药理学研究造成了很大的障碍。另外，通过外科手术获得的人脑与脊髓活体组织标本，其组织活性难以保证而且多为病理组织，无法满足深入研究(如药物靶点、药物效应、药物毒副作用、药代动力学等对比研究与评价)的需要，因此利用体外细胞培养方法进行神经保护与损伤修复药物研究已越来越受到广泛关注。毛细管内皮细胞、星形胶质细胞及神经元细胞是中枢神经系统的三种基本细胞，三者关系非常密切，相互作用，相互影响。如不同的影响因子，其作用的靶细胞也不尽相同，有的可通过作用于神经元细胞发挥作用，有的作用于毛细血管内皮细胞或星形胶质细胞，有的在生理条件下则可能无法通过血脑屏障和血脊屏障。然而，目前该类研究相关的体外细胞培养方式主要为两大类:一类是对某一细胞单独培养，如单独培养神经元细胞，这种方法虽然避免了体内环境中大量不可控因素，但是过于简单的培养环境，往往导致所培养细胞丧失其体内的部分生物学特性，忽略了中枢神经系统中神经元细胞周围的其他两种重要细胞(毛细血管内皮细胞及星形胶质细胞)，无法满足关于中枢神经系统保护与损伤修复药物研究的全部需要。另一类为两细胞共培养，如神经元细胞与星形胶质原代细胞混合共培养以及利用Transwell系统将星形胶质细胞等与毛细血管内皮细胞共培养，借以研究血脑屏障和血脊屏障。此种方法只侧重研究了中枢神经系统中星形胶质细胞与毛细血管内皮细胞或神经元细胞的相互作用，也忽略了毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞及神经元细胞三者相互作用的系统关系。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种基于中枢神经系统中毛细管内皮细胞(endothelial cells, E)、星形胶质细胞(astrocytes, A)及神经元细胞(neuron, N)三种基本细胞形成的中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型及构建方法。本发明的技术解决方案是:一种中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型，在24孔培养板中有神经元细胞培养物及神经元细胞培养基，在神经元细胞培养基中插有Transwell Insert,所述TranswelI Insert的滤膜内室面涂有胶原蛋白IV，在TranswellInsert的内室面有毛细血管内皮细胞培养物,在Transwell Insert的外室面有星形胶质细胞培养物，所述星形胶质细胞培养物的突起通过Transwell Insert的滤膜孔径穿向毛细血管内皮细胞培养物，所述神经元细胞培养基的组分及体积百分比如下:98%神经元细胞基础培养基、1%双抗、1% L-谷氨酰胺。一种上述中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型的构建方法，其特征在于按如下步骤进行:
a.分别提取同一种属同一部位的星形胶质细胞、毛细血管内皮细胞及神经元细胞并分别进行原代培养；
b.在TranswellInsert滤膜内室面涂胶原蛋白IV,备用；
c.先用质量浓度为0.25%的胰蛋白酶消化原代培养9天的星形胶质细胞，用星形胶质细胞完全培养基重悬至密度为I X IO5个/ml,取100 μ I种植于的Transwell Insert的外室面，倒置于无菌容器中，放入37°C，5% CO2培养箱培养至细胞贴壁，然后将TranswellInsert正置于24孔培养板中，外室与内室都加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基，放入37°C, 5% CO2培养箱内继续培养，倒置培养及正置培养共2天；其次用质量浓度为0.05%的胰蛋白酶消化原代培养5天的毛细血管内皮细胞，用毛细血管内皮细胞完全培养基重悬至密度为IXlO5个/ml，吸出Transwell Insert内室中DMEM培养基，取200 μ I毛细血管内皮细胞悬液种植于已生长有大脑皮质星形胶质细胞的TranswelI Insert的内室面,然后再将Transwell Insert正置于24孔培养板中，放入37°C，5% CO2培养箱内继续培养2天；最后将在24孔培养板中原代培养 6天的神经元细胞的完全培养基更换为所述神经元细胞培养基，再将培养有毛细血管内皮细胞与星形胶质细胞的Tanswell Insert插入神经元细胞培养基中，放入37°C，5% CO2培养箱内培养I天。本发明是按照体内中枢神经系统毛细血管内皮细胞(endothelial cells, E)、星形胶质细胞(astrocytes, A)及神经元细胞(neuron, N)的相对空间结构，首次利用Transwell将来源于同一种属动物(包括大鼠、小鼠及人等各种高级动物)同一部位的三种原代细胞进行立体共培养，构建原代同源EAN三细胞四维模型。本发明所采用的细胞来源于同一种属同一部位，避免了不同种属细胞来源所造成的差异性；本发明运用原代细胞进行共培养，比细胞系更直接来源于机体组织，生物性状尚未发生大的变化，在一定程度上更能够准确反映体内的状态；本发明最大限度地保留了三种基本细胞在体内的整体关联特性，可作为药物靶点(疾病靶点、细胞靶点、分子靶点及其作用机制)、药物效应、药物毒副作用、药代动力学等对比研究与评价的新细胞模型。
图1为本发明实施例EAN三细胞四维模型构造示意图。图2为本发明实施例EAN三细胞四维模型构建方法示意图。图3为单独培养大脑皮质毛细血管内皮细胞免疫荧光染色图。
图4为本发明实施例共培养的大脑皮质毛细血管内皮细胞免疫荧光染色图。图5为单独培养与本发明实施例共培养大脑皮质毛细血管内皮细胞的阳性结构长短轴比值示意图。图6为单独培养大脑皮质星形胶质细胞免疫荧光染色图。图7为本发明实施例共培养的大脑皮质星形胶质细胞免疫荧光染色图。图8为单独培养与本发明实施例共培养大脑皮质星形胶质细胞的中心聚集面积比值示意图。图9为单独培养与本发明实施例共培养大脑皮质星形胶质细胞的周围投射面积比值示意图。图10为单独培养大脑皮质神经元细胞免疫荧光染色图。图11为本发明实施例共培养的大脑皮质神经元细胞免疫荧光染色图。图12为单独培养与本发明实施例共培养大脑皮质神经元细胞的阳性结构长度示意图。图13为本发明实施例EAN三细胞四维模型激光共聚焦3D重建后扫描图。
具体实施例方式本发明的中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型的构建方法，是按如下步骤进行:
a.分别提取SD大鼠大脑皮质的星形胶质细胞、毛细血管内皮细胞及神经元细胞并分别进行原代培养；
具体操作如下:
al.提取SD大鼠大脑皮质的星形胶质细胞(A)并进行原代培养按照现有技术的方法提取一只24 h内新生SD大鼠的大脑皮质，用D-Hanks液漂洗皮质组织3次，将大脑皮质剪碎至Imm3左右的小块，加入质量浓度为0.25%的胰蛋白酶500μ I和D-Hanks 500 μ I放入37° C孵箱孵育30 min ；30 min后，用吸管小心的将组织块移到盛有2 ml星形胶质细胞完全培养基的试管中，静置2-3 min后，再将组织块移到盛有2ml星形胶质细胞完全培养基的另一个试管中，进行吹打；吹打结束后，静止3 min左右后，用吸管轻轻吸取溶液上清，并用孔径75 μ m的滤网过滤，收集滤液(SD大鼠大脑皮质的星形胶质细胞液)到离心管中，定容至2 ml，用血球计数器计算细胞密度，以2.5X IOVcm2的细胞密度接种到培养瓶中，放入37°C，5% CO2培养箱中静置培养；种植后第3天换星形胶质细胞完全培养基全液，此后每两天换星形胶质细胞完全培养基全液一次；所述星形胶质细胞完全培养基的组分及体积百分比为87% DMEM、10%胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、1% HEPES及1%双抗；
a2.提取SD大鼠大脑皮质的毛细血管内皮细胞(E)并进行原代培养按照现有技术的方法提取一只6周龄SD大鼠的大脑皮质，将皮质放到盛有预冷BufferA的培养皿中，将所有的皮质剪碎至Imm3左右的小块,并移到15 ml离心管中，1500 rpm离心5 min ;去上清，加入10-15 ml的消`化酶，放入37°C培养箱中消化I h，消化期间，每10min轻轻摇动一次；消化后用不同孔径的滴管吹打，直到悬液呈奶黄色，再次1500 rpm离心5 min;去上清，用22% BSA溶液重悬沉淀，3000 rpm离心15 min，离心结束后，用滴管吸走液面上黄白色杂质；再用Buffer A重悬沉淀，3000 rpm离心5 min;再次去上清，并加5 ml消化酶，放入37°C培养箱孵育2 h后，1500 rpm离心5 min后去上清，用I ml的Buffer A重悬沉淀,并将悬液轻轻地加到已经做好的percoll梯度离心液中，1400 g,4°C,离心20 min ;可见明显分层，将四层和五层之间的液体取出，并将液体倒入离心管中，加入10 ml的Buffer A, 1500 rpm离心5 min ;去上清，用加有嘌呤霉素的大脑毛细血管内皮细胞完全培养基重悬沉淀并将细胞悬液(SD大鼠大脑皮质的毛细血管内皮细胞液)种植于培养瓶中，嘌呤霉素的加入量为大脑毛细血管内皮细胞完全培养基体积的0.4%，第2天，将培养基换为大脑毛细血管内皮细胞完全培养基，之后每两天换一次大脑毛细血管内皮细胞完全培养基全液；所述Buffer A和Buffer B按下列组分及体积百分比配制:Buffer A:10% 10 XD-Hanks,1% HEPES,1% 双抗、1% NaHCO3>0.5% BSA、86.5% ddH20 ；Buffer B:10%10 XD-Hanks,1% HEPES,1% 双抗、1% NaHCO3,87% ddH20 ;所述消化酶是在 Buffer B 中加Buffer B体积1%的胶原酶或分散酶、Buffer B体积0.1 % DNase和Buffer B体积0.1%的TLCK ;大脑毛细血管内皮细胞完全培养基的组分及体积百分比为:85% MCDB 131培养基、1%血管内皮细胞生长因子ECGS、10%胎牛血清、1%双抗、2%肝素、1% L-谷氨酰胺；a3.提取SD大鼠大脑皮质的神经元细胞(N)并进行原代培养按照现有技术的方法提取一只24 h内新生SD大鼠的大脑皮质，用D-Hanks液漂洗皮质组织3次，将大脑皮质剪碎至Imm3左右的小块，加入质量浓度0.25%的胰蛋白酶500 μ I和D-Hanks 500 μ I放入37° C孵箱孵育30 min ;用粗口吸管将组织块移到盛有2 ml神经元细胞种植培养基的试管中，轻轻吹打2-3次后，再将组织块移到另一个盛有1.5 ml神经元细胞种植培养基的试管中，静止3 min左右后，吸组织到空管中吹打成悬液，直到大部分组织块消失；用孔径75 μ m的滤网过滤，收集过滤液(SD大鼠大脑皮质的神经元细胞液)到离心管中，定容至2 ml，用血球计数器计算细胞密度；以I X IO5个/ml细胞密度接种500口1到24孔板中，放入371:，5% CO2孵箱进行培养；种植后第3天换成神经元细胞完全培养基，每2天换神经元细胞完全培养基一次，换液方式为半换液；所述神经元细胞种植培养基的组分及体积百分比为:88% DNEM、10%胎牛血清、1%双抗、1% L-谷氨酰胺；所述神经元细胞完全培养基的组分 及体积百分比为:96%神经元细胞基础培养基、2% B27、l%双抗、1%L-谷氨酰胺。b.在Transwell Insert滤膜内室面涂胶原蛋白IV (模拟E-A间隙基底膜),备用；c.先用质量浓度为0.25%的胰蛋白酶消化原代培养9天的星形胶质细胞，用星形胶质细胞完全培养基重悬至密度为I X IO5个/ml,取100 μ I种植于的Transwell Insert的外室面，倒置于无菌容器中，放入37°C，5% CO2培养箱培养至细胞贴壁，然后将TranswellInsert正置于24孔培养板中，外室与内室都加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基，放入37°C, 5% CO2培养箱内继续培养，倒置培养及正置培养共2天；其次用质量浓度为0.05%的胰蛋白酶消化原代培养5天的毛细血管内皮细胞，用毛细血管内皮细胞完全培养基重悬至密度为IXlO5个/ml，吸出Transwell Insert内室中DMEM培养基，取200 μ I毛细血管内皮细胞悬液种植于已生长有大脑皮质星形胶质细胞的TranswelI Insert的内室面,然后再将Transwell Insert正置于24孔培养板中，放入37°C，5% CO2培养箱内继续培养2天；最后将在24孔培养板中原代培养6天的神经元细胞的完全培养基更换为所述神经元细胞培养基，再将培养有毛细血管内皮细胞与星形胶质细胞的Tanswell Insert插入神经元细胞培养基中，放入37°C，5% CO2培养箱内培养I天。具体操作方法如图2所示:星形胶质细胞原代培养第10天(已培养9天)，细胞铺满瓶底面积的80%后，吸走上清，加入2.5 ml星形胶质细胞完全培养基，拧紧培养瓶瓶口，并用封口膜密封。将盛培养瓶放置于气浴摇床中，250 rpm，37°C过夜，然后吸去培养液，用D-Hanks液洗涤2次，加入质量浓度为0.25%的胰蛋白酶I ml消化I min，在相差显微镜下可见细胞变圆，间隙变大，说明消化完全，吸出胰蛋白酶，加入星形胶质细胞完全培养基，用吸管轻轻吹打，至细胞从瓶壁上脱落，收集细胞悬液，1500 rpm离心5 min。弃上清，加Iml星形胶质细胞完全培养基，吹打至细胞悬液。用血球计数板计数，调整细胞的接种密度为IX IO5个/ml，分别取100 μ I细胞液种植到备用的I μ m Transwell外室面及细胞爬片上，将Transwell Inser倒置于一体积合适的无菌容器中，放入37°C, 5% CO2孵箱培养至细胞贴壁(1 2小时),然后将Transwell Insert按正常位置(正置)置于24孔培养板中，夕卜室与内室都加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基，放入37 V，5% CO2培养箱内继续培养46^47小时，即倒置培养及正置培养共2天。从星形胶质细胞原代培养的第7天开始大脑皮质毛细血管内皮细胞的原代培养，当原代培养5天后，细胞长满培养瓶底部。吸去培养瓶中的培养基，并用D-Hanks液清洗，将质量浓度为0.05%的胰蛋白酶作用于细胞的表面，室温静置1-2 min,同时在相差显微镜观察，当细胞变圆，间隙增宽，说明消化充分，然后吸走胰蛋白酶，并加入大脑皮质毛细血管内皮细胞完全培养基3 ml中止消化，同时用滴管吹打制成细胞悬液。然后1500 rpm离心5 min，弃上清，再加入I ml大脑皮质毛细血管内皮细胞完全培养基，使细胞重悬，用血球计数板进行细胞计数，调整细胞密度至IXio5个/ml，吸出Transwell Insert内室中DMEM培养基，分别取200 μ I毛细血管内皮细胞悬液种植于已生长有大脑皮质星形胶质细胞的Transwell Insert的内室面及细胞爬片上，放入37°C，5% CO2培养箱内继续培养2天；
从星形胶质细胞原代培养的第8天开始大脑皮质神经元细胞的原代培养，当原代培养6天，将培养有神经元细胞的24孔板中神经元细胞完全培养基更换为神经元细胞培养基，然后将大脑毛细血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养的TanswelI Insert插入神经元细胞培养基中，放入37°C，5% CO2培养箱内进行三细胞四维共培养I天。即构建了中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型，其构造如图1所示:在24孔培养板I的孔中有神经元细胞培养物2及神经元细胞培养基3，在神经元细胞培养基3中插有Transwell Insert 4,所述Transwell Insert4的滤膜内室面涂有胶原蛋白IV 5,在Transwell Insert 4的内室面有毛细血管内皮细胞培养物6,在TranswellInsert 4的外室面有星形胶质细胞培养物7，所述星形胶质细胞培养物7的突起通过Transwell Insert 4的滤膜孔径8穿向毛细血管内皮细胞培养物6。通过免疫细胞化学荧光染色方法对三种细胞进行形态学鉴定分析，其中毛细血管内皮细胞鉴定Marker为Glut-1 ;星形胶质细胞鉴定Marker为GFAP ;神经元细胞鉴定Marker 为 MAP-2。三个单细胞的荧光染色方法为:
(I)三个单细胞的细胞爬片均放入24孔培养板中，培养基及培养时间与共培养相同，将放有细胞爬片的24孔板从孵箱中取出，吸去培养基，用PBS清洗爬片2次，每次I min。(2)用4%多聚甲醛固定20 min后，吸去4%多聚甲醛溶液，然后用PBS清洗细胞爬片3次，每次3 min，用封闭用羊血清溶液封闭细胞爬片，37°C，2 h。(3)2 h后，用 PBS稀释的 1:1000兔抗大鼠Glut-1,1:1000兔抗大鼠GFAP及 1:1000小鼠抗大鼠MAP-2 —抗溶液分别孵育E、A、N三种单细胞爬片，4° C条件下，过夜。(4)用PBS清洗细胞爬片3次，每次4 min。(5)在避光条件下，加入用PBS稀释的1:100羊抗兔TRITC标记的IgG 二抗，常温孵育I h后，加入Hochest33258溶液孵育10 min。(6)10 min后，避光条件下PBS清洗3次，每次3 min。然后用防淬灭封片剂封片。(7)在荧光显微镜下观察。大脑皮质毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞及神经元细胞免疫荧光染色图分别如图3、图6及图10所示。本发明构建的EAN三细胞共培养四维模型中各细胞的荧光染色方法为:
Cl)对模型中毛细血管内皮细胞进行免疫荧光染色时，先小心的将Transwell外室面的星形胶质细胞用润 湿的棉签擦掉，防止出现背景荧光。仔细的将半透膜从TranswellInsert上取下，开始对内皮细胞进行免疫荧光染色，其方法与上述毛细血管内皮细胞的荧光染色方法一样，不再赘述。(2)对模型中星形胶质细胞进行免疫荧光染色时，先小心的将Transwell内室面的内皮细胞用润湿的棉签擦掉，防止出现背景突光。仔细的将半透膜从Transwell Insert上取下，开始对星形胶质细胞进行免疫荧光染色，其方法与上述星形胶质细胞的荧光染色方法一样，不再赘述。(3)对模型中神经元细胞进行免疫荧光染色时，小心的将培养孔中长有神经元细胞的细胞爬片取出，用预冷的PBS清洗后，进行免疫荧光染色，其方法与上述神经元细胞的突光染色方法一样，不再赘述。本发明实施例的EAN三细胞共培养四维模型中的大脑皮质毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞及神经元细胞镜下图分别如图4、图7及图11所示。本实施例中原代同源EAN三细胞四维模型与单细胞培养条件下三种基本细胞的形态差异分别如图5、图8、图9及图12所示。如图5所示:在四维模型系统中大脑皮质毛细血管内皮细胞Glut-1阳性区的长、短轴的比值明显变大；如图8、9所示:星形胶质细胞的GFAP阳性结构的中心聚集面积减小、周围投射面积增大；如图12所示:神经元细胞树突中MAP-2阳性区长度明显变长。如图13所示，通过三维重建观察发现在立体共培养系统中星形胶质细胞的突起通过Insert的孔径穿向大脑皮质毛细血管内皮细胞层。
权利要求
1.一种中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型，其特征在于:在24孔培养板(I)中有神经元细胞培养物(2)及神经元细胞培养基(3)，在神经元细胞培养基(3)中插有TranswelI 1]1861'1:(4),所述1'以118￥611 Insert(4)的滤膜内室面涂有胶原蛋白IV (5),在Transwell Insert (4)的内室面有毛细血管内皮细胞培养物(6),在Transwell Insert (4)的外室面有星形胶质细胞培养物(7)，所述星形胶质细胞培养物(7)的突起通过TranswellInsert (4)的滤膜孔径(8)穿向毛细血管内皮细胞培养物(6)，所述神经元细胞培养基(3)的组分及体积百分比如下:98%神经元细胞基础培养基、1%双抗、1% L-谷氨酰胺。
2.一种如权利要求1所述中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型的构建方法，其特征在于按如下步骤进行: a.分别提取同一种属同一部位的星形胶质细胞、毛细血管内皮细胞及神经元细胞并分别进行原代培养； b.在TranswellInsert滤膜内室面涂胶原蛋白IV,备用； c.先用质量浓度为0.25%的胰蛋白酶消化原代培养9天的星形胶质细胞，用星形胶质细胞完全培养基重悬至密度为I X IO5个/ml,取100 μ I种植于的Transwell Insert的外室面，倒置于无菌容器中，放入37°C，5% CO2培养箱培养至细胞贴壁，然后将TranswellInsert正置于24孔培养板中，外室与内室都加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基，放入37°C, 5% CO2培养箱内继续培养，倒置培养及正置培养共2天；其次用质量浓度为0.05%的胰蛋白酶消化原代培养5天的毛细血管内皮细胞，用毛细血管内皮细胞完全培养基重悬至密度为IXlO5个/ml，吸出Transwell Insert内室中DMEM培养基，取200 μ I毛细血管内皮细胞悬液种植于已生长有大脑皮质星形胶质细胞的TranswelI Insert的内室面,然后再将Transwell Insert正置于24孔培养板中，放入37°C，5% CO2培养箱内继续培养2天；最后将在24孔培养板中原代培养6天的神经元细胞的完全培养基更换为所述神经元细胞培养基，再将培养有毛细血管内皮细胞与星形胶质细胞的Tanswell Insert插入神经元细胞培养基中，放入37°C， 5% CO2培养箱内培养I天。
全文摘要
本发明公开一种中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型及构建方法，中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型是在24孔培养板中有神经元细胞培养物及神经元细胞培养基，在神经元细胞培养基中插有TranswellInsert，所述TranswellInsert的滤膜内室面涂有胶原蛋白Ⅳ，在TranswellInsert的内室面有毛细血管内皮细胞培养物，在TranswellInsert的外室面有星形胶质细胞培养物，所述星形胶质细胞培养物的突起通过TranswellInsert的滤膜孔径穿向毛细血管内皮细胞培养物，所述神经元细胞培养基的组分及体积百分比如下98%神经元细胞基础培养基、1%双抗、1%L-谷氨酰胺。
文档编号C12Q1/02GK103184188SQ201310065078
公开日2013年7月3日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者孙长凯, 李彧媛, 郑铁铮, 范明, 赵慧 申请人:大连医科大学