专利名称：：一种海洋微藻delta6脂肪酸去饱和酶及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种海洋微藻-微拟球藻的A6脂肪酸去饱和酶、其编码基因及应用。
背景技术：
：脂肪酸是具有碳氢链的单羧酸，在许多生物学过程中起着重要作用。脂肪酸较少以游离的形式存在，而是被脂化进各种主要的脂质成分中，如磷脂和三酰甘油。脂肪酸主要分为两类饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，后者又分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸，其碳氢链中分别含有一个或多个顺式双键(0=(:)。不饱和键的生成需要脂肪酸去饱和酶(fattyaciddesaturase)催化。脂肪酸去饱和酶存在于几乎所有植物、动物和微生物中，可将脂肪酸链中的C-C单键转化为C=C双健。根据其引入双键的位置不同，可以将去饱和酶分为A5、A6、A9、A12等，它们分别在脂肪酸链由羧基碳开始的第5、6、9、12位碳原子处引入双键。在脂肪酸链的羧基碳和第9位碳原子间加双键的酶又被称为前端去饱和酶(front-enddesaturase),主要包括A4、A5、A6、A8去饱和酶。人及其它哺乳动物缺乏A12(co6)和A15(co3)去饱和酶，不能生成亚油酸(linoleicacid,LA;18:2A9,12)和a-亚麻酸(a-linolenicacid，ALA;18:3A9，12，15)，必须从食物中补充。高等植物由于缺乏前端去饱和酶，一般只能合成到亚油酸和亚麻酸，不能继续合成更长链的多不饱和脂肪酸。而某些微生物，特别是真菌、海洋微藻等则具有合成长链多不饱和脂肪酸(longchainpolyunsaturatedfattyacids，LCPUFAs)所需的所有去饱和酶，能够从头合成LCPUFAs且含量丰富(SayanovaandNapier，2004)。LCPUFAs是指含有20或22个碳原子及4-6个甲烯基间隔的顺式双键的脂肪酸(Abbadietal.，2004)，包括AA(arachidonicacid,20:4A5,8,11，14)、EPA(eicosapentaenoicacid,20:5A5，8,11,14,17)和DHA(docosapentaenoicacid,22:6A4，7,10，13,16,19)(俗称"脑黄金")等。根据脂肪酸链中最后一个双键距离甲基端碳原子的距离可将LCPUFAs分为n6系列和n3系列。AA属于n6LCPUFAs,EPA和DHA属于n3LCPUFAs。研究表明，LCPUFAs对人类健康有着非常重要的影响。AA和EPA是哺乳动物细胞膜的组分，也是生成前列腺素、白三烯和血栓素等激素的前体(Funk,2001);EPA在凝血、免疫和抗炎症等各种生理反应中起重要作用(Simopoulos，2002);DHA对胎儿神经系统的形成至关重要(Uauyetal.,2001)，还影响着视网膜视紫红质的活性(Giustoetal.,2000)，并与某些疾病如关节炎、动脉硬化、抑郁症的预防和治疗有关(HorrocksandYeo，1999;MarszalekandLodish，2005)。AA、EPA和DHA在生物体内由LA和ALA经一系列去饱和及延伸反应生成。首先LA和ALA在A6去饱和酶作用下分别生成GLA(18:3A6，9，12)和SDA(18:楊，9,12，15);然后经A6延伸反应生成DGLA(20:3A8，11，14)和ETA(20:4A8，11,14,17);再由A5去饱和酶作用生成AA(20:4A5，8,11,14)和EPA(20:5A5,8，11，14,17);EPA又可经过两条途径进一步生成DHA。虽然人体可以将外源LA和ALA转化为AA、EPA和DHA,但是合成效率极低，远远不能满足需要，在日常饮食中摄入充足的LCPUFAs(特别是EPA和DHA)就显得尤为重要。当前EPA和DHA的来源主要是深海鱼油，然而随着市场需求的迅速增长和海洋可捕捞鱼类资源的日益减少，该途径已经远远不能满足需要。此外，环境污染等原因致使鱼油中的重金属含量越来越高。因此，寻找更为持续、稳定的EPA和DHA来源已成为当务之急(Tononetal.，2002;Domergueetal.，2005a)。虽然现已开发出商业化的海藻油和真菌油，但是其较低的产量和较高的提取成本限制了这类资源.的大规模应用。考虑到植物油的提取工艺非常成熟，许多研究者已经将目光转向植物的代谢工程，探索如何利用已有的前端去饱和酶及延伸酶基因在高等植物特别是油料作物中构建LCPUFAs合成通路，使之成为稳定、廉价的LCPUFAs来源。目前该领域已取得突破性研究进展，使转基因植物作为"绿色细胞工厂"生产EPA、DHA成为现实(Truksaetal.,2006)。A6去饱和酶能催化LinoleicAcid(18:2A9,12)生成，LinolenicAcid(18:3A6，9，12),以及催化a-LinolenicAcid(18:3A9，12，15)生成StearidnoicAcid(18:4A6,9,12,15),是EPA及其后DHA生成的关键酶。现在已从动物、植物、真菌及海洋微藻中克隆出A6去饱和酶基因并进行了功能鉴定。如Cohoon等在翼叶山牵牛(Thunberiaalata)种子胚乳中检出A6acyl-ACP去饱和酶，意味着脂肪酸的第1个双键也可能在A6位产生(Cohoonetal.,1994)。Domergue等从海洋微藻Os/reoco"^的中克隆得到一个酰基-CoAA6去饱和酶，该酶能够催化与CoA连接的LA和ALA生成GLA和SDA(Domergueetal.，2005)。但目前可以有效利用于转基因植物的商业化应用的A6去饱和酶数量不多，选择范围狭小，因此继续克隆并筛选具有较高底物专一性和催化活性的A6去饱和酶是当前的研究热点之一。已知微拟球藻富含EPA，最高含量可达到总脂肪酸的30%以上，A6去饱和酶作为EPA合成的关键酶可能具有较高酶活。但目前未见有关微拟球藻A6去饱和酶的相关报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种微拟球藻A6去饱和酶基因、其编码蛋白及应用。本发明所述微拟球藻A6去饱和酶基因具有SEQIDNO.l所示的核苷酸序列，其编码蛋白具有SEQIDN0.2所示的氨基酸序列；本发.明还包括SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的衍生蛋白质，以及编码这些蛋白质的基因。本发明的A6去饱和酶基因长1425bp，编码474个氨基酸。在GenBank中进行同源搜索，未发现与该基因相同的序列报道，为一新基因。本发明的基因可以通过如下方式获得以微拟球藻总RNA反转录得到的cDNA为模板，利用下列引物进行扩增，ForwardPrimer:5，誦ATGGGACGCGGTGGCGAGCGG-3'ReversePrimer:5，-TTACATGGCGGGGAAATCGGCC-3，扩增的条件是94"C预变性3min,以94°C30s、56°C30s、72°C1.5min反应30个循环，72。C延伸15min，4。C保存。本发明还包括含有上述基因的表达载体、含有所述表达载体的宿主细胞。本发明A6去饱和酶具有前端去饱和酶所特有的N端细胞色素65结构域和3个组氨酸簇(176-180、215-219、413-417)。本发明的A6去饱和酶可以有效地催化有效地催化LinoleicAcid(18:2A9，12)生成Y-LinolenicAcid(18:3A6，9，12)，以及催化a誦LinolenicAcid(18:3A9,12,15)生成StearidnoicAcid(18:4A6,9，12，15)。本发明的DNA序列能够应用于包括动物、植物、微生物在内的任一表达体系，使转基因细胞生成LCPUFAs。例如，在油料作物亚麻(Zi"wmsp.)、油菜(5raM/casp.)、大豆(G7少cz."eandSo/asp.)、向曰葵(//e/z.aw^mssp.)、棉花(Gawy//wmsp.)、玉米(Zeawaj;"、撒揽((9/easp.)、红花(CaW/zamMSsp.)、可可(77zeo6ramacacca)和花生(v4rac/^sp.)的植株和种子中表达该基因及A5去饱和酶、A6延伸酶等基因，能够使上述植物生成EPA、DHA，具有极高的商业开发价值。而EPA、DHA又可作为保健品或药物用于疾病的预防和治疗，如糖尿病、癌症、炎症反应和心血管疾病等。图1是本发明A6脂肪酸去饱和酶催化(18:2A9，12)生成(18:3A6，9，12)的气象色谱分析结果，其中1-A为转入空pYES2质粒，不加底物的谱峰图，1-B为加入LA底物的转空pYES2质粒的谱峰图，1-C为加入LA底物的转pYND6质粒的谱峰图，l-D为标准品对照；图2是微拟球藻A6脂肪酸去饱和酶催化(18:3A9,12，15)生成(18:4A6,9,12，15)的气象色谱分析结果，其中2-A为转入空pYES2质粒，不加底物的谱峰图，2-B为加入ALA底物的转空pYES2质粒的谱峰图，2-C为加入ALA底物的转pYND6质粒的谱峰图，2-D为标准品对照。具体实施例方式下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。实施例lA6饱和酶基因的获得具体步骤包括1、微拟球藻的培养1)微拟球藻A^朋oc/2/wo/7^.ocw/ato(Droop)Hibberd购自澳大利亚CSIRO微藻种质库(CSIROCollectionofLivingMicroalgae)，为纯种培养，编号为CS-1792)培养用海水为青岛近海自然海水，海水经脱脂棉过滤，IO(TC煮沸3min。250ml三角烧瓶及移液管等均在用前高压灭菌(12rC，15min)。3)配制f/2母液并灭菌。4)按l:1000(v/v)的比例向消毒海水中加入f/2母液，按l:10(v/v)的比例接入藻种，置于光照培养箱中不充气培养，每天摇瓶数次。具体培养条件见表1。表l微拟球藻的培养条件培养基盐度/%。温度/。c初始pH光照/lLimols—im—2f/23120±18.170(12h:12h)f/2母液配制1.基本元素NaN0378.4g+lLDDW(双蒸水)；NaSi03'9H2010g+lLDDWNaH2P044.4g+lLDDW上述试剂高压灭菌(121°C，15分钟)，每1000ml培养液中各加入lml。2.微量元素ZnS04-4H202.3gMnC12-4H2017.8gCuS04-5H20lgNa2Mo04-2H200.73gCoC12.6H20L2gNa2EDTA5g上述试剂溶于100mlDDW中，取lml混合液加入1LDDW中，另力口4.3克Na2EDTA，配好的微量元素母液与剩余的混合液一起高压灭菌后储存。使用时每1000ml培养液中加入lml微量元素母液。3.Fe元素FeC6H507.5H2039g+100mlDDW取10ml加入lLDDW中作为母液，与剩余的溶液一起高压灭菌储存。使用时每1000ml培养液中加入lml母液。Fe也可以与微量元素母液配在一起，也是加10ml。4.维生素VB120.5mgVB1100mgVH0.5mg棕色试剂瓶装1LDDW高压灭菌，降至室温后加入上述维生素，4。C储存。使用时每1000ml培养液中加入lml维生素母液。4)每天观察藻的生长情况，微拟球藻正常生长时藻液黄绿色，藻体可较长时间悬浮于培养基中，定期进行传代培养，传代的同时进行镜检,观察有无藻体粘连或敌害生物污染。2、mRNA提取mRNA提取利用TRlzol试剂(Invitrogen，Cat,No.15596-026)裂解，结合使用RANprepPlantKit(TIANGEN,Cat.No.DP402-02)。进行RNA纯化，详细过程见试剂使用说明书。3、文库构建1)cDNA制备利用SMARTPCRcDNASynthesisKit(Clontech,Cat.No.634902)，制备cDNA,详细过程见试剂使用说明书。2)cDNA分段回收、连接①取200)al二次扩增的均一化cDNA产物电泳，分别回收0.5-1.0kb，1.0-1.5kb,1.5-2.0kb和〉2.0kb的目的片段；②载体和感受态使用Promega公司的pGEM-TVectorSystems和JMIO9(Cat.#3610);③载体和插入片段以约1:3的比例连接(T4DNAligase)。3)热激转化①取4nL连接产物，加入lOOpL感受态细胞中，混匀，冰上预冷20min;②42'C热激45s;③冰上冷却2min后，加0.9mlSOC液体培养基；④70rpm，37。C，复苏60min;取5^L菌液涂LB(Ampr)平板，X-Gal、IPTG筛选，37。C培养16小时。4)cDNA文库测序从平板上随机挑取单克隆，LB培养，PCR检测后送联合基因科技(集团)有限公司(www.chinagenenet.com)测序。5)将测序结果在GenBank中进行Blastx比对，发现一个序列与海链藻，三角褐指藻等微藻的A6去饱和酶基因具有很高的相似性，初步确认为微拟球藻A6去饱和酶基因3'序列。4、5'RACE获得A6去饱和酶基因的5'序列使用5，RACE试剂盒为5'RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds,Version2.0(Invitrogen,Cat.No.15590-101)。实验中各试剂如无特别说明为试剂盒自带产品，具体过程详见试剂盒使用说明书。根据3'序列设计如下设计5'RACE巢式PCR内外引物ND(外)5,-GTTCATGGCCACGAAGTAGAGACC-3,ND(内)5，-CAGTCGCGTACGAATGCCAGCAGA-3,获得的片段，电泳后切取明显条带，T-A连接，转化，鉴定为阳性克隆的菌株送公司测序。测序鉴定一个长度约为900bp的片段为A6脂肪酸去饱和酶基因5'序列。5、A6脂肪酸去饱和酶全基因的获得1)根据3，和5，端序列信息，在GenBank比对查找阅读框，设计如下引物(两端带KpnI和SacI酶切位点)ND-KpnI-F:5'-CGGGTACCACCATGGCACGGGATGGCGAGCCGGTCG-3，ND-SacI-R:5'-GCGGAGCTCTTCGCTTCCCTCCGTCCGTTTACACAG國3，2)以构建文库时获得的cDNA产物为模版，扩增得到A6脂肪酸去饱和酶全基因，PCR反应体系如下Sterilized,distilledwater36.5|il10xPCRbufferlOmMdNTPmixl単ND-KpnI-F(lOnM)1.0[4ND-SacI-R(10|iM)l.OplcDNA5.0|al总体积—49.5pl加入高保真DNApolymerase(5U/iil)立即混勾，如下条件进行PCR扩增94°C,2m+(94°C，30s^55°C,30s+72°C,lm)x35cycles+72。C，7min扩增得到了该基因的编码区，并连接入pGEM-T质粒转JM109保存，测序验证，得到A6去饱和酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示。6、根据上述测序结果，来自微拟球藻的A6脂肪酸去饱和酶基因长度为1425bp，编码474个氨基酸残基，其编码的氨基酸序列如序列表SEQIDN0.2所示，该序列具有前端去饱和酶的特征结构域，包括N端细胞色素b5结构域和3个组氨酸簇(176-180、215-219、413-417)。实施例2表达载体pYND6的构建及酿酒酵母的转化1、酿酒酵母表达载体pYES2及酵母菌株INVScl简介实验表达载体选用pYES2质粒(Invitrogen，Cat.No.V825-20),长5857bp,带有GAL1启动子，该启动子为诱导型，在培养基中有葡萄糖(glucose)存在时转录受到抑制，而除去葡萄糖加入半乳糖则可以诱导转录。此外，细胞还可以在棉子糖(raffinose)作为碳源的培养基中生长，棉子糖既不诱导也不抑制转录，而且诱导速度比开始以葡萄糖为碳源培养的细胞要快。酵母菌INVScl的基因型为MATa/nWA7^7-2卵wra3-52/MATa/^3A7/e"2^7-2卵wra3-52，表现型为His-,LeiT，Trp國，Ura-。质粒pYES2带有URA3基因，可用缺乏尿P密嚏的最小培养基筛选酵母转化子。其他详细信息参见Invitrogen的pYES2说明书。2、表达载体pYND6的构建及阳性克隆的筛选1)扩增培养实施例1中获得的含有pGEM-A6去饱和酶基因的JM109阳性菌落。2)按照常规方法提取带有A6去饱和酶基因的pGEM质粒，利用相应的DNA内切酶(Kpnl/Sacl)，从插入目的基因的pGEM质粒中切取基因，同时利用对应内切酶组合，将pYES2质粒切开成线型双链DNA。内切酶反应试剂按如下配比nuclease-freewater15jxl10xBuffer2|ilD丽质粒lpl内切酶2pl总体积^!T37C反应过夜，产物切胶回收纯化3)载体连接将内切酶处理后的去饱和酶基因与切好pYES2质粒以2:1体积比混合，按如下配比混合反应液DNA&质粒lOpl10xBuffer2^1皿clease國freewater6(xlT4DNALigase2|il总体积22。C反应lh以上，取5iil反应产物热激法转入JM109,涂板挑单克隆培养，菌液PCR检验后测序验证。由此，构建完成表达载体pYND6，将含有表达载体的大肠杆菌JM109扩增培养，并提取质粒，-2(TC保存，准备酵母转化。3、酿酒酵母感受态细胞的制备及转化。本实验的酿酒酵母感受态细胞的制备及转化利用EasyCompTM转化试剂盒(Invitrogen,Catalogno.K5050-01),具体操作过程见试剂盒使用说明书。转化后的酵母均匀涂于SC-U-平板(平板事先3(TC放置lh),30"C恒温箱培育3d;挑取酵母单菌落培养，提取酵母的DNA，用特意引物ND-KpnI-F和ND-SacI-R做PCR检测，设置转空质粒的对照。PCR能够得到目的片段的表示该酵母菌为转入ND6基因的阳性克隆，可用于表达实验。实施例3酵母菌株的诱导表达及脂肪酸分析1.诱导表达1)将含有重组质粒的阳性克隆及空质粒对照菌再次在SC-U(2%glucose)平板上划线，30。C培养至长出菌落；2)挑单克隆接入3mlSC-U(2%glucose)液体培养基，30。C摇菌过夜；3)取适量菌液离心，加入3.6mlSC-U(2%glucose)，至初始00600约0.2,加入400iil20。/。NP-40(终浓度为1%),同时加入脂肪酸底物(LA，18:2A9，12和ALA，18:3A9，12，15)至终浓度25uM,20。C诱导72h。2.脂肪酸提取及分析2.1脂肪酸提取与甲酯化1)将诱导后的菌液5000rpm，3min离心收集；2)液氮研磨，将研磨后的干粉转入EP管中，加300plKOH饱和的甲醇，涡旋混合后70-8(TC皂化15-20min;3)冷却后加过量1N浓度的HCl-甲醇，涡旋混匀，70-8(TC甲酯化15min;4)加适量正己烷，并淋入少量蒸馏水，分层萃取；5)12000rpm离心5min后，小心取上层有机层，即可用于气相分析。2.2脂肪酸的气相色谱(GC)分析1)仪器惠普58卯SERIESII;载气N2;线速20cm/s;分流比10:1流量2.2ml/min;汽化室温度260°C;程序升温150°C(2min)化。C/min升至200°C(Omin)>2°C/min升至250°C(15min);检测器氢火焰离子化检测器(FID);2)以Cayman公司生产的各种脂肪酸甲酯化后为标准品；3)将标准品和上述甲酯化的脂肪酸样品进行GC分析，上样量为1-2pl。4)分析软件spsm型色谱数据处理系统。3.实验结果气相色谱分析显示，转入pYND6的酵母诱导表达后能将外源加入的脂肪酸底物LinoleicAcid(18:2A9,12)催化生成y画LinoenicAcid(18:3A6,9,12),以及催化a-LinolenicAcid(18:3A9，12,15)生成StearidnoicAcid(18:4A6，9，12,15)。说明所转基因编码的蛋白的确具有A6脂肪酸去饱和酶的功能，确认为微拟球藻的A6脂肪酸去饱和酶。气相色谱分析如图l,2所示，图1为加入LA后结果，其中1-A为转入空pYES2质粒，不加底物的谱峰图，1-B为加入LA底物的转空pYES2质粒的谱峰图，l-C为加入LA底物的转pYND6质粒的谱峰图,1-D为标准品对照。虽然有背景峰的干扰，但还是可以明显的看到ND6基因能在酵母中得到活性表达，催化LA生成DLA,而空白对照无此功能。图2为加入ALA结果。其中2-A为转入空pYES2质粒，不加底物的谱峰图，2-B为加入ALA底物的转空pYES2质粒的谱峰图，2-C为加入ALA底物的转pYND6质粒的谱峰图，2-D为标准品对照。虽然有背景峰的干扰，但还是可以明显的看到ND6基因能在酵母中得到活性表达，催化ALA生成SDA(SDA的谱峰比背景峰明显高)，而空白对照无此功能。n6转化效率比18:2A9，12和18:3A6,9，12在分析图中所占百分比分别为6.63和3.92,其转化比为6.63+3.9218:3A6，9,12/(18:2A9，12+18:3A6,9，12)=3.92/(6.63+3.92)=37%n3转化效率比(18:3A9，12,15)和(18:4A6,9，12，15)在分析图中所占百分比分别为7.74和5.86，其转化比为(18:4A6，9，12,15)/(18:3A9，12,15+18:4A6，9，12，15)=5.86/(7.74+5.86)=43%参考文献DomergueF,LerchlJ，ZahringerU，HeinzE(2002).CloningandfunctionalcharacterizationofP/zaeoJaci^/wm/t/co/ttz^wwfront-enddesaturasesinvolvedindicosapenaenoicacidbiosynhesis.￡wrJS&c/^柳269，4105-4113.AbbadiA，DomergueF，BauerJ，NapierJA，WeltiR，ZahringerU，CirpusP，HeinzE(2004).Biosynthesisofverylong-chainpolyunsaturatedfattyacidsintransgenicoilseeds:constraintsontheiraccumulation.尸/a^Ce//16，2734-2748.CahoonEB，CranmerAM,ShanklinJandOhlroggeJB.1994.HexadecenoicacidissynthesizedbytheactivityofasolubleA6-palmitoyl-acylcarrierproteindesaturasein7T朋Zer一ato"endosperm.編.269:27519-26DomergueF，AbbadiA，HeinzE(2005a).Reliefforfishstocks:oceanicfattyacidsintransgenicoilseeds.7>^&/V"/^/10，112-116.FunkCD(2001).Prostaglandinsandleukotrienes:advancesineicosanoidbiology.294，腦-簡.Giusto画，PasquareSJ，SalvadorPI，RoqueME，IlinchetadeBoscheroMG2000.Lipidmetabolisminvertebrateretinalrodoutersegments.Key39，315-319.HorrocksLA，YeoYK(1999).Healthbenefitsofdocosahexaenoicacid(DHA).尸/2ar顧c0/40,211-215.MarszalekJR，LodishHF(2005).Docosahexaenoicacid,fattyacid-interactingproteins,andneuronalfunction:breastmilkandfisharegoodforyou.7evCe//Dev5/o/21，633-657.QiB，FraserT，MugfordS，DobsonG,SayanovaO,ButlerJ，NapierJA，LazarusCM(2004).Productionofverylongchainpolyunsaturatedomega-3andomega-6fattyacidsinplants.Ato22,739-745,SayanovaO，NapierJA(2004).Eicosapentaenoicacid:biosyntheticroutesandthepotentialforsynthesisintransgenicplants.尸AjY0c/7e;w、/r少65,147-158.SimopoulosAP(2002).Omega-3fattyaddsininflammationandautoimmunediseases.Co//她r21，495-505.TononT,LarsonTR,GrahamIA(2002).Longchainpolyunsaturatedfattyacidproductionandpartitioningtotriacylglycerolsinfourmicroalgae.尸/z;Yoc/^附/s^y61，15-24.TruksaM，WuG，VrintenV，QiuX(2006).Metabolicengineeringofplantstoproduceverylong-chainpolyunsaturatedfattyacids,rmw砂m'c15,131-137.UauyR,HoffmanDR，PeiranoP，BirchDG，BirchEE(2001).Essentialfattyacidsinvisualandbraindevelopment.Z^/^/y36，885-895.WuG，TruksaM，DatlaN，VrintenP,BauerJ，ZankT，CirpusP，HeinzE，QiuX(2005).Stepwiseengineeringtoproducehighyieldsofverylong-chainpolyunsaturatedfattyacidsinplants.胸B她c/mo/23，1013-1017.序列表〈110>中国海洋大学〈120>—种海洋微藻delta6脂肪酸去饱和酶及其应用〈130〉<勝8<170>Patentlnversion3.3<210〉1〈211>1425〈212>丽〈213>Narmochloropsis.oculata<220><221>CDS〈222〉(1)..(1425)〈400〉1atggcaegggatggcgagccggtcgagacgacggagtctttgagettc48MetAlaArgAspGlyGluProValGluThrThrGluSerLeuSerPhe151015acggccgacaaggcggggaccateaagcagcgtgggeggaagateaca96ThrAlaAspLysAlaGlyThrlieLysGinArgGlyArgLyslieThr202530tgggatgaggtgcgtcagcacaagacgcctcaggacgettggetcgtg144TrpAspGluValArgGinHisLysThrProGinAspAlaTrpLeuVal354045tataggaataaggtctacgacgtgtegagetggcaagatcaccccggg192TyrArgAsnLysValTyrAspValSerSerTrpGinAspHisProGly505560gggaacgtcatettcactcacgccggcggggactgcacggatattttc240GlyAsnValliePheThrHisAlaGlyGlyAspCysThrAspliePhe65707580gcggcgttccaccctcttggcgccacctcttatcttgatccattttac288AlaAlaPheHisProLeuGlyAlaThrSerTyrLeuAspProPheTyr859095attggcgagctggagccgcgcteggacaagaagcccgcagcgcaggcg336lieGlyGluLeuGluProArgSerAspLysLysProAlaAlaGinAla100105110aactttgagcgcgcctacagggatetcagggggaagcttategcgggt384AsnPheGluArgAlaTyrArgAspLeuArgGlyLysLeulieAlaGly115120125gggtttttcaaggcgaatcctttgtaptatgtctggaaggtagtateg432GlyPhePheLysAlaAsnProLeuTyrTyrValTrpLysValValSer130135140teagttgcccttgetgtaggtgcgtgggtgctggtggettggtegcag480SerValAlaLeuAlaValGlyAlaTrpValLeuValAlaTrpSerGin145150155160aacctgggcgtgcagatgctgtctgcgtttttggtggetctgttctgg528AsnLeuGlyValGinMetLeuSerAlaPheLeuValAlaLeuPheTrp165170175cagcaatgtggctggttggcccatgacttcctgcaccaccaggtattt576GinGinCysGlyTrpLeuAlaHisAspPheLeuHisHisGinValPhe180185190aagaaccgtgcgttgggtgacctggccggcategttateggcaatgtc624LysAsnArgAlaLeuGlyAspLeuAlaGlylieVallieGlyAsnVal195200205ttccagggtttctecgtggcatggtggaagaacaagcataacactcac672PheGinGlyPheSerValAlaTrpTrpLysAsnLysHisAsnThrHis210215220cacgcggtgccc.aacetcgtcgagtectctccggacgcgcaagacgca720HisAlaValProAsnLeuValGluSerSerProAspAlaGinAspAla225230235240gaccctgacattgacaccatgcccatactggcctggtegetcaagatg768AspProAsplieAspThrMetProlieLeuAlaTrpSerLeuLysMet245250255gccgacagggcgcagcaatacteatggggacccttctttgtcaggcat816AlaAspArgAlaGinGinTyrSerTrpGlyProPhePheValArgHis260265270cagtegctgetatacttccccatectgetcgtggcgeggattteatgg864GinSerLeuLeuTyrPheProlieLeuLeuValAlaArglieSerTrp275280285ttgatgcagtegttcttgtttgtctttgactecgtccctggagcgagt912LeuMetGinSerPheLeuPheValPheAspSerValProGlyAlaSer290295300ctgtgggcaaccaagggcgcgacggetgagagacaggcgateaagaat960LeuTrpAlaThrLysGlyAlaThrAlaGluArgGinAlalieLysAsn305310315320gtcgggttggagaaggtggggctggttgcgcactacctgtggtacggt1008ValGlyLeuGluLysValGlyLeuValAlaHisTyrLeuTrpTyrGly325330335gcgctgatgctgtgccacatgtecctggcccgcgccctgctgtacttc1056AlaLeuMetLeuCysHisMetSerLeuAlaArgAlaLeuLeuTyrPhe340345350ctgccgagecagatgatgtgcgggttcttgetcgcgcttgttttcggg1104LeuProSerGinMetMetCysGlyPheLeuLeuAlaLeuValPheGly355360365cttgggcacaacggcatggatgtttacgacgcggacgcceggcccgac1152LeuGlyHisAsnGlyMetAspValTyrAspAlaAspAlaArgProAsp370375380ttctggaagctgcaggtgacgacgPheTrpLysLeuGinValThrThr385390acgagg咖gtgacgggctegtggThrArgAsnValThrGlySerTrp3954001200ttggtgcagtggttctgtggcggcetcggctaccaggtggaccaccacLeuValGinTrpPheCysGlyGlyLeuGlyTyrGinValAspHisHis4054104151248ctgttccccatgateccgeggcaccgcetagggaagetccacgggetcLeuPheProMetlieProArgHisArgLeuGlyLysLeuHisGlyLeu4204254301296gtggagggtttctgcaaggatcacggggtgaagtaccacgagacgaatValGluGlyPheCysLysA印HisGlyValLysTyrHisGluThrAsn4354404451344atgtgggaggggaccaaagaggtgttggetcacttgageagtgtgacgMetTrpGluGlyThrLysGluValLeuAlaHisLeuSerSerValThr45045546013923肪gsgttcgtggccga/tttcgccgetgtgt肌LysGluPheValAlaAspPheAlaAlaVal4654701425〈210〉2<211〉474<212>PRT〈213>N肌nochloropsis.<400>2oculataMetAlaArgAspGlyGluProValGluThrThrGluSerLeuSerPhe151015ThrAlaAspLysAlaGlyThrlieLysGinArgGlyArgLyslieThr202530TrpAspGluValArgGinHisLysThrProGinAspAlaTrpLeuVal354045TyrArgAsnLysValTyrAspValSerSerTrpGinAspHisProGly505560GlyAsnValliePheThrHisAlaGlyGlyAspCysThrAspliePhe65707580AlaAlaPheHisProLeuGlyAlaThrSerTyrLeuAspProPheTyr859095lieGlyGluLeuGluProArgSerAspLysLysProAlaAlaGinAla100105110AsnPheGluArgAlaTyrArgAspLeuArgGlyLysLeulieAlaGly115120125GlyPhePheLysAlaAsnProLeuTyrTyrValTrpLysValValSer130135140SerValAlaLeuAlaValGlyAlaTrpValLeuValAlaTrpSerGin145150155160AsnLeuGlyValGinMetLeuSerAlaPheLeuValAlaLeuPheTrp165170175GinGinCysGlyTrpLeuAlaHisAspPheLeuHisHisGinValPhe180185190LysAsnArgAlaLeuGlyAspLeuAlaGlylieVallieGlyAsnVal195200205PheGinGlyPheSerValAlaTrpTrpLysAsnLysHisAsnThrHis210215220HisAlaValProAsnLeuValGluSerSerProAspAlaGinAspAla225230235240AspProAsplieAspThrMetProlieLeuAlaTrpSerLeuLysMet245250255AlaAspArgAlaGinGinTyrSerTrpGlyProPhePheValArgHis260265270GinSerLeuLeuTyrPheProlieLeuLeuValAlaArglieSerTrp275280285LeuMetGinSerPheLeuPheValPheAspSerValProGlyAlaSer290295300LeuTrpAlaThrLysGlyAlaThrAlaGluArgGinAlalieLysAsn305310315320ValGlyLeuGluLysValGlyLeuValAlaHisTyrLeuTrpTyrGly<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><211><212><213>24DNA人工序列〈400〉5gttcatggccacgaagtagagacc〈210〉6〈211>24<212>腿<213>人工序列〈400〉6cagtcgcgtacgaatgccagcaga24<210>7〈211〉36〈212〉腿<213〉人工序列<210>8<211〉36<212〉纖<213>人工序列〈400>8gcggagctcttcgcttccctccgtccgtttacacag36〈400〉7cgggtaccaccatggcacgggatggcgagccggtcg权利要求1、一种海洋微藻Δ6脂肪酸去饱和酶，其具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列或者该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。2、编码权利要求1所述海洋微藻A6脂肪酸去饱和酶的基因。3、如权利要求2所述的基因，其具有SEQIDNO.l所示的核苷酸序列。4、含有权利要求2或3所述序列的表达载体。5、含有权利要求4所述表达载体的宿主。6、如权利要求5所述的宿主，其为油料植物。7、权利要求1所述的酶在制备EPA中的应用。8、权利要求1所述的酶在制备DHA中的应用。全文摘要本发明提供了一种海洋微藻Δ6脂肪酸去饱和酶、其编码基因及应用。本发明的Δ6脂肪酸去饱和酶具有序列表SEQIDNO.2所示的氨基酸序列或者该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明的Δ6脂肪酸去饱和酶可以有效地催化LinoleicAcid(LA，18:2Δ9，12)生成γ-LinolenicAcid(GLA，18:3Δ6，9，12)，以及催化α-LinolenicAcid(ALA，18:3Δ9，12，15)生成StearidnoicAcid(SDA，18:4Δ6，9，12，15)。文档编号C12N15/63GK101289659SQ20081011524公开日2008年10月22日申请日期2008年6月19日优先权日2008年6月19日发明者于文功,俞建中,朱葆华,杨官品,潘克厚,马晓磊申请人:中国海洋大学