糙草△6-脂肪酸脱饱和酶ApD6D基因家族及其重组表达载体和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了糙草△6-脂肪酸脱饱和酶ApD6D基因家族及其重组表达载体和应用，ApD6D基因家族包括ApD6D1和ApD6D2两个成员，具有△6-脂肪酸脱饱和酶活性，能够催化亚油酸形成γ-亚麻酸(GLA)，也能够催化α-亚麻酸(ALA)形成十八碳四烯酸(SDA)，将ApD6D1和ApD6D2正义转入糙草自身以后，转基因糙草种子中GLA和SDA含量大幅提高；转入甘蓝型油菜以后，转基因油菜种子中积累了非转基因油菜种子所不具有的GLA和SDA；表明利用ApD6D基因家族能够创造新资源材料，并用于工业生产GLA和SDA，或直接用于生产富含GLA和SDA的保健型食用油。
【专利说明】糙草A6-脂肪酸脱饱和酶ApD6D基因家族及其重组表达载 体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及糙草A 6-脂肪酸脱饱和酶ApD6D基因家族， 还涉及ApD6D基因家族的重组表达载体和应用。
【背景技术】
[0002] 多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids, PUFA)是在碳原子之间 含有两个以上双键的不饱和脂肪酸，其代谢途径是以亚油酸（Linoleic acid，LA; C18:3A9'12，n-6)为初始底物，在一系列脂肪酸脱饱和酶（脂肪酸脱氢酶）和脂肪酸 延伸酶的催化下，先后生成Y -亚麻酸（Y-linolenic acid, GLA ;C18:3 A6'9'12, n-6)、 〇-亚麻酸（<1-1：[1101611；[0&(^(1，六1^;018:3八 9'12'15，11-3)、十八碳四烯酸（8七6&1'1(1011；[0 已。1(1，30六，0(^3(16。3七61：四6110；[。3。1(1，（7^，018:4八6' 9'12'15，11-3)、双高丫-亚麻酸（0111^)、 花生四烯酸（ARA)、二十碳五烯酸（EPA，n-3)、二十二碳五烯酸（DPA)、二十二碳六烯酸 (DHA，n-3)等长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFAs)或超长链多不饱和脂肪酸（VLC-PUFAs)。
[0003] PUFA能促进生长发育，调节人体的脂质代谢，还能治疗和预防心脑血管疾病，同 时具有免疫调节、抗癌、延缓衰老等重要的生理功能，对人类健康起到非常重要的作用。 Q3(n-3)系列脂肪酸对人体具有重要生理功能，其中ALA是n-3PUFA(EPA、DHA)合成前体； EPA是一类重要的多聚不饱和脂肪酸化学信使物，在免疫和炎症反应上起至关重要的作用； DPA是生成DHA的中间产物，对冠心病具有潜在的抑制作用；DHA是视网膜正常发育和发挥 其正常功能所必需的，大脑和神经组织中DHA含量远远高于机体其他组织，对神经功能发 挥着至关重要的作用。Q6(n-6)系列脂肪酸对人体也具有重要生理功能，其中GLA是组成 人体各组织生物膜的结构材料，也是合成前列腺素的前体，GLA水平的不足可导致体内机能 的紊乱，引起某些疾病，如糖尿病、高血脂等。
[0004] A 6-脂肪酸脱饱和酶（A 6fatty acid desaturase，D6D)是一种多功能酶，也是 PUFA生物合成途径经第一步限速酶，它能够以LA为底物催化合成GLA，也能够以ALA为底 物催化合成SDA，据报道在它哺乳动物中还能够催化以24C-PUFA为底物的生化反应。
[0005] 理论上人体只需要通过食物等途径摄入足够的LA和ALA，就可以利用人体自身的 D6D等酶系统将它们分别合成为GLA和EPA、DHA，但残酷的现实是人体D6D活性很低而且易 被多种环境因素（如膳食中的脂肪）所抑制。这就导致人体即使摄入了足够的底物LA和 ALA，但合成GLA、EPA、DHA的水平依然严重不足，因此需要直接摄入GLA、EPA、DHA等来补充 其不足。
[0006] GLA作为人体内必需的不饱和脂肪酸，成年人每日需要量约为36mg/kg。传统补充 人体EPA和DHA的主要途径是深海鱼油，鱼油中的PUFA实际上是鱼通过取食藻类物等而富 集在体内的，该种方式受到鱼类资源量的极大限制，来源极为有限，缺乏可持续性，且工艺 复杂，成本高，价格昂贵。最近的研究表明，人体能够利用摄入的SDA迅速而有效地合成为 EPA，进一步合成DHA，其效果虽然比直接摄入EPA和DHA略差，但远远比摄入ALA的效果好 得多，可以有效解决人体EPA和DHA不足的问题。因此，直接补充EPA和DHA的方式完全可 以由补充SDA的方式所取代。研究发现，不仅一些真菌和藻类物种中能够合成SDA，而且少 数植物也能够合成SDA，紫草科（Boraginaceae)特别是蓝蓟属（Echium)植物、少数报春花 属（Primula)植物的种子油脂中富含SDA，原因是它们的D6D酶能够有效利用ALA生成SDA， 其它植物中SDA的情况以及D6D酶对ALA底物的利用效率问题则有待研究。
[0007] PUFA在市场上一直供不应求，而且市场需要量还在不断地增长。培养藻类和真菌 生产PUFA是一个重要的研究热点，而且已经取得重要成就，但仍然受到操作复杂、成本高、 价格贵的困扰。利用植物系统尤其是大宗油料作物的种子来生产PUFA，相比动物、真菌、藻 类等生产途径，具有容易上规模、种植简单、成本相对较低、安全性好的优点。虽然大宗油料 作物如油菜、大豆、花生、棉花、向日葵、棕榈、橄榄中不存在GLA，所有高等植物都不具有合 成EPA和DHA的关键酶，而且通过植物代谢工程生产EPA和DHA在技术上极其困难，但如果 通过基因工程方式导入既能利用LA也能利用ALA为底物的外源D6D基因，则可以利用大宗 油料作物来生产GLA和SDA，满足市场需求量，并降低成本。
[0008] 糙草（Asperugo procumbens)系紫草科糙草属一至二年生蔓生草本植物，在我国 主要分布于我国的西藏、新疆、青海、甘肃、陕西、内蒙等地，适应于青藏高原，对寒、旱、强紫 外线具有很强的适应性，种籽种含油率可达26. 65 %，不饱和脂肪酸达90 %左右，ALA、SDA、 GLA的含量分别达到36. 46%、11. 75%、5. 35%，是能同时提供多种PUFA的珍稀新油源植 物，已受到业界关注并开始被人工驯化种植。但是，天然糙草籽油中GLA和SDA的含量仍然 不高，通过代谢工程大幅提高其GLA和SDA含量具有重要的现实意义。
[0009] 甘蓝型油菜（Brassica napus L.，2n = 38，AACC)为我国五大油料作物之首，经济 性状好，产量高，含油量高，抗逆性强，是重要的食用油和蛋白质饲料来源，也是重要的工业 原料。菜子油品质改良的重要内容是改善其中脂肪酸的成分和含量，对于普通食用型菜籽 油而言，主要集中在降低或消除芥酸，增加油酸的比例，减少易导致油腐败的ALA的比例， 提高含油量。通过导入外源D6D基因，利用油菜这一传统大宗油料作物作为生物反应器，来 生产GLA、SDA等PUFA，是油菜品质改良和分子育种的另一个重要方面，在人类的医药保健 领域具有重要的意义。
【发明内容】
[0010] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供糙草a6-脂肪酸脱饱和酶ApD6D基因家 族，本发明的目的之二在于提供含有糙草△ 6-脂肪酸脱饱和酶ApD6D基因家族的重组表 达载体；本发明的目的之三在于提供含有上述所述重组表达载体的转化子；本发明的目的 之四在于提供糙草A 6-脂肪酸脱饱和酶ApD6D基因家族在提高糙草属植物亚麻酸和 十八碳四烯酸含量中的应用；本发明的目的之五在于提供糙草A6-脂肪酸脱饱和酶ApD6D 基因家族在大宗油料作物重建亚麻酸和十八碳四烯酸合成途径中的应用。
[0011] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0012] 1、糙草八6-脂肪酸脱饱和酶4口060基因家族，所述4口060基因家族包括4口0601 和ApD6D2两个成员；所述ApD6Dl的氨基酸序列如SEQ ID N0. 5所示或SEQ ID N0. 5所示 氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于糙草的具有△ 6-脂肪酸脱饱和酶 活性的氨基酸序列；所述ApD6D2的氨基酸序列如SEQ ID N0. 6所示或SEQ ID N0. 6所示氨 基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于糙草的具有△ 6-脂肪酸脱饱和酶活 性的氨基酸序列。
[0013] 优选的，所述ApD6Dl的氨基酸序列如SEQIDN0. 5所示；所述ApD6D2的氨基酸序 列如SEQIDN0. 6所示。
[0014] 优选的，所述ApD6Dl的基因序列如SEQ ID NO. 3所示或SEQ ID NO. 3所示核苷酸 序列经取代、缺失或添加至少一个核苷酸，且来源于糙草的编码具有△ 6-脂肪酸脱饱和酶 活性的核苷酸序列；所述4口0602的基因序列如3￡〇10勵.4所示或3￡〇10勵.4所示核苷 酸序列经取代、缺失或添加至少一个核苷酸，且来源于糙草的编码具有△ 6-脂肪酸脱饱和 酶活性的核苷酸序列。
[0015] 优选的，所述ApD6Dl的基因序列如SEQIDN0. 3所示，所述ApD6D2的基因序列如 SEQIDN0. 4 所示。
[0016] 2、含有所述糙草A 6-脂肪酸脱饱和酶ApD6D基因家族的重组表达载体。
[0017] 优选的，所述重组载体含有ApD6Dl基因编码区或ApD6D2基因编码区的序列，所述 ApD6Dl基因编码区的序列对应于SEQIDNo. 3第162?1511位碱基所示，所述ApD6D2基 因编码区的序列对应于SEQIDNo. 4的第390?1739位碱基所示。
[0018] 更优选的，所述重组表达载体是将ApD6Dl基因编码区或ApD6D2基因编码区的序 列插入PC2301M1NPB载体的NapA启动子与Nos终止子之间而得；
[0019] 或所述重组表达载体是ApD6Dl基因编码区或ApD6D2基因编码区的序列插入 PYES2质粒的Xbal和BamHI酶切位点而得；
[0020] 所述pC2301MlNPB载体由以下方法制备：用Hindlll和EcoRI切下pBI121上的 ⑶S基因表达盒然后插入pCAMBIA2301载体的Hindlll和EcoRI酶切位点处，然后用SacI 和Xmal切去⑶S基因后用带有SacI和Xmal粘性末端的序列连接，得pC2301Ml载体，然后 在PC2301M1载体Hindlll酶切位点处连入由MAS启动子驱动bar基因表达、MAS终止子终 止表达的bar基因表达盒，得PC2301M1B载体；最后将PC2301M1B载体上的CaMV35S启动子 用种子特异启动子NapA替换即得PC2301M1NPB载体。
[0021] 3、含有所述重组表达载体的转化子。优选的，所述转化子为农杆菌，更优选的所述 农杆菌为LBA4404。
[0022] 4、所述糙草A 6-脂肪酸脱饱和酶ApD6D基因家族在提高糙草属植物Y _亚麻酸 和十八碳四烯酸含量中的应用。
[0023] 5、所述糙草A 6-脂肪酸脱饱和酶ApD6D基因家族在大宗油料作物重建Y_亚麻 酸和十八碳四烯酸合成途径中的应用。优选的，所述大宗油料作物为油菜、大豆、花生、棉 花、向日葵、棕榈或橄榄，更优选的，大宗油料作物为油菜；最优选的，所述油菜为甘蓝型油 菜。
[0024] 本发明的有益效果在于：本发明提供了糙草ApD6D基因家族2个成员ApD6Dl和 ApD6D2的全长cDNA序列和gDNA序列、编码蛋白序列和结构特征、进化关系、表达的器官组 织特异性等，并确认了ApD6D基因家族成员均编码有双活性的A6-脂肪酸脱饱和酶，采用 转基因技术将ApD6Dl和ApD6D2基因正义转化糙草后能够大幅度提高种子中GLA和SDA的 含量，将ApD6Dl和ApD6D2正义转化甘蓝型油菜后均能够引起种子中积累GLA和SDA，证明 ApD6D基因家族在植物GLA和SDA性状的分子育种方面具有很好的应用前景，其转基因植物 可应用于工业提取GLA和SDA，或直接应用于生产富含GLA和SDA的保健型食用油。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0026] 图1为ApD6D基因家族的克隆电泳图，其中a为ApD6D基因家族保守区标签序列 的扩增（A为ApD6Dl，B为ApD6D2)，b为ApD6Dl和ApD6D2的5' -RACE的巢式扩增（E为 ApD6Dl，F 为 ApD6D2)，c 为 ApD6Dl 的 3' -RACE 的巢式扩增（G 为 ApD6Dl)，d 为 ApD6D2 的 3' -RACE的巢式扩增（H为ApD6Dl)，e为ApD6Dl和ApD6D2的全长cDNA扩增（E和F为 ApD6Dl，G、H 为 ApD6D2)，M 为 Trans2K plus DNA marker。
[0027] 图2为ApD6Dl和ApD6D2的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列图（A为ApD6Dl，B 为ApD6D2,起始密码子和终止密码子加方框，转录起始位点和poly (A)加尾位点加下划线 (主要位点为粗体）。
[0028] 图3为ApD6Dl和ApD6D2蛋白的系统分析图[D6D : A 6-脂肪酸脱饱和酶；sD8D : A 8-鞘脂脱饱和酶（也简称为SLD);角齿藓（Ceratodon purpureus，CAB94993. 1);地 钱（Marchantia polymorpha，AAT85661. 1);银莲花（Anemone leveillei，AAQ10731. 1); 银莲花（Anemone leveillei，AAQ10732. 1);黑加仑（Ribes nigrum，ADA60230. 1);黑加 仑（Ribes nigrum，ADA60228. 1);拟南芥（Arabidopsis thaliana，AAM648951);琉璃苣 (Borago officinalis，AAG43277. 1);琉璃苣（Borago officinalis，AAD01410. 1);蓝 蓟（Echium gentianoides，AAL23580. 1);烟草（Nicotiana tabacum，AB031111. 1);油茶 (Camellia oleifera，ADD10720. 1);柱花草（Stylosanthes hamata，ABU98945. 1);报春花 (Primula vialii，AAP23036. 1);报春花（Primula vialii，AAP23035. 1)]。
[0029] 图4为ApD6Dl和ApD6D2在糙草各器官中转录表达的荧光定量PCR检测结果（A 为ApD6Dl及其等位基因ApD6Dl'，B为ApD6D2及其等位基因ApD6D2'）。
[0030] 图 5 为酵母菌株 INVScI 分别转 pYES2 (对照）、pYES2-ApD6Dl 和 pYES2-ApD6D2 的脂肪酸GC检测图（A :转pYES2质粒酵母菌株INVScI脂肪酸GC检测结果；B :转 pYES2-ApD6Dl质粒酵母菌株INVScI脂肪酸GC检测结果；C :转pYES2-ApD6D2质粒酵母菌 株INVScI脂肪酸GC检测结果）。
【具体实施方式】
[0031] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0032]本发明实施例采用的植物材料为糙草（Asperugo procumbens)，采自青海省西宁 市湟中县上新庄镇地光村（海拔约3150m)，同时收获糙草成熟种子用于转基因研究。甘蓝 型油菜（Brassica napus)品种中双10号种子由中国农业科学院油料作物研究所张学昆研 究员惠赠，油菜品种中油821等其它品种材料为自己保存，种植条件为常规试验条件。
[0033] 本发明实施例采用的试剂及试剂盒：SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit 为美国 Clontech 公司产品；PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)>SYBR:?Premix Ex Taq? II(Tli RNaseH Plus)R0X plus>DNA Ligation Kit> pMD18_T、pMD19_T、Taq DNA 聚合酶、DNase I (RNase-free)及 buffer、RNase Inhibitor、 DL-2000及入-Hindlll DNA Marker购自大连宝生物（TaKaRa)生物工程有限公司；小量 植物组织RNA抽提试剂盒、胶回收试剂盒、小量法质粒抽提试剂盒购自上海华舜生物技术 有限公司；限制性内切酶购自立陶宛MBI Fermentas公司；MS(Murashige&Skoog medium， including vitamins)培养基为荷兰 Duchefa 公司产品；DL_2000plus、Easy-Taq 酶、dNTPs 等试剂购自北京全式金（Transgen)生物技术有限公司；X-Gluc(5-brom〇-4-chlor〇-3_ind olyl-0-D-glucuronic acid)、利福平（Rif)、链霉素（Str)、卡那霉素（Kan)、氨节青霉素 (Amp)、琼脂糖、Tris、CTAB、Tris 饱和酌?（pH = 8. 0)、Tryptone、Yeast Extract、X-gal、 IPTG、CTAB等其它生化与分子生物学试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司；植物 激素购自上海稼丰园艺用品等公司。
[0034] 本发明实施例采用的主要仪器：Veriti?多重控温PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；CFX96荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；气相色谱仪（Gas Chromatography，GC)为日本岛津GC-7A型；以及分子生物学和基因工程的其它仪器设备。
[0035] 本发明实施例所用PCR引物和衔接子序列由上海英骏/英潍捷基公司、上海生工 或北京六合华大公司完成。
[0036] 实施例1、糙草D6D(ApD6D)基因家族的克隆
[0037] (1)糙草基因组总DNA和总RNA的提取
[0038] 取糙草植株的嫩叶，采用十六烷基三甲基溴化胺（CTAB)法提取基因组总DNA，采 用1. 0%琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。结果显示，提取的糙 草基因组总DNA的完整性好，平均分子量略大于入-HindIII DNA Marker的23kb条带，RNA 消化完全，分光光度法检测其纯度也较高，可用于PCR扩增。
[0039] 同时，以糙草的根（Ro)、茎（St)、叶（Le)、蕾（Bu)、花（F1)、早期种子（ES)、中期 种子（MS)、后期种子（LS)为材料，分别采用小量植物组织RNA抽提试剂盒提取总RNA，用 DNase I去除总RNA中含有的DNA杂质，电泳检测总RNA的质量，紫外分光光度计测定总RNA 的浓度和纯度。电泳检测表明获得的总RNA特征条带清晰，无明显RNA降解和DNA污染，分 光光度法检测评价的质量也较好，能够满足后述实验的要求，然后储存于_80°C冰箱备用。
[0040] (2)糙草种子RACE总cDNA第一链的获得
[0041] 取糙草各发育阶段的总RNA各1 ii g混合，采用SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit 按照其说明书操作，分别得到 5' -RACE-Ready cDNA 和 3' -RACE-Ready cDNA第一链备用。
[0042] (3)ApD6D基因家族保守区的扩增
[0043] 通过 Vector NTI Advance 9. 0 对琉璃苣（Borago officinalis)、蓝蓟（Echium gentianoides)、草玉梅（Anemone leveillei)、高穗花报春（Primula vialii)等植物 的D6D基因进行多重比对，根据保守点设计兼并引物，上游引物为FBD6D0,下游引物为 RBD6D0,具体序列如表1所示。然后以3' -RACE-Ready cDNA 1 ii 1为模板，FBD6D0和RBD6D0 为引物，扩增ApD6D基因家族的保守区序列。PCR反应的程序为：94°C预变性2min ;94°C变 性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min，35个循环；72°C延伸10min。将PCR扩增产物进行 电泳检测，结果如图1中a所示。结果显示，扩增出了 1条近1. 4kb的特异条带，然后回收 特异条带，并进行TA克隆后转化大肠杆菌，送7个阳性克隆子测序，将测序结果进行多重比 对后发现获得了 2个独立基因（unigene)的标签序列，净长度分别为1350bp和1353bp (不 计引物上的人工酶切位点），其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。经 nucleotide blast (http: //blast, ncbi. nlm. nih. gov/)比对后发现它们均与植物特别是 紫草科D6D基因最同源，表明该序列为ApD6D基因家族2个成员的标签序列，分别命名为 ApD6Dl和 ApD6D2。
[0044] (4)ApD6D基因家族5'-cDNA末端和3'-cDNA末端的扩增
[0045] 根据克隆获得的保守区标签序列，分析保守区序列的同源性后，设计了克 隆 ApD6Dl 和 ApD6D25' 端的 4 个反向引物，分别如下 RBD6D5-1、RBD6D5-2、RApD6D2S、 RApD6D2SN，其引物序列如表1所示。然后以5'-RACE-Ready cDNA liiL为模板，用引物组 合UPM与RBD6D5-1和UPM与RApD6D2S分别进行ApD6Dl和ApD6D2基因的5' -RACE的第 一次PCR扩增。PCR反应程序为：94°C预变性2min ;94°C变性30sec，62°C退火30sec，72°C 延伸lmin，22个循环；72°C延伸lOmin。再以第一次扩增PCR产物0. liiL为模板，用引物 组合NUP与RBD6D5-2和NUP与RApD6D2SN分别进行ApD6Dl和ApD6D2基因的5' -RACE的 巢式PCR扩增，PCR反应程序同第一次PCR扩增，区别为退火温度为60°C且扩增30个循环。 将巢式PCR扩增产物进行电泳检测，结果如图1中b所示。结果显示，ApD6Dl和ApD6D2基 因的5' -RACE均产生了 1条约800bp的宽带，与其它植物D6D基因序列预测的长度相近。 回收ApD6Dl和ApD6D2基因的5' -RACE扩增条带、经TA克隆后转化大肠杆菌，将转化子用 PCR进行检测，结果显示，ApD6D2插入片段存在长度多态性，根据检测结果各送7个代表性 克隆子测序，结果表明ApD6Dl的5' -cDNA末端净长度为760bp，ApD6D2的5' -cDNA末端净 长度为931bp、830bp、817bp、789bp、678bp、607bp 6种，且短片段包含在长片段序列内，表 明ApD6D2的5' -cDNA具有长度多态性，这可能由转录起始位点的位置不同而引起的。
[0046] 根据前面克隆获得的保守区标签序列，分析保守区序列的同源性后，设计克隆 ApD6Dl 和 ApD6D23'端 4 个正向引物，分别如下：FBD6D3-1、FBD6D3-2、FApD6D2S、FApD6D2SN， 引物序列如表1所示。然后以3'-RACE-Ready cDNA liiL为模板，用引物组合FBD6D3-1与 UPM和FApD6D2S与UPM分别进行ApD6Dl和ApD6D2基因的3'-RACE第一次PCR扩增，反应 程序同5' -RACE。取第一次PCR扩增产物0. 1 y L为模板，分别用引物组合FBD6D3-2与NUP 和FApD6D2SN与NUP进行ApD6Dl和ApD6D2的3' -RACE的巢式PCR扩增，PCR反应程序同 第一次PCR扩增，扩增产物分别进行电泳检测，结果分别如图1中c和d所示。结果显示 ApD6D13' -RACE产生了约600bp的条带，ApD6D23' -RACE产生了约400bp的条带，与根据 其它植物D6D基因序列预测的长度相近。将扩增产物进行胶回收、经TA克隆后转化大肠杆 菌，然后将转化子进行PCR检测，结果表明，ApD6D23'-RACE的克隆子存在长度的多态性，分 别送2个ApD6D13' -RACE和4个ApD6D23' -RACE代表性的克隆子测序，结果表明ApD6Dl 的3' -cDNA末端净长度为519bp这1种，ApD6D2的3' -cDNA末端净长度为302、300、279、 192bp这4种，长度多态性可能由poly(A)加尾位置不同而引起的。
[0047] (5)ApD6D基因家族全长cDNA和gDNA的克隆
[0048] 根据ApD6D基因家族的保守区、5'-狀0￡、3'-狀0￡的测序结果，利用软件可以分别 拼接出ApD6Dl和ApD6D2的全长cDNA序列，然后分别设计了 ApD6Dl全长cDNA和gDNA的 扩增引物组合FApD6Dl与RApD6Dl、ApD6D2全长cDNA和gDNA的扩增引物组合FApD6D2u或 FApD6D2d与RApD6D2,引物序列如表1所示。
[0049] 以 3' -RACE-ReadycDNA1iiL为模板，分别用引物组合FApD6Dl与RApD6Dl、 FApD6D2u与RApD6D2、FApD6D2d与RApD6D2 进行扩增，PCR反应程序为：94°C预变性 2min; 94°C变性lmin，56-60°C退火lmin，72°C延伸2min，35个循环；72°C延伸lOmin。扩增产物进 行电泳检测，结果如图1中e所示。结果显示分别获得了约1. 8kb、l. 9kb、l. 8kb的特异条 带，将扩增条件进行回收、经TA克隆后转化大肠杆菌、送克隆子测序。结果表明，ApD6Dl的 全长cDNA为1768bp，核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示；ApD6D2的全长cDNA分别为1912bp 或1811bp，核苷酸序列如SEQIDNO. 4所示和SEQIDNO. 4所示第102位至1912位所示， 扩增获得的全长cDNA序列与拼接序列一致。
[0050] 然后以基因组总DNA 1 ii L为模板，用引物组合FApD6Dl与RApD6Dl、FApD6D2u与 RApD6D2、FApD6D2d与RApD6D2进行PCR扩增，扩增产物回收，经TA克隆、然后测序。结果 显示，以DNA为模板扩增获得序列与获得的全长cDNA序列完全一致，说明这两个基因均没 有内含子。
[0051] 表l、ApD6D基因家族克隆引物
[0052]
【权利要求】
1. 糙草A 6-脂肪酸脱饱和酶ApD6D基因家族，其特征在于：所述ApD6D基因家族包括 八口0601和4口0602两个成员；所述4口0601的氨基酸序列如5￡〇10勵.5所示或5￡〇10勵.5 所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于糙草的具有A 6-脂肪酸脱饱 和酶活性的氨基酸序列；所述ApD6D2的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示或SEQ ID NO. 6所 示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于糙草的具有A 6-脂肪酸脱饱和 酶活性的氨基酸序列。
2. 根据权利要求1所述的糙草A 6-脂肪酸脱饱和酶ApD6D基因家族，其特征在于：所 述ApD6Dl的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示；所述ApD6D2的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6 所示。
3. 权利要求1所述的糙草A 6-脂肪酸脱饱和酶ApD6D基因家族，其特征在于：所述 ApD6Dl的基因序列如SEQ ID NO. 3所示或SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列经取代、缺失或添 加至少一个核苷酸，且来源于糙草的编码具有A 6-脂肪酸脱饱和酶活性的核苷酸序列；所 述ApD6D2的基因序列如SEQ ID NO. 4所示或SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列经取代、缺失或 添加至少一个核苷酸，且来源于糙草的编码具有A 6-脂肪酸脱饱和酶活性的核苷酸序列。
4. 根据权利要求3所述的糙草A 6-脂肪酸脱饱和酶ApD6D基因家族，其特征在于：所 述ApD6Dl的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，所述ApD6D2的基因序列如SEQ ID NO. 4所示。
5. 含有权利要求3所述糙草A 6-脂肪酸脱饱和酶ApD6D基因家族的重组表达载体。
6. 根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组载体含有ApD6Dl基因 编码区或ApD6D2基因编码区的序列，所述ApD6Dl基因编码区的序列对应于SEQ ID No. 3 第162?1511位碱基所示，所述ApD6D2基因编码区的序列对应于SEQ ID No. 4的第390? 1739位碱基所示。
7. 根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是将ApD6Dl 基因编码区或ApD6D2基因编码区的序列插入pC2301MlNPB载体的NapA启动子与Nos终止 子之间而得； 或所述重组表达载体是ApD6Dl基因编码区或ApD6D2基因编码区的序列插入pYES2质 粒的Xbal和BamHI酶切位点而得； 所述PC2301M1NPB载体由以下方法制备：用Hindlll和EcoRI切下pBI121上的⑶S 基因表达盒然后插入PCAMBIA2301载体的Hindlll和EcoRI酶切位点处，然后用SacI和 Xmal切去⑶S基因后用带有SacI和Xmal粘性末端的序列连接，得pC2301Ml载体，然后在 PC2301M1载体Hindlll酶切位点处连入由MAS启动子驱动bar基因表达、MAS终止子终止 表达的bar基因表达盒，得PC2301M1B载体；最后将PC2301M1B载体上的CaMV35S启动子用 种子特异启动子NapA替换即得PC2301M1NPB载体。
8. 含有权利要求5-7任一项所述重组表达载体的转化子。
9. 权利要求1-4任一项所述糙草A 6-脂肪酸脱饱和酶ApD6D基因家族在提高糙草属 植物亚麻酸和十八碳四烯酸含量中的应用。
10. 权利要求1-4任一项所述糙草A 6-脂肪酸脱饱和酶ApD6D基因家族在大宗油料作 物重建亚麻酸和十八碳四烯酸合成途径中的应用。
【文档编号】C12N9/02GK104450748SQ201410658168
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】柴友荣, 柴成燕, 练剑平, 付春, 王瑞, 韩发, 周雪荣, 马赑 申请人:西南大学