一种产油酵母脂肪酸合酶及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种产油酵母脂肪酸合酶及其编码基因与应用。该脂肪酸合酶由RgrFAS1亚基和RgrFAS2亚基组成，所述RgrFAS1亚基是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ?ID?NO：1的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与具有脂肪酸合酶亚基1功能的由SEQ?ID?NO：1所衍生的蛋白质；所述RgrFAS2亚基是如下(c)或(d)的蛋白质：(c)由SEQID?NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将SEQ?ID?NO：2的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与具有脂肪酸合酶亚基2功能的由SEQ?ID?NO：2所衍生的蛋白质。
【专利说明】一种产油酵母脂肪酸合酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种产油酵母脂肪酸合酶及其基因与应用。具体地，所述产油酵母脂肪酸合酶以及编码其的核苷酸来源于禾本红酵母(Rhodotorulagraminis)。本发明还提供一种构建油脂生产重组细胞的方法。
【背景技术】
[0002]油脂是一种氧含量低、能量密度高、碳链长度适中的可再生资源，可以代替化石资源作为化学工业和可再生能源产业的基本加工原料，是人类从碳氢经济向碳氢氧经济过渡的重要链接，其市场潜力巨大。自然界中一部分微生物在特定条件下(如氮源缺乏)能在胞内贮存超过其细胞干重20%的油脂，其中以甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)为主，具有这种表型的微生物称为产油微生物，包括细菌、酵母、霉菌、藻类等，其中产油酵母包括Rhodotorula, Candida, Cryptococcus, Rhizopus, Trichosporon 和 Yarrowia 属中的某些菌株[Ratledge C, Wynn J P.Adv Appl Microb1l2002, 51,1-51]。利用微生物转化生物质资源生产油脂，可发展成基本不依赖耕地、可连续生产、降低农业污染、资源综合利用的新技术，形成化学品的石化资源替代品生产新途径[赵宗保.中国生物工程杂志2005，25 (2)，8-11]。
[0003]半个世纪以来，国内外微生物油脂研究的重点集中在菌株筛选、驯化和发酵工艺优化等领域，取得了重大进展。随着生物技术的快速发展，单纯的菌种筛选和培养工艺的优化已不能满足产油微生物性状改良的需要。做为某一化学品的天然生产菌株，其特定的生产性能往往并非 最优。如何优化或改变工业菌株的代谢网络和表达调控网络，以提高生物基产品的积累速度或定向控制靶产品的质量，是当今生物【技术领域】研究的热点和难点。油脂发酵研究需要油脂代谢途径的重构和强化，赋予重组菌株生产新型脂肪酸衍生物的性能。由于优良土著生产菌株的遗传背景目前仍不清楚，油脂积累代谢调控相关基因克隆有限，寻找更多的油脂积累代谢调控相关基因，是目前微生物油脂研究的重要方向之一。
[0004]研究人员发现，来源于产油微生物(圆红冬孢酵母和斯氏油脂酵母)的异柠檬酸脱氢酶(IDH)和苹果酸酶(ME)的编码基因在土著菌油脂积累过程中有表达差异，酿酒酵母功能互补分析也证明这些基因可增加重组菌株的油脂含量，但并没能将一个非产油菌株成功改造成一个产油菌株[Yang F, Zhang SF, Zhou YJ, Zhu Zff, Lin XP, Zhao ZK.Appl.Microb1l.B1technol.2012,94(4)，1095-1105]。实验结果暗示，微生物油脂积累代谢调控可能涉及更多的基因及其间的相互调节和相互作用。
[0005]从乙酰CoA和丙二酸单酰CoA从头合成短链和中长链饱和脂肪酸，需要一系列的克莱森缩合反应并脱羧，是由几种酶活介导催化的复杂过程。在大多数细菌和植物中，这些酶活性是由离散的单功能多肽组成的酶系来完成(脂肪酸合酶类型II);而在哺乳动物和真菌中，这些酶活性则由一个或两个多功能多肽组成的寡聚酶来行使(脂肪酸合酶类型I)。在脂肪酸合成过程中，底物和中间产物分子在各个功能结构域(可以位于同一酶分子，也可以位于不同酶分子)中传递直到完成脂肪酸的整个合成过程[stoops JK,Arslanian MJ, Oh YH, Aune KC, Vanaman TC, Wakil SJ.Proc Natl Acad SciUSA.1975,72(5)，1940-1944]。
[0006]哺乳动物中的脂肪酸合酶(Fatty Acid Synthase, FAS)是一个同源二聚体,含有两个相同的多功能亚基(亚基分子量为272kDa)，每一个亚基的N端区域含有三个催化结构域:酮酯-酸基 ACP 合酶(ketoacyl synthase, KS)、单酸 / 乙酸转移酶(acyltransferase,AT)和脱水酶(dehydratase, DH), C端区域则含有四个结构域:烯酰ACP还原酶(enoylreductase, ER)、酮脂酸还原酶(ketoacyl reductase, KR)、酸基载体蛋白(acyl carrierprotein, ACP)和硫酯酶(th1esterase, TE);这两个区域被中间600个氨基酸残基组成的核心区域所分隔。在子囊菌门酵母中，ACP和其它6个酶活性结构域分别定位于两个不同亚基上，其一具有ACP、KR、KS和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyltransferase, PPT)结构域，另一亚基则含有AT、ER、DH和丙二酰/棕榈酰转移酶(malonyl/palmitoyl transferase, MPT)结构域。
[0007]最近,我们在禾本红酵母(Rhodotorula graminis)中发现一种新颖的脂肪酸合酶，该酶与别的真菌中存在的脂肪酸合酶的不同在于，其beta亚基(FASl)只含有AT(单酰/乙酰转移酶)结构域和ER(烯酰ACP还原酶)结构域，而其余的结构域均在alpha亚基(FAS2)上；同时，该脂肪酸合酶上存在两个前后串联的ACP结构域。截止专利提交日，NCBI上未检索到关于禾本红酵母(R.graminis)脂肪酸合酶的任何序列信息。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种产油酵母脂肪酸合酶及其编码基因与应用。
[0009]本发明提供的产油酵母脂肪酸合酶，名称缩写为RgrFAS (R.graminisFattyAcid Synthase),来源于禾本红酵母(R.graminis) JCM8242,所述产油酵母脂肪酸合酶由RgrFASl亚基和RgrFAS2亚基组成，其中所述RgrFASl亚基是如下(a)或(b)的蛋白质:
[0010](a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0011 ] (b)将SEQ ID NO:1的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与具有脂肪酸合酶亚基I功能的由SEQ ID NO:1所衍生的蛋白质；
[0012]所述RgrFAS2亚基是如下(C)或(d)的蛋白质:
[0013](c)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0014](d)将SEQ ID NO:2的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与具有脂肪酸合酶亚基2功能的由SEQ ID NO:2所衍生的蛋白质。
[0015]其中所述“脂肪酸合酶亚基I功能”具体是指单酰/乙酰转移酶(AT)活性和烯酰ACP还原酶(ER)活性的加合；其中所述“脂肪酸合酶亚基2功能”具体是指脱水酶(DH)活性、丙二酰/棕榈酰转移酶(MPT)活性、第一酰基载体蛋白(ACP)活性、第二酰基载体蛋白(ACP)活性、酮脂酰还原酶(KR)活性、酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性或磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)活性的加合。
[0016]本 发明还涉及产油酵母脂肪酸合酶(RgrFAS)的生物活性多肽片段(在本文中，也称为结构域)，其氨基酸序列为选自如下片段中的任何一个或者任意两个或更多个片段的组合:
[0017]SEQ ID NO:1的位置191-600 (其具有单酰/乙酰转移酶(AT)活性)，[0018]SEQ ID NO:1的位置612-1143 (其具有烯酰ACP还原酶(ER)活性)，
[0019]SEQ ID NO:2的位置58-488 (其具有脱水酶(DH)活性)，
[0020]SEQ ID NO:2的位置491-883 (其具有丙二酰/棕榈酰转移酶(MPT)活性)，
[0021]SEQ ID NO:2的位置1022-1187 (其具有第一酰基载体蛋白(ACP)活性)，
[0022]SEQ ID NO:2的位置1214-1380 (其具有第二酰基载体蛋白(ACP)活性)，
[0023]SEQ ID NO:2的位置1727-1985 (其具有酮脂酰还原酶(KR)活性)，
[0024]SEQ ID NO: 2的位置2068-2714 (其具有酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性)，和
[0025]SEQ ID NO: 2的位置2815-2926 (其具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)活性)。
[0026]所述的RgrFAS的生物活性多肽片段(结构域)，其生物活性选自单酰/乙酰转移酶(AT)活性、烯酰ACP还原酶(ER)活性、脱水酶(DH)活性、丙二酰/棕榈酰转移酶(MPT)活性、第一酰基载体蛋白(ACP)活性、第二酰基载体蛋白(ACP)活性、酮脂酰还原酶(KR)活性、酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性或磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)活性中的任一种或者任两种或更多种的组合。
[0027]在基因工程生产该脂肪酸合酶用于体外合成脂肪酸及其衍生物方面，为了使所述的RgrFASl亚基和(/或)RgrFAS2亚基分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在所述RgrFASl亚基和(/或)RgrFAS2亚基的氨基端连接上信号肽序列；为了使RgrFAS蛋白或其亚基或其生物活 性多肽片段(结构域)便于纯化，可在RgrFASl亚基或RgrFAS2亚基或其生物活性多肽片段(结构域)的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签或GST标签(谷胱甘肽S-转移酶标签)。
[0028]表1标签及其序列
[0029]
【权利要求】
1.一种产油酵母脂肪酸合酶，其由RgrFASl亚基和RgrFAS2亚基组成，其中所述RgrFASl亚基是如下(a)或(b)的蛋白质: (a)由SEQID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将SEQID NO:1的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与具有脂肪酸合酶亚基I功能的由SEQ ID NO:1所衍生的蛋白质； 所述RgrFAS2亚基是如下(c)或(d)的蛋白质: (c)由SEQID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (d)将SEQID NO:2的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与具有脂肪酸合酶亚基2功能的由SEQ ID NO:2所衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的产油酵母脂肪酸合酶，其中所述RgrFASl亚基的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，所述RgrFAS2亚基的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
3.一种来源于权利要求1所述的产油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或结构域，所述多肽片段或结构域的氨基酸序列为选自如下片段中的任意一个或者任意两个或更多个片段的组合:
SEQ ID NO:1 的位置 191-600，
SEQ ID NO:1 的位置 612-1143，
SEQ ID NO:2 的位置 58-488，
SEQ ID NO:2 的位置 491-883，
SEQ ID NO:2 的位置 1022-1187，
SEQ ID NO:2 的位置 1214-1380，
SEQ ID NO:2 的位置 1727-1985， SEQ ID NO:2 的位置 2068-2714，和 SEQ ID NO:2 的位置 2815-2926。
4.权利要求3所述的产油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或结构域，其生物活性选自单酰/乙酰转移酶(AT)活性、烯酰ACP还原酶(ER)活性、脱水酶(DH)活性、丙二酰/棕榈酰转移酶(MPT)活性、第一酰基载体蛋白(ACP)活性、第二酰基载体蛋白(ACP)活性、酮脂酰还原酶(KR)活性、酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性或磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)活性中的任一种或者任两种或更多种的组合。
5.编码权利要求1所述的产油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的核苷酸序列，其中编码所述产油酵母脂肪酸合酶的RgrFASl亚基的核苷酸序列为SEQ ID NO:3 ;编码所述产油酵母脂肪酸合酶的RgrFAS2亚基的核苷酸序列为SEQ ID NO:4o
7.编码权利要求3所述的产油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或结构域的核苷酸序列，其选自如下核苷酸序列中的任意一个或者任意两个或更多个序列的组合: (a)如SEQID NO:5所示的核苷酸序列，其编码RgrFASl亚基的AT结构域； (b)如SEQID NO:6所示的核苷酸序列，其编码RgrFASl亚基的ER结构域； (c)如SEQID NO:7所示的核苷酸序列，其编码RgrFAS2亚基的DH结构域； (d)如SEQID NO:8所示的核苷酸序列，其编码RgrFAS2亚基的MPT结构域； (e)如SEQID NO:9所示的核苷酸序列，其编码RgrFAS2亚基的第一 ACP结构域；(f)如SEQID NO:10所示的核苷酸序列，其编码RgrFAS2亚基的第二 ACP结构域； (g)如SEQID NO: 11所示的核苷酸序列，其编码RgrFAS2亚基的KR结构域； (h)如SEQID NO:12所示的核苷酸序列，其编码RgrFAS2亚基的KS结构域； (i)如SEQID NO:13所示的核苷酸序列，其编码RgrFAS2亚基的PPT结构域。
8.含有权利要求5-7中任何一项所述的核苷酸序列的表达盒或重组表达载体。
9.含有权利要求5-7中任何一项所述的核苷酸序列的细胞。
10.一种构建油脂生产重组细胞的方法，所述方法包括将权利要求3-7中任何一项所述的核苷酸序列或者权利要求8的表达盒或重组表达载体导入宿主细胞中，得到油脂生产重组 细胞。
【文档编号】C12N15/54GK104031895SQ201310067767
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2013年3月4日 优先权日:2013年3月4日
【发明者】赵宗保, 朱志伟, 张素芳 申请人:中国科学院大连化学物理研究所