一种真菌羧酸酯酶及其编码基因与应用的制作方法【专利摘要】本发明公开了一种真菌羧酸酯酶及其编码基因与应用。本发明提供了一种蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有羧酸酯酶活性的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明发明一种新的羧酸酯酶，其最适反应温度为45℃，最适反应pH值为6.5；用本发明的羧酸酯酶可以较快水解乙酸芳樟酯，并且可以高效合成丁酸丁酯，具有较好的工业化应用前景。【专利说明】一种真菌羧酸酯酶及其编码基因与应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及生物【
技术领域：
】，尤其涉及一种真菌羧酸酯酶及其编码基因与应用。【
背景技术：
】[0002]酯酶(EC.3.1.1.X)通常同时具有水解和合成的能力，水解时催化酯键产物为相应的酸和醇，合成时把酸的羧基与醇的羟基缩合并缩水，产物为酯类或其它香味物质。其中最重要的两种酯酶是脂肪酶[EC.3.1.1.3]和羧酸酯酶[EC.3.1.1.1]。脂肪酶因其催化中心附近存在“盖子”结构而具有“界面效应”，而羧酸酯酶不具有该现象。羧酸酯酶催化反应遵循经典的米氏动力学，而脂肪酶只有当底物达到一定浓度后才能表现出较高的催化活性。另外，羧酸酯酶对短碳链酯类(一般少于10个碳原子)具有较高的催化活性，而脂肪酶倾向于催化含有较长碳链(多于10个碳原子)的水不溶性酯类(Bornscheuer,2002.Microbialcarboxylesterases:classificat1n,propertiesandapplicat1ninb1catalysis.FEMSMicrob1lRev26:73-81)。羧酸酯酶具有许多独特的特性，如它们在有机相中可以完成酯化、转酯、酯交换等众多反应，而且其中的大多数反应具有不对称选择性，可以专一性地用于制备许多用化学法难以合成的手性化合物(如液晶、光学活性药物、农药等)及其前体(彭立风等，2000.微生物脂肪酶的应用[J].食品与发酵工业，26:68-73)。[0003]羧酸酯酶具有广泛的底物特异性，在有机溶剂中具有较高的稳定性，并且一些羧酸酯酶还具有较高的对映选择性，这使羧酸酯酶在食品、制药等行业中具有广泛的应用前景。羧酸酯酶可以用来合成一些短链酯类，如丁酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸丁酯和辛酸乙酯等(Fendrietal.,2012.Athermoactiveuropygialesterasefromchichen:Purificat1n,characterizat1nandsynthesisofflavoresters.1ntJB1lMac1mol50:1238-1244),这些具有水果香味的酯类物质在食品工业中具有重要的应用价值。目前，临床上所用的1200多种化学药物中，约有480多种为手性药物，药物的生物活性与其手性对映体构型密切相关，并非两种异构体都具有相同的活性，而酯酶可用于制药工业中手性药物的酶法拆分(QuaxandBroekhuizenj1994.DevelopmentofanewBacilluscarboxylesteraseforuseinresolut1nofchiraldrugs.ApplMicrobialB1technol41:425-431)。[0004]羧酸酯酶广泛存在于动物、植物和微生物中。微生物羧酸酯酶主要来源于细菌、古细菌和放线菌，其中以细菌羧酸酯酶的研究最为广泛。如芽胞杆菌(Eggertetal.,2000.AnovelextracellularesterasefromBacillussubtilisanditsconvers1ntoamonoacylglycerolhydrolase.EurJB1chem267:6459-6469)，假交替单胞菌(Cieslinskietal.，2007.AcoldadaptedesterasefromPsychrotrophicpseudoalteromassp.strain643A.ArchMicrob1l188:27-36),高温厌氧杆菌(Raoetal.,2011.AthermostableesterasefromThermoanaerobactertengcongensisopeningupanewfamilyofbacteriallipolyticenzymes.B1chimB1physActal814:1695-1702)，酒酒球菌(Sumbyetal.,2009.Cloningandcharacter!zat1nofanintracellularesterasefromthewine-associatedlacticacidbacteriumOeinococcusoen1.ApplEnvironMicrob75:6729-6735),地衣芽胞杆菌(Yangetal.，2012.Cloning,express1nandb1chemicalcharacterizat1nofanovel,moderatelythermostableGDSLfamilyesterasefromGeobaciIlusthermodenitrificansT2.JB1sciB1engArticleinpress)和分支杆菌(Guoetal.,2010.Characterizat1nofanovelesteraserv0045cfromMycobateriumtuberculosis.PLOS0NE5:10)等来源的羧酸酯酶已经得到较为深入的研究。然而，关于丝状真菌酯酶的研究报道相对较少。Purdy和Kolattukudy(PurdyandKolattukudy,1975.Hydrolysisofplantcuticlebyplantpathogens.Purificat1n,aminoacidcomposit1n,andmolecularweightoftwoisoenzymesofcutinaseandanonspecificesterasefromFusariumsolanif.pis1.B1cheml4:2832-2836)最早报道了一种Fusariumsolanif.pisi来源的非特异性酯酶。Calero-Rueda等(Calero-Ruedaetal.,2009.StudyofasterolesterasesecretedbyOph1stomapiceae:Sequence,modelandb1chemicalproperties.B1chimicaetB1physicaActal794:1099-1106)研究了沥青长_壳菌(Oph1stomapiceae)酯酶的序列、模型及生化性质。Chen和Fang(Chenetal.，2011.Researchontheesterificat1npropertyofesteraseproducedbyMonascussp.AfricanJB1technollO(26):5166-5172)从中国传统酿酒大曲中分离得到一株红曲霉Monascussp.并研究了该菌所产酯酶粗酶液的酯化特性。关于嗜热真菌酯酶的相关研究报道，仅见Fan等(FanandMatteyj1999.Smallenzymeswithesteraseactivitiesfromtwothermophilicfungi,EmericellanidulansandTalaromycesemersoni1.B1technolLett21:1071-1076)研究了嗜热真菌Emericellanidulans和Talaromycesemersonii来源酯酶的分子量分布，以及Kontkanen等(Kontkanenetal.,2006.Purificat1nandcharacterisat1nofanovelsterylesterasefromMelanocarpusalbomyces.EnzymeMicrobialTechnol39:265-273)从热白丝菌(Melanocarpusalbomyces)中纯化得到一种固醇酯酶并研究了其酶学性质。[0005]由于酯酶的相关研究主要局限于少数种属，真菌酯酶的研究还不够深入，且种类较少。实际上产酯酶的真菌种类远多于目前已报道的。因此，进一步从自然界中筛选产酯酶的真菌，尤其是嗜热真菌菌株对于拓宽酯酶的来源、丰富酯酶的种类具有重要的意义。[0006]目前，世界各国都在致力于开发性能优良的羧酸酯酶，期待在食品、制药和日用化工等领域有重大突破。因此，筛选分泌酯酶的嗜热真菌菌株，生产性能优良的酯酶，并应用羧酸酯酶制备食品中应用的风味物质或日化中应用的香料以解决化学合成工艺所带来的高能耗和环境污染问题具有重要的意义。【
发明内容】[0007]本发明的一个目的是提供一种真菌羧酸酯酶及其编码基因。[0008]本发明提供的蛋白，命名为RmEstA，为羧酸酯酶，是如下(a)或(b):[0009](a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；[0010](b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有羧酸酯酶活性的由序列2衍生的蛋白质。[0011]上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。[0012]其中，序列表中的序列2由324个氨基酸组成，分子量约为35kDa。[0013]为了使a)中的蛋白便于纯化，可在a)的蛋白质氨基末端或羧基末端连接上如表I所示的标签。[0014]表1为标签的序列[0015]【权利要求】1.一种蛋白，是如下(a)或(b):Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有羧酸酯酶活性的由序列2衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子是如下(I)-(5)中任一种的DNA分子:(1)编码区为序列表中序列I所示的DNA分子；(2)编码区为序列表中序列I自5’末端第55-1026位核苷酸所示的DNA分子；(3)编码区为序列表中序列I自5’末端第55-1029位核苷酸所不的DNA分子；(4)在严格条件下与(I)或(2)或(3)限定的DNA序列杂交且编码具有羧酸酯酶活性蛋白的DNA分子；(5)与(I)或(2)或(3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有羧酸酯酶活性蛋白的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为将权利要求2或3所述DNA分子插入表达载体中，得到表达权利要求1所述蛋白的重组载体。6.扩增权利要求2或3所述DNA分子全长或其任意片段的引物对。7.权利要求1所述蛋白作为羧酸酯酶中的应用。8.权利要求1所述蛋白在水解乙酸芳樟酯中的应用。9.权利要求1所述蛋白在合成风味酯中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述风味酯为丁酸丁酯；所述应用为丁酸、丁醇和权利要求1所述蛋白在溶剂中反应，得到丁酸丁酯；所述丁酸、丁醇和权利要求1所述蛋白的配比具体为0.15M:0.125M:50U。【文档编号】C12P7/04GK104031898SQ201310066622【公开日】2014年9月10日申请日期:2013年3月4日优先权日:2013年3月4日【发明者】杨绍青,江正强,徐海博,刘昱,闫巧娟,段晓杰申请人:中国农业大学