一种检测复杂基质中精喹禾灵及其代谢物残留的方法与流程

本发明属于痕量分析技术领域，具体涉及一种能够检测复杂基质中精喹禾灵及其代谢物残留的方法。

背景技术：

精喹禾灵是由日本日产化学工业株式会社开发的苯氧羧酸酯类内吸传导型茎叶处理除草剂。其作用机理主要是：抑制细胞脂肪酸合成，抑制乙酰CoA羧化酶，破坏分生组织生长，使杂草死亡。研究发现，精喹禾灵对人体具有致突变作用，已被欧盟等国家列为逐渐淘汰名录。但在我国，精喹禾灵仍然作为一种广泛生产和使用的优良除草剂，在农业生产中广泛和大量使用。除此之外，国家对精喹禾灵在各种作物中的限量制定较少，缺乏有效监督，导致使用存在较大的盲目性，生产事故时有发生。因此，建立精喹禾灵在作物中残留量的分析与检测方法，规范用药，保障农业生产和人民健康具有重要意义。

精喹禾灵主要代谢为精喹禾灵酸。研究表明，精喹禾灵酸毒性远高于其母体。在分析精喹禾灵的同时，需要特别关注其代谢物的产生和含量变化。作为除草剂，精喹禾灵含量较低，尤其作为其代谢物，含量极难检测。复杂的基质背景会对被低含量的分析目标化合物的提取、净化和测定等带来很大困难，因此样品前处理不仅复杂困难，而且对于分析结果的准确可靠和灵敏度具有决定性作用。

经对现有技术的文献检索发现，目前关于精喹禾灵残留量的测定方法，虽然能够保证精喹禾灵在简单基质中的提取效率，但存在以下不足：1)采用液液分配或固相萃取的净化方法不仅操作复杂，浪费试剂，而且对含大量色素、油脂、杂质的复杂样品净化效果重现性差，杂质峰极易干扰检测结果。2)精喹禾灵和精喹禾灵酸极性差异较大，难以通过一种液液分配或固相萃取的净化方法去除杂质，需要采用两种及以上方法净化，操作复杂，中间极易造成残留量损失。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种操作较简单、对目标物干扰少，准确检测复杂基质中精喹禾灵及其代谢物残留的方法。该方法具有简便迅速、准确可靠的特点，对指导精喹禾灵的安全合理使用，控制食品和作物中精喹禾灵残留具有重要价值。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测复杂基质中精喹禾灵及其代谢物残留的方法，该净化方法为基质固相分散萃取方法，具体包括以下步骤：

(1)提取：称取样品于离心管中，加入乙腈，涡旋振荡，加入盐包、涡旋振荡、离心，取上清液；

(2)净化：量取步骤(2)中提取液于离心管中，然后加入净化剂进行基质固相分散萃取，涡旋、离心，取上清液；

(3)标准溶液的配制：称取精喹禾灵及其代谢物标准品，用有机溶剂溶解定容，制成标准储备液，将标准储备液逐级稀释，配制成系列浓度标准工作液；

(4)仪器检测：用步骤(1)中的系列浓度标准工作液进样，超高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MSMS)检测，在此基础上，对步骤(3)收集的净化样品进行HPLC-MS/MS检测；

(5)标准曲线的建立：采用峰面积定量，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；

(6)结果分析：按以下公式计算试样中农药的含量

R—样品中所含农药残留量，单位mg/kg；

C_标—标准溶液浓度，单位mg/L；

V_标—标准溶液进样体积，单位μL；

S_样—样品溶液中被测农药的峰面积；

V_终—样品溶液最终定容体积，单位mL；

V_样—样品溶液进样体积，单位μL；

S_标—标准溶液中被测农药的峰面积；

W—样品称样重量，单位g；

其中，所述复杂基质是指内在组成成分比较复杂的样品，比如烟叶、茶叶、生姜、油料作物等含大量色素、油脂、杂质的复杂样品。

进一步地，所述步骤(2)中的净化剂为多壁碳纳米管，或者多壁碳纳米管与N-丙基乙二胺(PSA)、C18、石墨化炭黑(GCB)三种之一的组合；所述多壁碳纳米管使用量为0.01g/mL提取液；PSA使用量为0.05g/mL提取液；C18和GCB使用量均为0.01g/mL提取液。

针对类似烟叶、茶叶、花生等内在组成成分比较复杂的样品，色素、油脂以及跟检测目标化合物共存杂质较多，如果这些干扰物质不能有效去除，将严重降低检测结果的准确度。因此，针对复杂基质，必须进行行之有效的净化。现有的净化方法对复杂基质净化效果差，本发明采用基于多壁碳纳米管的基质固相分散萃取方法，能够一次完成净化，而且净化效果好，因此检测结果更为准确。

净化效果不好的复杂样品中会存在大量干扰物质，导致在目标化合物检测分析时产生严重的基质干扰现象，影响仪器的分辨率和重现性，而且还存在损坏仪器的危险。通过适当的净化方法去除干扰物质，分析的重现性和准确度将大大提高。由于多壁碳纳米管比表面积大，净化能力强，使其应用于痕量物质检测方面较传统净化剂更具优势。多壁碳纳米管对大部分有机化合物都有较强的吸附性，同时可有效降低或消除样品中色素，脂肪等基质对检测结果的影响。常规净化剂如C18通常只适合非极性或弱极性样品的分离，净化效果不理想。因此多壁碳纳米管结合常规净化剂非常适合对复杂基质的净化。

进一步地，所述步骤(1)中乙腈使用量为2mL/g试样；

进一步地，所述步骤(1)中盐包是指无水硫酸镁，氯化钠混合物。使用量无水硫酸镁0.4g/mL提取液、氯化钠0.1g/mL提取液。

进一步地，所述步骤(3)中称取标准品的重量为0.01g±0.2mg；有机溶剂采用色谱甲醇。

进一步地，所述步骤(3)中标准储备液是指制成100mg/L储备液。

进一步地，所述步骤(3)中空白基质提取液是指按照步骤(1)、(2)提取净化的空白基质乙腈提取液。

进一步地，所述步骤(4)中HPLC-MS/MS选用Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra；色谱柱选用SunFire C18 Column,4.6μm,2.1mm×100mm；；

色谱检测条件：

柱温：20℃；

流动相：A相为乙腈，B相为5mmol/L乙酸铵水溶液；

梯度洗脱条件为:0～0.5min，保持10％A；0.5～1.0min，10％～90％A；1.0～6.0min，保持90％A；6.0～8.0min，90％～10％A；8.0～10.0min，保持10％A；

流速：0.30mL/min；

进样量：10μL；

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源ESI；

扫描方式：正离子源/负离子源；

喷雾电压：3200V/2800V；

毛细管温度：350℃；

鞘气压力：50Arb；

辅助气压力：20Arb；

检测方式：多重反应监测(MRM)。

进一步地，所述步骤(5)中进样浓度为0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5mg/L。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1、本发明采用乙腈提取、基质固相分散萃取净化，能同时保证精喹禾灵及其代谢物两种极性差异较大物质的提取效率，而且与单一的液液萃取或固相萃取的净化方法相比，操作简便，能够一次完成净化，省时省力。

2、本发明采用多壁碳纳米管作为净化材料的新选择，结合基质的复杂程度，添加常规净化剂辅助净化，对不同复杂基质均能够达到良好净化效果，提高了检测准确度。

3、本发明通过HPLC-MS/MS同步检测精喹禾灵及其代谢物，不仅有利于精喹禾灵与其代谢物的分离，而且干扰小，而且准确度高，能够准确方便、快速的检测精喹禾灵及其代谢物含量，其精喹禾灵最小检出量为4.5×10^-11g、代谢物最小检出量为1.2×10^-12g，最低检出浓度均为0.01mg/kg。

本发明的检测方法能够快速、灵敏、准确的测定复杂基质中精喹禾灵及其代谢物残留量，为精喹禾灵及其代谢物在复杂基质中的检测提供了一种新的检测技术。

附图说明

图1是精喹禾灵标准色谱图；

图2是实施例1的烟叶空白基质色谱图；

图3是实施例1的添加精喹禾灵的烟叶样品色谱图；

图4是精喹禾灵代谢物标准色谱图；

图5是实施例2的茶叶空白基质色谱图；

图6是实施例2的添加精喹禾灵代谢物的茶叶样品色谱图；

其中，图1、3中的色谱峰代表精喹禾灵；4、6中的色谱峰代表精喹禾灵代谢物。

具体实施方式

下面分别以烟叶中精喹禾灵及茶叶中精喹禾灵代谢物残留量检测为例，并结合附图详述本发明的技术方案，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。

实施例1：烟叶中精喹禾灵残留量的检测

(1)提取

称取2.0g烟叶样品于50mL具盖离心管中，移取10mL乙腈到该离心管中，于漩涡混合振荡器上震荡提取1min，加入4g无水硫酸镁，1g氯化钠，立即于漩涡混合振荡仪振荡2min，然后以4000r/min离心5min。

(2)净化

移取1mL提取液于1.5mL离心管中，加入10mg多壁碳纳米管、50mg PSA，于漩涡混合振荡仪上漩涡振荡2min，以6000r/min离心2分钟。吸取上清液，过0.22μm滤膜，待测。

(3)HPLC-MS/MS检测

HPLC检测条件为：

Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra；

色谱柱：SunFire C18 Column,4.6μm,2.1mm×100mm；

柱温：20℃；

流动相：A相为乙腈，B相为5mmol/L乙酸铵水溶液；

梯度洗脱条件为:0～0.5min，保持10％A；0.5～1.0min，10％～90％A；1.0～6.0min，保持90％A；6.0～8.0min，90％～10％A；8.0～10.0min，保持10％A；

流速：0.30mL/min；

进样量：10μL；

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源ESI；

扫描方式：正离子源；

喷雾电压：3200V；

毛细管温度：350℃；

鞘气压力：50Arb；

辅助气压力：20Arb；

检测方式：多重反应监测(MRM)如下表：

在上述条件下所得的标准色谱图见图1。保留时间为5.2min。

(4)标准曲线的建立

称取0.0100g精喹禾灵标准品，用甲醇溶解定容至100mL，制成100mg/L储备液。将精喹禾灵标准储备液逐级稀释，配制成0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5mg/L的标准工作液。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。所得标准曲线回归方程为：Y＝4811860X+53833，相关系数r＝0.9999。

(5)计算公式

R—样品中所含农药残留量，单位mg/kg；

C_标—标准溶液浓度，单位mg/L；

V_标—标准溶液进样体积，单位μL；

S_样—样品溶液中被测农药的峰面积；

V_终—样品溶液最终定容体积，单位mL；

V_样—样品溶液进样体积，单位μL；

S_标—标准溶液中被测农药的峰面积；

W—样品称样重量，单位g；

(5)添加回收率试验

在烟叶空白样品中添加0.01～0.5mg/kg精喹禾灵标准品溶液，每个浓度重复5次，按上述方法提取、净化和检测，验证本发明方法的可靠性。结果见表1。结果表明，精喹禾灵在烟叶中添加浓度为0.01mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg时，平均回收率为89.0％～91.6％，相对标准偏差分别为2.9％～3.9％。回收率和相对标准偏差均符合农药残留试验的要求。

表1精喹禾灵在烟叶中添加回收率试验结果

烟叶空白基质色谱图见图2；添加精喹禾灵的烟叶样品色谱图见图3。

由图2可以看出，本发明对样品中的杂质净化效果较好，烟叶空白基质中无杂质干扰峰出现，精喹禾灵本底值为0，对本实验不会形成干扰。由图3可以看出，目标峰峰形良好，邻近几乎无干扰峰，对结果的分析不会产生偏差。

实施例2：茶叶中精喹禾灵代谢物残留量的检测

(1)提取

称取2.0g烟叶样品于50mL具盖离心管中，移取10mL乙腈到该离心管中，于漩涡混合振荡器上震荡提取1min，加入4g无水硫酸镁，1g氯化钠，立即于漩涡混合振荡仪振荡2min，然后以4000r/min离心5min。

(2)净化

移取1mL提取液于1.5mL离心管中，加入10mg多壁碳纳米管、10mg C18，于漩涡混合振荡仪上漩涡振荡2min，以6000r/min离心2分钟。吸取上清液，过0.22μm滤膜，待测。

(3)HPLC-MS/MS检测

HPLC检测条件为：

Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra；

色谱柱：SunFire C18 Column,4.6μm,2.1mm×100mm；；

柱温：20℃；

流动相：A相为乙腈，B相为5mmol/L乙酸铵水溶液；

梯度洗脱条件为:0～0.5min，保持10％A；0.5～1.0min，10％～90％A；1.0～6.0min，保持90％A；6.0～8.0min，90％～10％A；8.0～10.0min，保持10％A；

流速：0.30mL/min；

进样量：10μL；

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源ESI；

扫描方式：负离子源；

喷雾电压：2800V；

毛细管温度：350℃；

鞘气压力：50Arb；

辅助气压力：20Arb；

检测方式：多重反应监测(MRM)如下表：

在上述条件下所得的标准色谱图见图4。保留时间为4.4min。

(4)标准曲线的建立

称取0.0100g精喹禾灵代谢物标准品，用甲醇溶解定容至100mL，制成100mg/L储备液。将精喹禾灵酸标准储备液逐级稀释，配制成0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5mg/L的标准工作液。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。所得标准曲线回归方程为：Y＝394746X+296，相关系数r＝0.9999。

(5)计算公式

R—样品中所含农药残留量，单位mg/kg；

C_标—标准溶液浓度，单位mg/L；

V_标—标准溶液进样体积，单位μL；

S_样—样品溶液中被测农药的峰面积；

V_终—样品溶液最终定容体积，单位mL；

V_样—样品溶液进样体积，单位μL；

S_标—标准溶液中被测农药的峰面积；

W—样品称样重量，单位g；

(5)添加回收率试验

在茶叶空白样品中添加0.01～0.5mg/kg精喹禾灵代谢物标准品溶液，每个浓度重复5次，按上述方法提取、净化和检测，验证本发明方法的可靠性。结果见表2。结果表明，精喹禾灵代谢物在茶叶中添加浓度为0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.5mg/kg时，平均回收率分别为88.1％～95.0％，相对标准偏差分别为1.7％～5.4％。回收率和相对标准偏差均符合农药残留试验的要求。

表2精喹禾灵代谢物在茶叶中添加回收率试验结果

茶叶空白基质色谱图见图5；添加精喹禾灵代谢物的茶叶样品色谱图见图6。由图6可以看出，茶叶空白基质中精喹禾灵酸本底值为0，对本实验不会形成干扰。

实施例1和2采用乙腈提取，多纳米碳管配合其他净化剂净化，不仅操作简便，而且净化效果更好，能够有效去除复杂基质中干扰物质，提高了检测的准确性。通过HPLC-MS/MS检测精喹禾灵及其代谢物来反映基质中精喹禾灵含量，不仅干扰小，而且准确、快速，其精喹禾灵最小检出量为4.5×10^-11g、代谢物最小检出量为1.2×10^-12g，最低检出浓度均为0.01mg/kg。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。