专利名称：用于构筑生物分子微观排列的与基质结合的连接分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物分子排列，更具体地说，本发明涉及可用于利用有效的、高产率的技术制造生物分子排列的一系列可光活化的表面结合的连接分子。
背景技术：
公开在例如E.S.Lander，Nature Genetic Supplement 1999，21，3中的核苷酸微观排列(所谓的“DNA芯片”)，和公开在例如G.Macbeth，et al.，Science 2001，289，1760中的与基质结合的蛋白质排列的制造和使用，在人类基因组第一次草图在最近公布(参见，例如Science 2001，291，1145-1134)后就成为人们非常感兴趣的领域。低聚核苷酸和cDNA的微观排列可以利用多种技术来制造，包括机器人定位(robot spotting)和喷墨印刷，对于低聚核苷酸，可以原位平版印刷合成。这些现有技术中的有些方法还可以用于制造芯片。
上述所有现有技术方法都依赖于通过物理沉积或光描绘方法，以一定图案的方式在某些类固体载体上共价结合核酸或多肽。尽管这些不同的“第一代”方法被用于制造用于科研目的的少量微观排列，但是这些诊断设备的大规模实施将需要大量、有效的制造方法，所述制造方法优选既能够制造DNA排列又能制造蛋白质排列。
G.Wallraff，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.1996，93，13555中描述了一种基于用在化学增强的抗蚀剂(chemically amplified resists)中的光致酸(photoacid)化学过程的、平版印刷制造低聚核苷酸排列的技术。这种称作“光致酸成图排列(PPA)”的现有方法比可光脱除的保护基方法具有多个潜在的优点，后一种方法公开在例如S.P.A.Fodor，etal.，Science 1991，251，767中，目前被Affymetrix用于制造GeneChipTM。PPA方法是基于标准的核酸合成化学过程(参见
图1)，其中酸催化剂是在涂覆在结合有核酸前体的基质上的带图案的聚合物膜中产生的(参见图2)。通过PPA技术产生的光致酸随后除去了对酸不稳定的二甲氧基三苯甲基保护基团(DMT)，并活化表面结合的连接分子来偶联第一核酸碱。图2中描述的现有方法可以被重复多次来构筑所需长度的低聚核苷酸排列。
尽管生物分子排列制造领域中取得了上述进展，但是仍然需要提供一种制造生物分子排列的新型改进技术。此外，需要提供一种现有技术没法制造的蛋白质排列的制造技术。
发明概述本发明提供一系列能够用于制造生物分子排列的可光活化的表面结合的连接分子。具体地说，在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，它包括固体基质，一个末端连接到所述固体基质上并且至少一个其它末端含有醇官能团或羰基官能团的有机连接基团，和连接到醇官能团或羰基官能团上的选自缩醛和缩酮的对酸不稳定的保护基团。本发明还设计了一种组合物，它包括大量这种带有醇官能团或羰基官能团的表面结合的连接基团，所述醇官能团或羰基官能团用缩醛或缩酮基团保护。
本发明还提供了一种组合物，它包括固体基质，一个末端结合到所述固体基质上并且至少一个其它末端含有醛基团的有机连接基团。本发明还设计了带有大量这种结合到固体基质表面上的有机连接基团的组合物。
本发明还提供了一种组合物，它包括固体基质，和至少一种结合到固体基质上的光致酸生成剂或光敏剂。所述结合到组合物上的至少一种光致酸生成剂或光敏剂还可以包括结合到光致酸生成剂或光敏剂上的对酸不稳定的选自缩醛和缩酮的保护基团。这种光致酸生成剂或光敏剂还可以包括其中一个末端结合到固体基质上并且至少一个其它末端结合到光致酸生成剂或光敏剂上的有机连接基团。
附图的简要说明图1是表示现有核酸合成技术的简图。
图2是表示称作光致酸成图排列(PPA)的低聚核苷酸现有合成技术的简图。
发明详述下面将更详细地描述本发明，它提供了用于构筑生物分子排列和蛋白质排列的与基质结合的连接分子。
本发明的一方面涉及一种组合物，它包括固体基质，一个末端连接到所述固体基质上并且至少一个其它末端含有醇官能团或羰基官能团的至少一个有机连接基团，和结合到醇官能团或羰基官能团上的选自缩醛和缩酮的对酸不稳定的保护基团。
本发明的这一方面利用常规有机连接基团，提供了用于低聚核苷酸合成的改进了的对酸不稳定的保护基团。与现有技术的二甲氧基三苯甲基(DMT)保护的醇相比，由于低温下更高的合成产率和更高的反应性，因此本发明这一实施方案中的本发明组合物去保护反应中看到的高反应性(低活化能)和高效的酸催化作用在排列构筑中是有利的。在核苷酸砌块中引入缩醛/缩酮保护的醇也是可能的。
本发明组合物中的一种组分是固体基质。本发明所用的固体基质的实例包括但不限于玻璃，搀杂玻璃，诸如氧化硅、氧化铟锡(ITO)和氧化钛之类的氧化物，半导体基质，如Au的金属等。本发明所用的优选固体基质是玻璃基质。
一般在使用前，将固体基质用本领域技术人员公知的常规清洁技术进行清洁。例如，当固体基质是玻璃时，在连接分子结合之前，利用多种处理方法例如硫酸、去离子(DI)水、异丙醇(IPA)、热、NaOH、氧气等离子体和盐酸清洁该玻璃基质。本发明还想到了上述清洁处理的组合。
任选在使用前被清洁的固体基质，一般在与连接分子结合之前用合适的溶剂湿润。可以用于湿润固体基质表面的合适溶剂包括但不限于醇，例如甲醇、乙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇和壬醇；烃，例如戊烷、己烷和庚烷；二元醇醚乙酸酯；二元醇醚；芳香烃，例如甲苯和二甲苯；氯代烃，例如氯仿和二氯甲烷；和其它类似溶剂。在这些溶剂中，本发明特别优选醇如乙醇来湿润固体基质表面。
固体基质表面的湿润一般在室温下进行，但是也可以采用最高达并包括溶剂沸点的升高的温度。湿润步骤的时间可以变化，但是湿润一般进行约1-约30分钟，更优选约2-约10分钟。
然后，将含有基本上溶解在一种上述溶剂中的“连接化合物”的溶液涂覆在固体基质表面上。“连接化合物”在固体基质上的涂覆是用本领域技术人员公知的常规方法进行的。例如，可以将固体基质浸入含有“连接化合物”的溶液中，或者可以将含有“连接化合物”的溶液利用刷涂、浸涂、喷涂或其它类似涂覆方法进行涂覆。
含有“连接化合物”的溶液在固体基质上的涂覆可以在室温下进行，也可以采用最高达并包括溶剂沸点的升高的温度。“连接化合物”涂覆步骤的时间可以根据固体基质表面积改变，但是“连接化合物”在固体基质上的涂覆一般进行约5分钟至约24小时，更优选涂覆时间为约10-约30分钟。
整个申请中所用的术语“连接化合物”表示有机连接基团和能够结合到固体基质上的化合物之间形成的反应产物。本发明这一点中所用的溶液一般含有约1-约20wt％，更优选约2-约15wt％，甚至更优选约3-约10wt％的溶解在100％溶剂中的连接化合物。
能够结合到固体基质上的化合物可以是键，碳原子，取代的碳原子，羧酸酰胺，Si原子，取代的Si原子例如三烷氧基甲硅烷基，离子键，羧酸，胺，硫醇，氯二烷氧基甲硅烷基，烷基二烷氧基甲硅烷基，或者二烷基烷氧基甲硅烷基。本发明中，当固体基质是由玻璃组成的时，优选结合到固体基质上的连接化合物的末端包括Si片段。本发明中可以采用的优选连接基团的一个实例是氨基丙基三乙氧基硅烷。
本发明中所用的术语“有机连接基团”表示一种有机化合物，它包括能够结合到有机化合物(该化合物能够结合到固体基质上)上的一个末端，一个桥连部分，和至少一个含有醇官能团或羰基官能团的其它末端。该有机连接基团可以是线性的、聚合的或树枝状的。
将各末端连接在一起的桥连部分是线性或支化的、取代或未取代的烷烃，链烯基，烷基羧酸酰胺，芳基，如乙氧化物和丙氧化物的烷氧化物，芳氧化物或它们的任意组合。有机连接基团的桥连部分可以含有约3-约600个碳原子，优选约10-约200个碳原子，更优选约12-约100个碳原子。连接基团中可以存在的取代基包括但不限于，烷基，链烯基，卤原子，醚或酰胺。
在本发明的一个优选实施方案中，连接基团的桥连部分是树枝状化合物，其中n为约3-约30的式-(CH2)-n的烷烃链，其中x为约1-约50的式-(CH2CH2O)-x的乙氧化物，和其中x为约1-约50的式-(C6H4O)x-的芳氧化物。本发明中所用的术语“树枝状的”表示高度支化的有机化合物。
本发明中所用的缩醛或缩酮包括公知的低活化能的脂族或环状缩醛或缩酮。能够用于本发明的缩醛或缩酮的一些实例包括但不限于，二甲基缩醛或缩酮，二氧戊环，四氢呋喃基，四氢吡喃基，甲氧基环己基，甲氧基环戊基，环己氧基乙基，乙氧基环戊基，乙氧基环己基，甲氧基环庚基，和乙氧基环庚基。优选的对酸不稳定的缩醛或缩酮包括四氢吡喃基缩醛，二甲基缩醛或缩酮，或二氧戊环。
在固体基质上涂覆连接化合物之后，将含有结合的连接分子的固体基质用一种上述溶剂漂洗，然后将该组合物(即含有结合的连接化合物的基质)在室温下或者在最高达并包括110℃的升高的温度下，在空气中或在真空下干燥。干燥步骤进行约5-约60分钟，更优选约10-约20分钟。
干燥后，将包括结合的连接化合物的组合物在炉子中或热板上烘烤。烘烤步骤的温度和时间可以根据使用炉子或热板而改变。当采用热板时，烘烤步骤在约80-约150℃的温度下进行约5-约60分钟。更优选的是，热板烘烤步骤在约100-约110℃的温度下进行约10-约20分钟。当烘烤步骤中使用炉子时，烘烤步骤在约80-约150℃的温度下进行约5-约60分钟。更优选的是，炉子烘烤步骤在约100-约110℃的温度下进行约10-约20分钟。
烘烤步骤之后，就可以以一定图案的方式对结合的连接分子进行去保护，得到用于生物分子排列的活性基质。去保护可以利用本领域技术人员公知的方法，通过加热或者暴露于辐射下来进行。
本发明该实施方案的一些优选组合物的说明性实例包括 其中，R和R’各自独立地是烷基，例如乙基、甲基等，或者R和R’连接在一起形成环烷烃，R”是H、烷基，或者R”与R或R’连接在一起形成环烷烃，R1是支化点如二取代乙酰胺，或三取代芳醚如三氧基取代苯甲酰胺，R2是烷基、烷氧基、烷氧化物、芳基或芳氧化物，n为0-20。
上述带有保护的对酸不稳定的官能团的与基质结合的连接分子，可以用于利用标准核酸合成方法的低聚核苷酸的合成，或者用于制备生物分子排列。带有保护的对酸不稳定的官能团的与基质结合的连接分子还可以用于蛋白质排列的制备。将蛋白质结合到基质上的优选方法是通过与表面结合的醛形成Schiff碱。这可以用上述结合了对酸不稳定的缩醛或缩酮的连接分子，通过用醛位点简单代替醇连接位点来实现。该方法另外的优点在于，结合之前官能化的醛和醇易于互相转换，因此一种硅烷前体可被用于DNA和蛋白质芯片二者。
下图显示了用于蛋白质连接的带有对酸不稳定的醛保护的与基质结合的连接分子 本发明还提供了一种组合物，它包括固体基质，和结合到固体基质上的至少一种光致酸生成剂或光敏剂。所述至少一种结合到组合物上的光致酸生成剂或光敏剂还可以包括结合到其上的对酸不稳定的选自缩醛和缩酮的保护基团。这种光致酸生成剂或光敏剂还可以包括其中一个末端结合到固体基质上并且至少一个其它末端结合到光致酸生成剂或光敏剂上的有机连接基团。
在本发明的该实施方案中，聚合物抗蚀剂组分，即光致酸生成剂或光敏剂以上述有机连接化合物的一部分或者以单独组分的形式结合到基质表面上。
该实施方案中，含有连接基团和光致酸生成剂的化合物可以按照下述方法制成通过使3-溴丙基三甲氧基硅烷或α-溴代-ω-三烷氧基甲硅烷基烷烃与二芳基硫(二苯硫)反应，然后用所需的阴离子(即三氟甲磺酸根(triflate))交换溴阴离子，能够合成连接分子锍盐PAG。或者，基质结合的光致酸生成剂可以这样制成通过PAG上的芳羟基将PAG连接到α-溴代-ω-乙烯基烷烃上，随后用三烷氧基硅烷进行处理。
本发明中可以使用的合适的光致酸生成剂(PAG)包括三氟甲磺酸盐(例如三苯基锍三氟甲磺酸盐或双-(叔丁基苯基)碘鎓三氟甲磺酸盐)，连苯三酚(例如1，3，5-苯三酸盐或连苯三酚)，鎓盐例如三芳基锍和二芳基碘鎓六氟锑酸盐、六氟砷酸盐、三氟甲磺酸盐和其它，碘鎓磺酸盐和羟基胺的三氟甲磺酸酯，α-双-磺酰基重氮甲烷，硝基取代的苯甲醇和萘醌-4-二叠氮化物的磺酸酯和烷基二磺酸盐。本发明所用的其它合适的光致酸生成剂公开在例如Allen等人的美国专利5,045,431和5,071,730中，以及Reichmanis等人的综述文章(Chemistryof Materials，第3卷，第395页(1991))，它们的内容通过引用而结合在本文中。
带有光敏剂的连接分子可以这样制备α-溴代-ω-乙烯基烷烃与羟基取代的光敏剂如9-蒽甲醇反应，随后用三烷氧基硅烷处理。
本发明可以使用的光敏剂的实例包括类、芘类、荧蒽类、蒽酮类、二苯酮类、噻吨酮类和蒽类如9-蒽甲醇(9-AM)。其它蒽衍生物光敏剂公开在美国专利4,371,605中。光敏剂可以包括氧或硫。
下面描述了本发明的一些组合物，它们包括带有或不带有对酸不稳定的缩醛或缩酮保护基团的光敏剂，和带有或不带有对酸不稳定的缩醛或缩酮保护基团的光致酸生成剂。
利用与基质结合的光致酸生成剂和光敏剂的优点如下(1) 用于“完全干燥”模式的可能性由于光致酸生成剂(和光敏剂)结合到基质上，因此如果连接化合物的单分子层为在曝光和去保护过程中发生的光化学反应和热反应提供了合适的溶剂化作用的话，原则上就不需要聚合物抗蚀剂或其它溶剂的面漆层。预期聚醚树枝状体在这方面特别有用。去保护反应的催化性质和能够产生的高浓度酸有利于使用较少量的与基质结合的PAG。光生成的酸的扩散仍是一个问题，可能必须要控制。随后，低聚核苷酸和蛋白质偶合反应可以用常规方式进行。聚合物涂覆步骤的缺省大大简化了排列的制备。
(2) 当“完全干燥”方法不可行时，基质结合的PAG和光敏剂还可以用在溶剂基方法中。在此酸扩散问题将被最小化(要求较低的酸浓度并且它们在表面生成)。即使一种组分是在溶液中也是这样的。溶剂基方法可以被用于高分辨率低聚核苷酸排列，或者优选被用于采用直接书写路线的低密度排列。
(3) 使用基质结合的PAG的多次曝光和顺序反应将依赖于所采用的任何去保护反应的催化性质。因此，正确控制与基质结合的PAG将确保在任何步骤中仅使用了部分PAG，并且允许顺序曝光来催化其它去保护化学反应。
下面实施例用于举例说明本发明的方法，它被用于制备光化学活性的表面结合的连接分子，所述连接分子能够用于制备生物分子排列。
实施例1用于制备蛋白质排列的带有缩醛保护的醛基的连接分子的合成该实施例中，二氧化硅活性基团和生物活性基团之间的间隔基是烷烃链(CH2)12。
将12-羟基十二酸(2.15g，9.93mmol)在160ml甲醇中用1.34ml1N盐酸室温下处理过夜，将其转变为甲酯。用稀氢氧化钠中和后，通过旋转蒸发去除溶剂，并将产物再次溶解在醋酸乙酯中，用去离子(DI)水和5％的碳酸氢钠洗涤，用硫酸钠干燥，并旋转蒸发至干，得到2.00g8.68mmol的12-羟基十二酸甲酯(粗产率87.4％)。
醛是按照J.E.Baldwin，R.M.Adlington和S.H.Ramcharitar，Tetrahedron 1992，48，2963中描述的方法制备的。将草酰氯(1.27g，9.98mmol)和20ml二氯甲烷放入安装有三个加料漏斗的3颈圆底烧瓶中，其中第一个漏斗中装有在4ml二氯甲烷中的1.5mlDMSO，第二个漏斗中装有在5ml二氯甲烷中的2.00g 12-羟基十二酸甲酯，第三个漏斗中装有6ml三乙胺。将烧瓶冷却到-50℃后，将DMSO溶液快速滴加。10分钟后，将醇用10分钟滴加进去。45分钟后，滴加三乙胺。再搅拌10分钟后，烧瓶自然升温到室温并搅拌过夜。加入50ml二氯甲烷，并将溶液用水(3×50ml)洗涤，用硫酸镁干燥，过滤并旋转蒸发至干，得到2.03g 8.85mmol的12-氧代十二酸甲酯。
按照V.Pozsgay，J.Org.Chem 1998，63，5998中描述的方法保护醛基。将12-氧代十二酸甲酯(2.02g，8.85mmol)溶解在15ml 2，2-二甲氧基丙烷中，并加入对甲苯磺酸一水合物(0.17g，0.885mmol)。搅拌30分钟后，将体积通过旋转蒸发减少大约1/2，用过量三乙胺处理，用二氯甲烷稀释，用水洗涤，用硫酸钠干燥，并旋转蒸发至干，得到2.11g 7.69mmol 12，12-二甲氧基十二酸甲酯。将其重新溶解在15ml甲醇中，并加入11.4ml1N的NaOH。45分钟后，将甲醇通过旋转蒸发除去。将溶液用乙醚洗涤三次。向水溶液中加入固体柠檬酸，直到pH值达到3.5。将产物萃取到二氯甲烷中(萃取三次)，将合并的有机相用水洗涤，用硫酸镁干燥，通过旋转蒸发浓缩，真空箱中干燥，得到1.95g淡黄色油状物，为7.49mmol 12，12-二甲氧基十二酸。
在100ml 1∶1的醋酸乙酯/二氯甲烷混合溶剂中，混合3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)(1.66g，7.49mmol)、12，12-二甲氧基十二酸(1.95g，7.49mmol)和DCC(1.85g，8.99mmol)，并搅拌过夜。过滤出固体，并将滤液旋转蒸发，得到4.33g 12，12-二甲氧基-N-(3’-三乙氧基甲硅烷基丙基)十二酰胺，即一种用于蛋白质排列制造的带有缩醛保护的醛基的连接分子。
实施例2用于蛋白质排列制备的带有缩醛保护的醛基的连接分子的合成该实施例中，二氧化硅活性基团和生物活性基团之间的间隔基是聚乙二醇(PEG)，它能够为生物分子提供惰性表面。PEG具有两个对称的末端基团(羟基)。该聚乙二醇必须通过部分官能化并分离不对称取代的聚合物，进行不对称官能化，在一端上接上被保护的生物活性基团并在另一端上接上二氧化硅活性基团。
如A.Dal Pozzo，A.Vigo，和G.Donzelli在Makromol.Chem.1989，190，2457-2461中所述，将分子量为600的PEG(21.70g，36.17mmol)用在90ml二氯甲烷中的三苯甲基氯(10.08g，36.17mmol)和5ml三乙胺(36.17mmol)处理，并在室温下搅拌2小时。将淤浆用DI水洗涤(1×180ml，5×90ml)以去掉未反应的PEG，旋转蒸发至干。将油状物再溶解在甲苯(100ml)中，并用盐水洗涤(1×50ml，5×25ml)，用硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发，并在真空箱中干燥，得到22.98g油状物，它是双-三苯甲基化PEG和单-三苯甲基化PEG的混合物。
如T.Bigo，N.D.Sachinvala和O.A.Hamed在Polymer Prepr.2000，41(1)，144中所述，将NaH(5.73g，143.16mmol)用己烷洗涤，分散在100mlTHF中形成淤浆并加热至回流。将溶解在60mlTHF中的三苯甲基化PEG的混合物在半小时内滴加进去，并在回流下搅拌4.5小时。将溶解在60mlTHF中的氯乙酸(2.25g，23.86mmol)在半小时内滴加进去。将淤浆在回流下搅拌过夜，冷却到室温并加入60ml水。将pH值用稀盐酸调整到约为5，并通过旋转蒸发去掉挥发物。将淤浆在乙醚中(3×60ml)捣碎以除去双-三苯甲基化PEG和氯乙酸。将淤浆再次溶解在二氯甲烷中，用硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发，并在真空箱中干燥，得到11.62g(12.91mmol)α-三苯甲基-ω-羧基-PEG。
将α-三苯甲基-ω-羧基-PEG在260ml甲醇中用2ml 12N的盐酸室温下处理过夜。用固体碳酸钠中和后，将溶液过滤并旋转蒸发，再次溶解在盐水中并用乙醚洗涤(5×100ml)。将水溶液用盐酸中和，并将产物萃取到二氯甲烷中(4×200ml)，用硫酸镁干燥并旋转蒸发，得到α-羟基-ω-羧基-PEG的油状物(7.04g，10.49mmol)。
按照实施例1中的方法，将α-羟基-ω-甲基羧基-PEG转变为醛、保护并进一步与APTES反应，以制备α，α-二甲氧基-ω-[N-(3’-三乙氧基甲硅烷基丙基)碳酰胺-PEG，即一种用于蛋白质排列制造的带有缩醛保护的醛基的连接分子。
或者，通过在回流THF中，用氢化钠(2.00g，49.38mmol)和溴乙醛二甲基缩醛(2.78g，16.47mmol)处理α-羟基-ω-甲基羧基-PEG(8.23mmol)过夜，能够一步法加上保护的醛官能团。加入水之后，将溶剂通过旋转蒸发除去。用乙醚研磨除去过量的溴乙醛。通过加入固体柠檬酸将淤浆变为酸性，并将产物萃取到二氯甲烷中，用水洗涤，用硫酸镁干燥，过量并旋转蒸发，得到α，α-二甲氧基-ω-羧基-PEG，它能够按照上述方法与APTES反应制成所需的连接分子。
实施例3带有环状缩醛保护的醇的连接分子的合成使α-羟基-ω-甲基羧基-PEG(来自实施例2)(3mmol)与氢化钠(1.44g，36mmol)和2-(2-氯乙氧基)四氢-2H-吡喃(0.99g，6.01mmol)在回流的THF中反应过夜。加入水之后，将溶剂通过旋转蒸发除去。用乙醚研磨除去过量的2-(2-氯乙氧基)四氢-2H-吡喃。通过加入固体柠檬酸将淤浆变为酸性，并将产物萃取到二氯甲烷中，用水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，并旋转蒸发，得到α，α-二甲氧基-ω-甲基羧基-PEG，它能够按照上述方法与APTES反应以制备所需要的连接分子。
实施例4
带有DMT保护醇的连接分子的合成通过用酸处理水解α-羟基-ω-甲基羧基-PEG(来自实施例2)，并将所得到的α-羟基-ω-羧基-PEG(3.04g，4.62mmol)用二甲氧基三苯甲基氯(DMTCI)(3.13g，9.24mmol)在100ml 1∶1的吡啶/二氯甲烷混合溶剂中室温下处理过夜。通过旋转蒸发除去溶剂，并将产物再次溶解在乙醚中，过滤除去盐，并旋转蒸发至干。然后将α-DMT氧-ω-羧基-PEG按照实施例1中的方法与APTES反应，得到α-DMT氧-ω-[N-(3，-三乙氧基甲硅烷基丙基)碳酰胺-PEG，即一种用于生物分子排列制造的带有DMT保护醇的连接分子。
实施例5用于生物分子连接的2-支化连接分子的合成按照实施例2所述方法，用二氯乙酸代替氯乙酸与单-三苯甲基化的PEG反应，生成支化的连接分子，然后分离和纯化该连接分子。
然后该支化的连接分子可以根据需要被改性和保护(P)，然后与APTES反应生成官能化的支化的连接分子。
实施例6用于生物分子连接的3-支化连接分子的合成如S.J.Meunier，Q.Wu，S.-N.Wang和R.Roy，Can J.Chem.1997，75，1472-1482中所述，将对甲苯磺酰氯(6.88g，36mmol)在氮气气氛下缓慢加入到来自实施例2的单-三苯甲基化PEG(33.3mmol)和50ml三乙胺在乙醚(300ml)中的0℃溶液中。将淤浆自然升温到室温并搅拌过夜。将溶剂旋转蒸发掉，并将残留物溶解在二氯甲烷中，用饱和碳酸氢钠溶液(50ml)和水(2×50ml)洗涤。将有机层用硫酸镁干燥并旋转蒸发干燥，得到α-三苯基甲氧基-ω-对甲苯磺酰氧基-PEG。
将它连同没食子酸乙酯(1.65g，8.325mmol)和碳酸钾(11.65g，83.25mmol)溶解在DMF(250ml)中，并在80℃下搅拌2天。冷却到室温后，过滤出固体，并将溶剂真空下除去，然后用叔丁醇共蒸发来辅助除去DMF。加入水并将产物萃取到二氯甲烷中。将有机层用水和盐水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发得到棕色油状物。
室温下，将3，4，5-三-(ω-三苯基甲氧基-PEG)苯甲酸乙酯在甲醇(200ml)中与1.5N氢氧化钠(200ml)搅拌过夜。通过旋转蒸发除去溶剂，并将残留物用乙醚(3×100ml)研磨，以除去双-三苯甲基化PEG。然后将残留物溶解在二氯甲烷中，用硫酸镁干燥并旋转蒸发，得到22.35g 3，4，5-三-(ω-三苯基甲氧基-PEG)苯甲酸。在250ml甲醇中与12N盐酸(4ml)一起搅拌过夜后，用固体碳酸钠中和，乙醚洗涤以除去三苯甲醇，并萃取到二氯甲烷中，制成了三官能化连接分子，其端羟基可以反应/被保护，然后与APTES反应，制成生物官能化/二氧化硅活性连接分子。
实施例7连接分子与二氧化硅基质的结合在即将进行连接分子结合之前清洁基质，以确保表面上活性羟基的存在。这种清洁包括用硫酸、DI水、IPA、加热、NaOH和盐酸处理。然后将基质浸泡在乙醇中5分钟，随后用溶解在乙醇中的5％连接分子溶液浸泡15分钟，随后在乙醇中再浸泡一分钟。空气流中干燥后，将基质在110℃下烘烤15分钟，得到结合有所需的连接分子的基质，此时这种基质可以以一定图案的方式进行去保护反应，得到用于生物分子排列的活性基质。
实施例8如流程图1中所述，利用正交保护基团，能够制成多种支化的多羟基酸和酯。在此例中，由羧酸制成苯甲酸酯，并将羟基以叔丁基二甲基甲硅烷基醚的形式保护。该酯可以通过催化氢解被选择性地切断，并可以用三氟化硼乙醚去掉甲硅烷基。这些方法中的每一个都可以选择性地进行。用于合成的起始物是双-(羟甲基)丙酸(DMPA)。利用流程图1中描述的化学过程和简单的砌块，能够制备多种含有2、4、8、16和更多侧羟基官能团的多羟基酸和酯衍生物。利用选择性保护/去保护流程，这些物质可以结合到诸如APTES的连接分子和所述的其它分子上。另外，利用羟基官能团来引发包括己内酯在内的多种内酯的开环聚合反应，可以加上脂族酯间隔基。采用多种金属和有机催化剂，这些聚合是活性聚合，并得到带有端羟基的多种结构的支化聚酯。间隔基的引入在末端官能团之间提供了额外的分隔。(M.Trollsas，J.L.Hedrick J.Am.Chem.Soc.1998，120，4644；M.Trollsas，H.Claesson，B.Atthoff，J.L.Hedrick Angew.Chem.Int.Ed.1998，37(22)，3132；M.Trollsas，J.L.Hedrick，D.Mecerreyes，Ph.Dubois，R.Jerome，H.Ihre，A.Hult Macromolecules，1998，31，2756)。
2，2-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基)丙酸苄酯G1(CO2Bz，TBDMS)将2，2-双(羟甲基)丙酸苄酯(49.8g，222mmol)、叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)(80.5g，535mmol)和咪唑(37.8g，533mmol)溶解在150ml二氯甲烷中。将该混合物室温下搅拌12小时，并蒸发掉溶剂。将粗残留物溶解在己烷中并用水萃取。蒸发有机相得到95.2g(94％)的无色液体。1H-NMR(CDCl3)δ0.00(s，12H)，0.83(s，18H)，1.12(s，3H)，3.64-3.77(q，4H)，5.10(s，2H)，7.32(s，5H)。
脱甲硅烷基的通用程序向氮气气氛下的烧瓶中加入0.52mmolTBDMS保护的物质，30ml干燥的二氯甲烷和BF3-Et2O(92.6mmol)。将混合物40℃下搅拌12小时，并倒入冷甲醇中。将产物通过滗析或过滤分离，并且无需进一步纯化即可使用。
2，2-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基)丙酸G1(CO2H，TBDMS)和除去苄酯基团的通用程序将G1(CO2Bz，TBDMS)(210mmol，95.2g)溶解在EtOAc(100ml)中，并加入Pd/C(10wt％)(1.5g)。在氢化瓶中充入氢气(50psi)并在室温下摇晃6小时。停止反应并过滤催化剂。蒸发溶剂得到94.2g(99％)的无色液体。1H-NMR(CDCl3)δ0.00(s，12H)，0.82(s，18H)，1.07(s，3H)，3.6-3.69(q，4H)。
G2(CO2Bz，TBDMS)和用DCC酯化的通用程序将2，2-双(羟甲基)丙酸苄酯(23.3g，104mmol)、G1(CO2H，TBDMS)(79g，218mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶鎓-对甲苯磺酸盐(DPTS)溶解在150ml二氯甲烷中。然后加入二环己基碳二亚胺(DCC)(55.7g，270mmol)，并在室温下搅拌反应混合物12小时。将混合物过滤，并用柱层析纯化滤液(硅胶，己烷，EtOAc95∶5洗脱剂)。得到30g(32％)的无色粘稠油状物1H-NMR(CDCl3)δ0.00(s，24H)，0.84(s，36H)，1.09(s，6H)，1.23(s，3H)，3.56-3.70(q，8H)，4.15-4.30(q，4H)，5.13(s，2H)，7.33(s，5H)。
G2(CO2H，TBDMS)将G2(CO2Bz，TBDMS)(30.0g，32.9mmol)和Pd/C(1.5g)溶解在100mlEtOAc中，并按照上述方法用氢气处理4小时。得到26.2g(97％)的无色粘稠液体。1H-NMR(CDCl3)δ0.00(s，24H)，0.84(s，36H)，1.06(s，6H)，1.25(s，3H)，3.57-3.72(q，8H)，4.06-4.29(m，4H)，5.28(s，2H)。
尽管参考其优选实施方式对本发明进行了具体描述，但是本领域技术人员应当理解，在不偏离本发明精神和范围的前提下可以对其形式和细节作出多种变化。因此本发明决不限于所描述的准确形式和细节上，而是要落在所附权利要求书的范围内。
反应路线1
权利要求
1.一种组合物，它包括固体基质，一个末端部分连接到所述固体基质上并且至少一个其它末端部分含有醇官能团或羰基官能团的有机连接基团，和连接到醇官能团或羰基官能团上的选自缩醛和缩酮的对酸不稳定的保护基团。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述固体基质选自玻璃、搀杂玻璃、氧化物、半导体和金属。
3.根据权利要求1的组合物，其中所述固体基质是玻璃。
4.根据权利要求1的组合物，还包括用所述缩醛或缩酮保护的大量有机连接基团。
5.根据权利要求1的组合物，其中所述有机连接基团选自线性连接基团、聚合物连接基团和树枝状连接基团。
6.根据权利要求1的组合物，其中所述有机连接基团包括在所述末端部分之间的桥连基团。
7.根据权利要求6的组合物，其中所述桥连基团是具有式-(CH2)-n的烷烃链，其中n为约3-约30。
8.根据权利要求6的组合物，其中所述桥连基团是具有式-(CH2CH2O)-x的乙氧化物，其中x为约1-约50。
9.根据权利要求1的组合物，其中结合到所述固体基质上的所述末端部分包含取代的Si原子。
10.根据权利要求1的组合物，其中所述缩醛或缩酮是脂肪族或环状化合物。
11.根据权利要求1的组合物，其中所述缩醛或缩酮选自二甲基缩醛或缩酮，二氧戊环，四氢呋喃基，四氢吡喃基，甲氧基环己基，甲氧基环戊基，环己基氧乙基，乙氧基环戊基，乙氧基环己基，甲氧基环庚基，和乙氧基环庚基。
12.根据权利要求1的组合物，其中所述缩醛或缩酮选自四氢吡喃基缩醛，二甲基缩醛或缩酮，或二氧戊环。
13.根据权利要求1的组合物，其中所述缩醛或缩酮是通过加热或暴露于辐射下而去保护的。
14.一种组合物，它包括固体基质，一个末端部分结合到固体基质上并且至少一个其它末端部分含有醛基团的有机连接基团。
15.一种组合物，它包括固体基质，和至少一种结合到固体基质上的光致酸生成剂或光敏剂。
16.根据权利要求15的组合物，还包括结合到光致酸生成剂或光敏剂上的选自缩醛和缩酮的对酸不稳定的保护基团。
17.根据权利要求15的组合物，还包括其中一个末端部分结合到固体基质上并且至少一个其它末端部分结合到光致酸生成剂或光敏剂上的有机连接基团。
18.根据权利要求15的组合物，其中所述固体基质选自玻璃、搀杂玻璃、氧化物、半导体和金属。
19.根据权利要求15的组合物，其中所述固体基质是玻璃。
20.根据权利要求17的组合物，其中所述有机连接基团选自线性连接基团、聚合物连接基团和树枝状连接基团。
21.根据权利要求17的组合物，其中所述有机连接基团包括在所述末端部分之间的桥连基团。
22.根据权利要求21的组合物，其中所述桥连基团是具有式-(CH2)-n的烷烃链，其中n为约3-约30。
23.根据权利要求21的组合物，其中所述桥连基团是具有式-(CH2CH2O)-x的乙氧化物，其中x为约1-约50。
24.根据权利要求16的组合物，其中所述缩醛或缩酮是脂肪族或环状化合物。
25.根据权利要求16的组合物，其中所述缩醛或缩酮选自二甲基缩醛或缩酮，二氧戊环，四氢呋喃基，四氢吡喃基，甲氧基环己基，甲氧基环戊基，环己基氧乙基，乙氧基环戊基，乙氧基环己基，甲氧基环庚基，和乙氧基环庚基。
26.根据权利要求16的组合物，其中所述缩醛或缩酮选自四氢吡喃基缩醛，二甲基缩醛或缩酮，或二氧戊环。
27.根据权利要求16的组合物，其中所述缩醛或缩酮是通过加热或暴露于射线下而去保护的。
28.根据权利要求15的组合物，其中所述光致酸生成剂选自三氟甲磺酸盐，连苯三酚，鎓盐，碘鎓磺酸盐，羟基胺的三氟甲磺酸酯，α-双-磺酰基重氮甲烷，硝基取代的苯甲醇和萘醌-4-二叠氮化物的磺酸酯和烷基二磺酸盐。
29.根据权利要求15的组合物，其中所述光致酸生成剂选自三氟甲磺酸盐和鎓盐。
30.根据权利要求15的组合物，其中所述光敏剂选自蔗类、芘类、荧蒽类、蒽酮类、二苯酮类、噻吨酮类和蒽类。
31.一种制备可光活化的表面结合的连接分子的方法，包括将含有连接化合物的溶液涂覆在固体基质的湿润表面上，所述连接化合物包含结合到所述固体基质上的组分；干燥含有结合的连接化合物的固体基质；和烘烤干燥的固体基质。
32.根据权利要求31的方法，还包括在所述涂覆之前清洁所述固体基质。
33.根据权利要求32的方法，其中所述清洁处理选自硫酸处理、去离子水处理、异丙醇处理、热处理、NaOH处理、氧等离子体处理和盐酸处理。
34.根据权利要求31的方法，其中所述湿润的固体基质是通过将溶剂涂覆在所述固体基质上形成的，所述溶剂选自醇、烃、二元醇醚乙酸酯、二元醇醚、芳烃和氯代烃。
35.根据权利要求34的方法，其中所述湿润是在室温至最高达溶剂沸点的温度下进行的。
36.根据权利要求31的方法，其中含有所述连接化合物的所述溶液含有约1-约20wt％的溶解在溶剂中的连接化合物。
37.根据权利要求31的方法，其中所述连接化合物是有机连接基团和能够结合到所述固体基质上的化合物之间的反应产物。
38.根据权利要求31的方法，还包括将所述连接化合物去保护。
39.根据权利要求38的方法，其中所述去保护是通过加热或暴露于辐射下进行的。
全文摘要
本发明描述了一系列能够用于制造生物分子排列的可光活化的表面结合的连接分子。具体地说，公开了一种组合物，它包括固体基质，一个末端连接到所述固体基质上并且至少一个其它末端含有醇官能团或羰基官能团的有机连接基团，和连接到醇官能团或羰基官能团上的选自缩醛和缩酮的对酸不稳定的保护基团。本发明还描述了一种组合物，它包括固体基质，一个末端结合到固体基质上并且至少一个其它末端含有醛基团的有机连接基团。本发明还提供了一种组合物，它包括固体基质，和至少一种结合到固体基质上的光致酸生成剂或光敏剂。
文档编号G01N33/543GK1510420SQ20031011801
公开日2004年7月7日 申请日期2003年11月20日 优先权日2002年12月20日
发明者P·J·布罗克, R·A·迪派特罗, N·S·芬德, R·D·米勒, S·A·斯旺森, G·M·沃尔拉夫, P J 布罗克, 斯旺森, 沃尔拉夫, 米勒, 芬德, 迪派特罗 申请人:国际商业机器公司