一种产油酵母atp柠檬酸裂解酶及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及自圆红冬孢酵母分离得到的ATP柠檬酸裂解酶(ACL)及其编码核苷酸序列和重组载体。利用圆红冬孢酵母转录组测序结果，以圆红冬孢酵母菌CGMCC2.1389总RNA为模板，利用RT-PCR，分离得到Rt-ACL?cDNA序列，如SEQ?ID?No：1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No：3所示。本发明通过在红酵母中表达Rt-ACL基因组DNA序列，能够提高产油酵母细胞内的油脂含量；另外还通过构建到产油细菌或者产油微藻中的表达载体中，在其中表达来源于Rt-ACL的cDNA序列，也获得油脂含量的积累。本发明的ATP柠檬酸裂解酶基因可以用于构建微生物油脂生产细胞。
【专利说明】一种产油酵母ATP柠檬酸裂解酶及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及ATP柠檬酸裂解酶ACL，具体地说是自圆红冬孢酵母分离的ATP柠檬酸裂解酶基因的克隆、重组载体构建，以及在基因工程研究中的应用。
【背景技术】
[0002]国际石油价格屡创新高，低油价的时代一去不复返。为了保障国家石油安全，缓解石油过度依赖进口的危机，同时有效降低机动车污染物排放，我国正大力推动生物柴油的发展。生物柴油主要指以动植物油脂为原料，用甲醇或乙醇在催化剂作用下经脂交换制成的脂肪酸酯。然而利用动植物油脂为原料存在着与人争粮与农争地的问题，而微生物因其生长快、基本不依赖耕地、可连续生产、便于改造等特点，今年来显示出其突出的特点[赵宗保.中国生物工程杂志2005，25(2)，8-11]。因此利用微生物生产油脂为生物柴油提供原料是现今可选替代方案之一。
[0003]自然界中部分微生物在极端情况(如氮源缺乏)能在胞内积累超过其细胞干重20%的油脂，其中以甘油三酯为主，这些微生物被称为产油微生物。主要包括细菌、酵母、霉菌、藻类等。其中产油酵母包括Rhodotorula, Candida, Cryptococcus,Rhizopus, Trichosporon 和 Yarrowia 属中的某些菌株[Ratledge C, Wynn J P.AdvAppl Microb1l2002, 51,1-51]。产油细菌包括 Colwellia, Shewanella, Alteromonas,Pseudoalteromonas和Ferrimonas属中的某些菌株[相光明.粮食与油脂2008 (6), 7-11]。产油微藻包括Chlorella, Nannoch I和Phaeodactylums属中的某些菌株[郑洪立，中国生物工程学报2009，29，110-116。王立柱，微生物学通报2010，37，336-347。]
[0004]关于产油酵母，尤其是红酵母基因工程改造的研究相对匮乏，其在特定条件下积累油脂的机制仍未从分子水平上进行阐明仅仅从生化阐明产油酵母在调控油脂合成代谢过程中可能是ATP柠檬酸裂解酶(ACL)和苹果酸脱氢酶(ME)起到关键作用[Evans，C.T.and C.Ratledge.CanadianJournal of Microb1logyl985,31:1000-1005.]? ACL存在于细胞质中，催化柠檬酸裂解为乙酰辅酶A和草酰乙酸。它广泛存在于油脂酵母和霉菌中。在非产油酵母(即积累油脂不超过细胞干重20%)中不存在这个酶。近年来，有研究表明，红发夫酵母中ACL基因在限氮条件下，随着氮源的减少活性增大，其活性的提高有助于奸青素的积累[Cipriano Chavez-Cabrera, Zoila R, et al.Appl Microb1lB1technol2010，85:1953-1960.]。另有研究表明，在高山被抱霉(Mortierella alpina)中表达来源于自身的ACL基因，能够脂肪酸含量得到较大的提高[专利号:200880113428.X]。
[0005]但是，至今为止未有人进行过产油酵母的ACL基因的分离及其基因功能的鉴定，也没有人使用这个基因进行过油脂的生产。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种产油酵母ATP柠檬酸裂解酶蛋白、其编码核苷酸序列以及应用。具体来说，是一种来源于圆红冬孢酵母CGMCC2.1389的ATP柠檬酸裂解酶新基因Rt-ACL的克隆和生物功能分析，以及该基因在构建重组载体和构建基因工程菌株领域的应用。
[0007]为实验上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0008]首先，利用圆红冬孢酵母转录组测序结果，设计cDNA扩增的引物，以圆红冬孢酵母CGMCC2.1389总RNA为模板，经RT-PCR得到ATP柠檬酸裂解酶基因Rt-ACL，其cDNA具有如序列表SEQ ID NO:1所不的序列，其基因组DNA具有如序列表SEQ ID NO:2所不的序列，其氨基酸具有如序列表SEQ ID NO:3所示的序列。而后通过将其导入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，由于酿酒酵母中不存在ACL基因，因此能够对ACL的活性进行检测[Beth L.Fatland, Jinshan Ke, et al.PlantPhys1logy2002,130:740-756.] ?最后通过将这个功能确定的基因在红酵母自身、其他产油酵母及其他产油细菌、微藻中进行过表达，获得了油脂含量大量提高的菌株。
[0009]本发明提供的产油酵母ATP柠檬酸裂解酶，名称为Rt-ACL (R.toruloidesATP-citrate lyase,圆红冬孢酵母ATP柠檬酸裂解酶)，来源于圆红冬孢酵母R.toruloides CGMCC2.1389。所述产油酵母ATP柠檬酸裂解酶是由如下(a)或(b)的蛋白质:
[0010](a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0011](b)将SEQ ID NO:3的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与具有油脂运和代谢调控相关活性的由SEQ ID NO:3衍生的蛋白质。
[0012]为了使(a)中的蛋白便于纯化，可以由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0013]表1标签及其序列
[0014]
【权利要求】
1.一种ATP柠檬酸裂解酶，所述ATP柠檬酸裂解酶是由如下(a)或(b)的蛋白质: (a)由SEQID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将SEQID NO:3的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与具有油脂运和代谢调控相关活性的由SEQ ID NO:3衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述的ATP柠檬酸裂解酶的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其为SEQID N0:1。
4.包含权利要求2或3的核苷酸序列的重组载体。
5.一种重组细胞，所述细胞导入权利要求4所述的重组载体。
6.—种构建油脂生产重组细胞的方法，所述方法包括:将权利要求2或3所述的核苷酸序列导入宿主细胞中，得到油脂生产重组细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中通过用权利要求4所述的重组载体转化宿主细胞而导入权利要求2或3所述的核苷酸序列。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述宿主细胞选自酵母、微藻、红球菌或大肠杆菌。
9.根据权利要求8所 述的方法，其中所述酵母选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或圆红冬孢酵母(R.toruloides),所述微藻选自衣藻或聚球藻,所述红球菌是浑池红球菌(R.0pacus)。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述衣藻是莱茵衣藻(C.reinhardtii)。
【文档编号】C12N9/88GK104031902SQ201310067821
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2013年3月4日 优先权日:2013年3月4日
【发明者】赵宗保, 林心萍, 张素芳, 王雅南 申请人:中国科学院大连化学物理研究所