一种产油酵母脂肪酸合酶及其编码基因与应用的制作方法

一种产油酵母脂肪酸合酶及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种产油酵母脂肪酸合酶及其编码基因与应用。该脂肪酸合酶由RtFAS1亚基和RtFAS2亚基组成，所述RtFAS1亚基是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ?ID?NO：1的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与具有脂肪酸合酶亚基1功能的由SEQ?ID?NO：1所衍生的蛋白质；所述RtFAS2亚基是如下(c)或(d)的蛋白质：(c)由SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将SEQ?ID?NO：2的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与具有脂肪酸合酶亚基2功能的由SEQ?ID?NO：2所衍生的蛋白质。
【专利说明】一种产油酵母脂肪酸合酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种产油酵母脂肪酸合酶及其基因与应用。具体地，所述产油酵母脂肪酸合酶以及编码其的核苷酸来源于圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)。本发明还提供一种构建油脂生产重组细胞的方法。
【背景技术】
[0002]油脂是一种氧含量低、能量密度高、碳链长度适中的可再生资源，可以代替化石资源作为化学工业和可再生能源产业的基本加工原料，是人类从碳氢经济向碳氢氧经济过渡的重要链接，其市场潜力巨大。自然界中一部分微生物在特定条件下(如氮源缺乏)能在胞内贮存超过其细胞干重20%的油脂，其中以甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)为主，具有这种表型的微生物称为产油微生物，包括细菌、酵母、霉菌、藻类等，其中产油酵母包括Rhodotorula, Candida, Cryptococcus, Rhizopus, Trichosporon 和 Yarrowia 属中的某些菌株[Ratledge C,ffynn J P.Adv Appl Microb1l 2002,51,1-51]。利用微生物转化生物质资源生产油脂，可发展成基本不依赖耕地、可连续生产、降低农业污染、资源综合利用的新技术，形成化学品的石化资源替代品生产新途径[赵宗保.中国生物工程杂志2005，25 (2)，8-11]。
[0003]半个世纪以来，国内外微生物油脂研究的重点集中在菌株筛选、驯化和发酵工艺优化等领域，取得了重大进展。随着生物技术的快速发展，单纯的菌种筛选和培养工艺的优化已不能满足产油微生物性状改良的需要。做为某一化学品的天然生产菌株，其特定的生产性能往往并非最优。如何优化或改变工业菌株的代谢网络和表达调控网络，以提高生物基产品的积累速度或定向控制靶产品的质量，是当今生物【技术领域】研究的热点和难点。油脂发酵研究需要油脂代谢途径的重构和强化，赋予重组菌株生产新型脂肪酸衍生物的性能。由于优良土著生产菌株的遗传背景目前仍不清楚，油脂积累代谢调控相关基因克隆有限，寻找更多的油脂积累代谢调控相关基因，是目前微生物油脂研究的重要方向之一。
[0004]研究人员发现，来源于产油微生物(圆红冬孢酵母和斯氏油脂酵母)的异柠檬酸脱氢酶(IDH)和苹果酸酶(ME)的编码基因在土著菌油脂积累过程中有表达差异，酿酒酵母功能互补分析也证明这些基因可增加重组菌株的油脂含量，但并没能将一个非产油菌株成功改造成一个产油菌株[Yang F, Zhang SF, Zhou YJ, Zhu Zff, Lin XP, Zhao ZK.Appl.Microb1l.B1technol.2012,94(4)，1095-1105]。实验结果暗示，微生物油脂积累代谢调控可能涉及更多的基因及其间的相互调节和相互作用。
[0005]从乙酰CoA和丙二酸单酰CoA从头合成短链和中长链饱和脂肪酸，需要一系列的克莱森缩合反应并脱羧，是由几种酶活介导催化的复杂过程。在大多数细菌和植物中，这些酶活性是由离散的单功能多肽组成的酶系来完成(脂肪酸合酶类型II);而在哺乳动物和真菌中，这些酶活性则由一个或两个多功能多肽组成的寡聚酶来行使(脂肪酸合酶类型I)。在脂肪酸合成过程中，底物和中间产物分子在各个功能结构域(可以位于同一酶分子，也可以位于不同酶分子)中传递直到完成脂肪酸的整个合成过程[stoops JK,Arslanian MJ, Oh YH, Aune KC, Vanaman TC, Wakil SJ.Proc Natl Acad Sci USA.1975,72(5)，1940-1944]。
[0006]哺乳动物中的脂肪酸合酶(Fatty Acid Synthase, FAS)是一个同源二聚体,含有两个相同的多功能亚基(亚基分子量为272kDa)，每一个亚基的N端区域含有三个催化结构域:酮酯-酸基 ACP 合酶(ketoacyl synthase, KS)、单酸 / 乙酸转移酶(acyltransferase,AT)和脱水酶(dehydratase, DH), C端区域则含有四个结构域:烯酰ACP还原酶(enoylreductase, ER)、酮脂酸还原酶(ketoacyl reductase, KR)、酸基载体蛋白(acyl carrierprotein, ACP)和硫酯酶(th1esterase, TE);这两个区域被中间600个氨基酸残基组成的核心区域所分隔。在子囊菌门酵母中，ACP和其它6个酶活性结构域分别定位于两个不同亚基上，其一具有ACP、KR、KS和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyltransferase, PPT)结构域，另一亚基则含有AT、ER、DH和丙二酰/棕榈酰转移酶(malonyl/palmitoyl transferase, MPT)结构域。
[0007]最近,我们在圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)中发现一种新颖的脂肪酸合酶，该酶与别的真菌中存在的脂肪酸合酶的不同在于，其beta亚基(FASl)只含有AT(单酰/乙酰转移酶)结构域和ER(烯酰ACP还原酶)结构域，而其余的结构域均在alpha亚基(FAS2)上；同时，该脂肪酸合酶上存在两个前后串联的ACP结构域。截止专利提交日，NCBI上未检索到关于圆红冬孢酵母(R.toruloides)脂肪酸合酶的任何序列信息。

【发明内容】

[0008]本发明的目的是提供一种产油酵母脂肪酸合酶及其编码基因与应用。
[0009]本发明提供的产油酵母脂肪酸合酶，名称缩写为RtFAS(R.toruloides FattyAcid Synthase),来源于 圆红冬孢酵母(R.toruloides) CGMCC 2.1389,所述产油酵母脂肪酸合酶由RtFASl亚基和RtFAS2亚基组成，其中所述RtFASl亚基是如下(a)或(b)的蛋白质:
[0010](a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0011 ] (b)将SEQ ID NO:1的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与具有脂肪酸合酶亚基I功能的由SEQ ID NO:1所衍生的蛋白质；
[0012]所述RtFAS2亚基是如下(C)或(d)的蛋白质:
[0013](c)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0014](d)将SEQ ID NO:2的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与具有脂肪酸合酶亚基2功能的由SEQ ID NO:2所衍生的蛋白质。
[0015]其中所述“脂肪酸合酶亚基I功能”具体是指单酰/乙酰转移酶(AT)活性和烯酰ACP还原酶(ER)活性的加合；其中所述“脂肪酸合酶亚基2功能”具体是指脱水酶(DH)活性、丙二酰/棕榈酰转移酶(MPT)活性、第一酰基载体蛋白(ACP)活性、第二酰基载体蛋白(ACP)活性、酮脂酰还原酶(KR)活性、酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性或磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)活性的加合。
[0016]本发明还涉及产油酵母脂肪酸合酶(RtFAS)的生物活性多肽片段(在本文中，也称为结构域)，其氨基酸序列为选自如下片段中的任何一个或者任意两个或更多个片段的组合:[0017]SEQ ID NO:1的位置190-599 (其具有单酰/乙酰转移酶(AT)活性)，
[0018]SEQ ID NO:1的位置611-1142 (其具有烯酰ACP还原酶(ER)活性)，
[0019]SEQ ID NO:2的位置60-490 (其具有脱水酶(DH)活性)，
[0020]SEQ ID NO: 2的位置493-885 (其具有丙二酰/棕榈酰转移酶(MPT)活性)，
[0021]SEQ ID NO:2的位置1021-1186 (其具有第一酰基载体蛋白(ACP)活性)，
[0022]SEQ ID NO:2的位置1212-1378 (其具有第二酰基载体蛋白(ACP)活性)，
[0023]SEQ ID NO:2的位置1725-1983 (其具有酮脂酰还原酶(KR)活性)，
[0024]SEQ ID NO: 2的位置2066-2716 (其具有酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性)，和
[0025]SEQ ID NO: 2的位置2815-2926 (其具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)活性)。
[0026]所述的RtFAS的生物活性多肽片段(结构域)，其生物活性选自单酰/乙酰转移酶(AT)活性、烯酰ACP还原酶(ER)活性、脱水酶(DH)活性、丙二酰/棕榈酰转移酶(MPT)活性、第一酰基载体蛋白(ACP)活性、第二酰基载体蛋白(ACP)活性、酮脂酰还原酶(KR)活性、酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性或磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)活性中的任一种或者任两种或更多种的组合。
[0027]在基因工程生 产该脂肪酸合酶用于体外合成脂肪酸及其衍生物方面，为了使所述的RtFASl亚基和(/或)RtFAS2亚基分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在所述RtFASl亚基和(/或)RtFAS2亚基的氨基端连接上信号肽序列；为了使RtFAS蛋白或其亚基或其生物活性多肽片段(结构域)便于纯化，可在RtFASl亚基或RtFAS2亚基或其生物活性多肽片段(结构域)的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签或GST标签(谷胱甘肽S-转移酶标签)。
[0028]表1标签及其序列
[0029]
S I氨基酸残基个数~[Fm
Poly-Arg~ 5-6 (通常为 5 个)RRRRR
FLAG8DYKDDDDK
[0030]
Poly-His|2-10(通常为 6 个)lHHHHHH
C-myc10EQKLISEEDL
Strep-tag II~8WSHPQFEK
Poly-PheTlFFFFFFFFFFF
[0031]上述加标签重组RtFAS蛋白或其生物活性多肽片段(结构域)可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行常规蛋白质表达得到。上述加标签重组RtFAS蛋白或其生物活性多肽片段(结构域)的编码基因可能通过将SEQ ID NOs:3-13任何一项所示的DNA序列中缺失I个或几个编码氨基酸的密码子，和/或进行I个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5’端和3’端连上表1所示的标签的编码序列而获得。[0032]所述产油酵母脂肪酸合酶两个亚基RtFASl和RtFAS2的编码核苷酸序列(例如，rtfasl和rtfas2)也属于本发明的保护范围。
[0033]因此，本发明还提供一种编码本发明的产油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列。
[0034]优选地，所述RtFAS蛋白的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的DNA分子。
[0035]此外，所述RtFAS的生物活性多肽片段(结构域)的编码核苷酸序列也属于本发明的保护范围。
[0036]优选地，所述RtFAS的生物活性多肽片段(结构域)的编码核苷酸序列为SEQ IDNOs:5-13所示的DNA分子。
[0037]并且，含有本发明所述的核苷酸序列的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌株均属于本发明的保护范围。
[0038]因此，本发明还提供包含编码本发明的产油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列的表达盒或重组载体，优选是重组表达载体；提供导入了(例如，通过转化或转染技术导入)所述重组载体的重组细胞。
[0039]本领域技术人员应该理解，将编码产油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列或包含编码产油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列的重组载体导入宿主细胞可以按照本领域的常规技术进行，例如，可以通过转化、转染(例如，农杆菌介导的转染)或电穿孔等常规技术进行。 [0040]可用现有的担子菌表达载体和酿酒酵母表达载体构建含有所述编码核苷酸序列(例如，rtfasl和/或rtfas2，RtFAS生物活性多肽片段(结构域)编码核苷酸序列)的重组表达载体。
[0041]所述的担子菌表达载体包括根瘤农杆菌介导的基因重组载体和可用于担子菌微弹轰击的载体等。所述的担子菌表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可以引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、圆红冬孢酵母基因(如R.toruloides的G3PDH基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。所述的酿酒酵母表达载体包括酿酒酵母游离型表达载体(携带2μπι复制子或自主复制序列(ARS)，如pYX212、pYES2C/T等可自行购买的现有通用载体)和整合型表达载体(携带整合位点基因重组臂)。
[0042]使用rtfasl和/或rtfas2或RtFAS生物活性多肽片段(结构域)编码核苷酸序列构建重组酵母表达载体时，在其起始核苷酸前可以加上任何一种诱导型启动子或组成型启动子，如三磷酸甘油醛脱氢酶启动子PG3TOH、半乳糖诱导启动子pGallO，启动子可单独使用或与其它启动子结合使用。
[0043]本领域技术人员应该理解，为了便于编码本发明的产油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列在宿主细胞中的表达，取决于所选用的宿主细胞品系，可以适当地对所述核苷酸序列进行密码子优化；为了便于对转基因细胞系或重组菌株进行鉴定及筛选，可对所用载体进行修饰，如引入可以在酵母细胞中表达的编码产生颜色变化的酶(如绿色荧光蛋白)或发光化合物的基因(如GUS基因、突光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记基因(如卡那霉素标记基因、博莱霉素标记基因、潮霉素标记基因)或抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)、以及营养筛选标记基因(如LEU2、URA3)等；为了便于纯化，可以在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端连接纯化标签的编码序列。
[0044]本发明的另一个目的是提供一种构建油脂生产重组细胞的方法，所述方法包括将编码本发明的产油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列或其活性片段导入宿主细胞中，得到油脂生产重组细胞，或者将包含编码本发明的产油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列或其活性片段的表达盒或重组表达载体导入宿主细胞中，得到油脂生产重组细胞。其中所述宿主细胞优选酵母细胞。
[0045]利用任何一种可以启动外源基因在酿酒酵母中表达的载体，将本发明所提供的rtfasl和/或rtfas2或RtFAS生物活性多肽片段(结构域)编码核苷酸序列导入酵母细胞中，得到油脂生产重组酵母细胞。在一个优选的实施方案中，利用任何一种可以启动外源基因在圆红冬孢酵母中表达的载体，增加本发明所提供的rtfasl和/或rtfas2或RtFAS生物活性多肽片段(结构域)编码核苷酸序列的拷贝数，得到重组圆红冬孢酵母。
[0046]实验证明，本发明提供的产油酵母脂肪酸合酶及其编码基因可显著提高重组细胞的油脂含量。
[0047]综上所述，本发明提供下述:
[0048]1.一种产油酵母脂肪酸合酶，其由RtFASl亚基和RtFAS2亚基组成，其中所述RtFASl亚基是如下(a)或(b)的蛋白质:
[0049](a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0050](b)将SEQ ID NO:1的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与具有脂肪酸合酶亚基I功能的由SEQ ID NO:1所衍生的蛋白质；
[0051]所述RtFAS2亚基是如下(C)或(d)的蛋白质:
[0052](c)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0053](d)将SEQ ID NO:2的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与具有脂肪酸合酶亚基2功能的由SEQ ID NO:2所衍生的蛋白质。
[0054]2.根据第I项所述的产油酵母脂肪酸合酶，其中所述RtFASl亚基的氨基酸序列为SEQ ID N0:1，所述RtFAS2亚基的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0055]3.一种来源于第I项所述的产油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或结构域，所述多肽片段或结构域的氨基酸序列为选自如下片段中的任意一个或者任意两个或更多个片段的组合:
[0056]SEQ ID NO:1 的位置 190-599，
[0057]SEQ ID NO:1 的位置 611-1142，
[0058]SEQ ID NO:2 的位置 60-490，
[0059]SEQ ID NO:2 的位置 493-885，
[0060]SEQ ID NO:2 的位置 1021-1186，
[0061]SEQ ID NO:2 的位置 1212-1378，
[0062]SEQ ID NO:2 的位置 1725-1983，
[0063]SEQ ID NO:2 的位置 2066-2716，和
[0064]SEQ ID NO:2 的位置 2815-2926。
[0065]4.根据第3项所述的产油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或结构域，其生物活性选自单酰/乙酰转移酶(AT)活性、烯酰ACP还原酶(ER)活性、脱水酶(DH)活性、丙二酰/棕榈酰转移酶(MPT)活性、第一酰基载体蛋白(ACP)活性、第二酰基载体蛋白(ACP)活性、酮脂酰还原酶(KR)活性、酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性或磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)活性中的任一种或者任两种或更多种的组合。
[0066]5.编码第I项所述的产油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列。
[0067]6.根据第5项所述的核苷酸序列，其中编码所述产油酵母脂肪酸合酶的RtFASl亚基的核苷酸序列为SEQ ID NO:3 ;编码所述产油酵母脂肪酸合酶的RtFAS2亚基的核苷酸序列为 SEQ ID NO:4o
[0068]7.编码第3项所述的产油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或结构域的核苷酸序列，其选自如下核苷酸序列中的任意一个或者任意两个或更多个序列的组合:
[0069](a)如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，其编码RtFASl亚基的AT结构域；
[0070](b)如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，其编码RtFASl亚基的ER结构域；
[0071](c)如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，其编码RtFAS2亚基的DH结构域；
[0072](d)如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，其编码RtFAS2亚基的MPT结构域；
[0073](e)如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，其编码RtFAS2亚基的第一 ACP结构域；
[0074](f)如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，其编码RtFAS2亚基的第二 ACP结构域；
[0075](g)如SEQ ID NO : 11所示的核苷酸序列，其编码RtFAS2亚基的KR结构域；
[0076](h)如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列，其编码RtFAS2亚基的KS结构域；
[0077](i)如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，其编码RtFAS2亚基的PPT结构域。
[0078]8.含有第5-7项中任何一项所述的核苷酸序列的表达盒或重组表达载体。
[0079]9.含有第5-7项中任何一项所述的核苷酸序列的细胞。
[0080]10.一种构建油脂生产重组细胞的方法，所述方法包括将第3-7项中任何一项所述的核苷酸序列或者第8项的表达盒或重组表达载体导入宿主细胞中，得到油脂生产重组细胞。
【专利附图】

【附图说明】
[0081]图1为RtFAS与其它特种来源FAS的结构域组成比较分析图。
[0082]图2 为 rtfasl 和 rtfas2 基因 RT-PCR 扩增结果，泳道 l，rtfas2 ;泳道 2 ,rtfasl。扩增条带碱基长度分别为8.8kb和3.8kb。
[0083]图3为构建的RtFAS原核表达质粒pACYC-RtFASl+2的图谱。
[0084]图4为RtFAS原核表达产物的SDS-PAGE分析。M:蛋白分子量标准；C:诱导菌体全细胞；s:诱导菌体裂解液上清；P:诱导菌体裂解液沉淀。
[0085]图5为RtFAS的PPT结构域和ACP结构域原核表达产物Ni柱亲和纯化后的SDS-PAGE 分析。
[0086]图6为PPT结构域催化酰基载体蛋白(ACP)发生4’ -磷酸泛酰巯基乙胺修饰的Tricine-SDS-PAGE分析。纯化的GST-PPT可以催化GST-ACP发生4’ -磷酸泛酰巯基乙胺修饰，由于ACP被修饰后分子量增加340Dalton，通过Tricine-SDS-PAGE可以在16%聚丙烯酰胺凝胶上分离Apo-ACP和Holo-ACP。图6A为GST-ACP1，图6B为GST-ACP2。
[0087]图7是RtFAS的酵母表达载体构建的模块组装策略示意图。
[0088]图8是RtFAS酵母表达质粒图谱。【具体实施方式】
[0089]以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定并本明。本发明的范围由权利要求及其等价体限定。
[0090]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
[0091]圆红冬孢酵母(R.toruloides)CGMCC 2.1389:购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，该酵母菌株源自东京大学应用微生物研究所(IF0 8766)，由IFO 0559和IFO0880经配合而成的二倍体，等同于CBS 6016或NBRC 8766或NRRL Y-6987。
[0092]圆红冬孢酵母(R.toruloides)ATCC 10788:美国典型培养物保藏中心(ATCC)，该菌株源自 CB S-KNAff fungal b1diversity centre，等同于 IFO 0559 或 JCM 3792 或 CCRC20306 或 DBVPG 6740 或 IAM 13469 或 IGC4416 或 MUCL 30249 或 NCYC 921 或 NRRL Y-1091或 VKM Y-334 或 PYCC4416。
[0093]以下实施例中所涉及的培养基配方及用途如下:
[0094](I) YEH)培养基:酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，pH6.0,固体培养基则再加入琼脂粉15g/L ;用于菌种活化培养、种子液制备和菌种短期保藏。
[0095](2)限氮培养基:葡萄糖 70g/L，酵母粉 0.75g/L，(NH4)2SO4 0.lg/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4.7H20 1.5g/L，pH5.6，并补加 I % (V/V)的痕量元素液体(4.0g/L CaCl2.2H20，0.55g/L FeSO4.7H20，0.52g/L citric acid.H2O, 0.lOg/L ZnSO4.7H20，0.076g/LMnSO4.H2O和100 μ I 18M H2SO4)，用于菌株油脂积累和富含油脂菌体的培养。
[0096](3)非限氮人工合成培养基(简写为MM):葡萄糖25g/L，(NH4) 2S045g/L,MgSO4.7H200.5g/L，KH2PO4 3g/L)，用于圆红冬孢酵母的富营养恒化培养以及差异转录组学分析菌体样品的制备。
[0097](4)限氮人工合培养基(简称 MM-N):葡萄糖 25g/L，(NH4)2SO4 0.2g/L, MgSO4.7Η20
0.5g/L，KH2PO4 3g/L，K2SO4 6.3g/l，用于圆红冬孢酵母的限氮恒化培养以及差异转录组学分析菌体样品的制备。
[0098]实施例1:圆红冬孢酵母的多组学研究
[0099]圆红冬孢酵母(R.toruloides)全基因组从头测序:在YETO培养基中培养R.toruloides ATCC 10788，温度为30°C，转速200rpm，培养时间48h。收集菌体，按标准基因组DNA提取方法[精编分子生物学实验指南(第四版)，奥斯伯等著，颜子颖等译，科学出版社出版]制备基因组DNA，委托华大基因利用solexa测序仪进行分析，最终获得94个基因组构架，基因组全长20.2Mb。
[0100]圆红冬孢酵母(R.toruloides)转录组测序:在2L发酵罐中(初始培养基量
1.7L)，温度为30。。，pH为5.6的条件下恒化培养R.toruloides ATCC10788，通气速率为100L/h，溶氧保持为73%饱和(溶氧与搅拌联动)，YEH)培养基流加速率为0.828L/h (稀释率为0.53)(反应器工作体积为1.7L)。约10个工作体积后取样，离心收集菌体，立即于液氮中速冻，-70°C保存，干冰低温保存运输至华大基因(全名:北京六合华大基因科技股份有限公司深圳分公司)。采用液氮研磨-RNAiso法提取总RNA，RNA-Seq样品库的制备使用 mRNA_Seq8Sample Preparat1n Kit(购自 Illumina, San Diego, CA, USA),具体步骤参考产品使用说明。之后经Illumina HiSeq2000测序得到90bp的双末端序列。
[0101]基于R.toruloides全基因组从头测序和转录组测序数据，组合基因从头预测，共注释了 8171个蛋白编码基因。利用B1edit软件建立R.toruloides本地基因组数据库和蛋白质组数据库。基因和蛋白命名规则如下:根据注释基因所在scaffold(基因组构架)由大到小进行编码，编号前统一加上R.toruloides的两个单词前两个字母缩写，转录本和蛋白质后分别加.tl和.tip的后缀。比如，scaffoldl上5’端起第一个编码基因命名为RHT0_00001，对应的转录本为RHT0_00001.tl，相应编码的蛋白质序列为RHT0_00001.tip。数据库包含94个scaffold(基因组构架)，8171个编码基因及相应8171个蛋白。
[0102]实施例2:圆红冬孢酵母脂肪酸合酶的发现
[0103]R.toruloides ATCC 10788于YEPD固体培养基上复苏，30°C倒置培养48h，挑单菌落接种于50ml YEPD液体培养基(装液于250ml容量的三角瓶)，30°C，200rpm培养28h。培养液分别以1: 50 (V/V)比例转接于自动补料的2L连续发酵罐(工作体积1.7L)，培养基分别为丽和MM-N。恒化培养温度为30°C，pH通过滴加10.0M NaOH或2M HCl自动控制在5.6，转速保持为600rpm，通气速率为100L/h (约0.98VVM)，溶氧保持为85%饱和，稀释率为0.085。约15个工作体积后取样，样品经4°C，8000rpm离心5min收集，每45ml培养物能收集到约0.7g湿菌体，丽和MM-N菌体样品均立即于液氮中速冻，-70°C保存。菌体样品用于数字基因表达谱分析，以及胞内油脂含量分析，培养上清用于残氮分析[沈宏伟，靳国杰，胡翠敏，龚志伟，白凤武，赵宗保.生物工程学报2012，28 (I)，57-65]。
[0104]在实施例1基础上，菌体样品委托华大基因提取RNA后进行R.toruloides在限氮和非限氮培养条件下的数字基因表达谱分析。样品重复分析三次，数据分析基于三次重复分析中鉴定到的差异表达基因累加。
[0105]结果显示，R.toruloides npll使用MM和MM-N这两种培养基进行恒化培养时，油脂含量有显著的差别，限氮培养(MM-N培养)条件下，细胞积累的油脂量为33.3%，比非限氮培养(MM培养)条件下提高了 22.8%0通过检测培养液上清中氮的浓度表明非限氮条件下氮浓度为46.97mM，而限氮(MM-N)条件下，其氮的浓度已经低于检测限，表明菌体培养时采用了一种稳定的限氮与非限氮环境。
[0106]剔除含N碱基和低质量数据后，数字基因表达谱分析得到119192 (MM-N)和92644条(MM)条差异的clean Tag。在这些clean Tag的基础下进行了下面的分析,将Tag定位匹配到参考基因上，以获得基因的表达量，无法定位匹配到基因上的Tag，则将其定位匹配到基因组上，最后均不能匹配的Tag则认为是未知的Tag。过滤后得到56846个MM Tag (总数3454492个)和60010个MM-N Tag (总数为3600362个)。经过归一化处理，和统计检验，选取表达丰度比≥2，控制假阳性FDRS 0.001最终得到表达上调基因1176个，其中有两个表达丰度比≥ 10 的 Tag:CATGCCGCACTCGCCGGCCCC,和 CATGCAGGACATCGAGGTCGT,分别来源于两个核苷酸序列长度为3.8kb和8.8kb的转录本(R.toruloides本地转录组数据库中编号为RHT0_02032.tl和RHT0_02139.tl)，分别编码脂肪酸合酶beta亚基和alpha亚基。综合胞内油脂分析发现，RHT0_02032.tl和RHT0_02139.tl表达量随脂滴内油脂含量增加而增加，其编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，分别命名为RtFASl (RHT0_02032.tip)和 RtFAS2(RHT0_02139.tip)。
[0107]RtFASl由1266个氨基酸残基组成，分子量137kDa，理论等电点为6.2 ;没有信号肽标识，为胞内酶；归属于酵母脂肪酸合酶[EC 2.3.1.86] ；RtFASl结构域组成和子囊酵母脂肪酸合酶相差较大，仅含单酰/乙酰转移酶(AT)、烯酰ACP还原酶(ER)两个结构域，而子囊酵母脂肪酸合酶还携带有脱水酶(DH)和丙二酰/棕榈酰转移酶(MPT)结构域(图1)。
[0108]RtFAS2由2928个氨基酸残基组成，分子量318kDa ;理论等电点为6.65 ;没有信号肽标识，为胞内酶；归属于酵母脂肪酸合酶[EC 2.3.1.86] ；RtFAS2结构域组成和子囊酵母脂肪酸合酶相差较大，除含有酮脂酰还原酶(KR)、酮酯-酰基ACP合酶(KS)和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)等典型酵母脂肪酸合酶alpha亚基的共有结构域外，还携带有脱水酶(DH)、丙二酰/棕榈酰转移酶(MPT)、以及前后串联的第一酰基载体蛋白(ACP)和第二酰基载体蛋白(ACP)结构域，前两个结构域在其它酵母脂肪酸合酶的beta亚基上，前后串联的双ACP结构域(2 X ACP)则为RtFAS2所特有的(图1)。
[0109]将RtFASl和RtFAS2的编码基因分别命名为rtfasl (或RHT0_02032.tl)和rtfas2 (或 RHT0_02139.tl)，rtfasl 的 mRNA 序列如 SEQ ID NO:3 所示，rtfas2 的 mRNA 序列如SEQ ID NO:4所示。
[0110]实施例3:圆红冬孢酵母rtfasl和rtfas2基因的克隆
[0111]根据rtfasl和 tfas2的核苷酸序列设计基因特异性引物如下:
[0112]rtfasl-Fw:atgaacggccgagcgacgcggagcgtgact
[0113]rtfasl-Rv:tcagagcccgccgaagacgtcgagcttgag
[0114]rtfas2~Fw:atggtcgcggcgcaggacttgccgctcg
[0115]rtfas2-Rv:ctacttctgggcgatgacgacggcgcaagc
[0116]利用液氮研磨加RNaiso 方法[Yang F, Tan HD, Zhou YJ, Lin XP, Zhang SF.Mo 1.B1technol.2010,47(2):144-151]提取 R.toruloides CGMCC 2.1389 总 RNA。RNA 进行
1.5%琼脂糖凝胶电泳，使用荧光-紫外分析仪观察鉴定，可见清晰的两条带。用紫外/可见光光谱仪分析总RNA样品，测得0D260/0D280 = 2.0，表明总RNA质量很好。总RNA样品冻存于_80°C备用。
[0117]利用High Fidelity PrimeScript RT-PCR Kit(购自 Takara)合成 cDNA第一链。20 μ I 反应体系，首先，将2 μ I 总 RNA(~I μ g)，Oligo (dT)和Random6mer)各 ΙΟΟηΜ，2.0 μ IDEPC处理水(焦碳酸二乙酯处理水，购自大连TaKaRa公司)，加入到PCR管中混匀，于65°C保温 5min,立即置于冰上冷却 2min,加入酶 Mix (High Fidelity PrimeScript RT-PCR Kit自带反转录酶，购自Takara)，DEPC处理水补齐20μ 1，42°C 30min进行反转录，70°C 15min灭活酶。
[0118]以反转录合成的cDNA第一链为模板，进行rtfasl和rtfas2基因的PCR扩±1,5 XPCR 缓冲液(TakaRa) 10.0 μ 1，dNTPs(10mM, TaKaRa) 1.0 μ 1，引物 rtf as 1-Fw (/rtfas2-Fw)(50mM)和 rtfasl-Rv(/rtfas2_Rv)(50mM)各 1.0 μ I, PrimeSTar (大连TakaRa) 0.5 μ 1，合成的cDNA第一链模板1.0 μ LddH2O补齐至50 μ 1，于94°C保温3min,然后于98°C 10s, 68°C 5min (用于扩增rtfasl)或9min (用于扩增rtfas2), 30个循环,之后再加入Taq DNA聚合酶(TakaRa) 1.0 μ I进行扩增产物的3’末端加A，72°C 20min，4°C结束反应。扩增产物进行0.8% (质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，可观察到3.8kb (rtfasl)和8.8kb(rtfas2)左右的两条预期大小的条带(图2)，利用DNA回收试剂盒(购自北京舟鼎国，货号:NEP013-2)，按照供应商建议步骤(NEP013-2说明书)纯化PCR产物。PCR产物参照TaKaRa公司提供的方法(D102A说明书)克隆到pMD19_T载体，转化入E.coli DH5 α感受态细胞，挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取(碧云天质粒小量提取试剂盒，货号:D0003)。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序，测序结果表明，所扩增到的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，分别编码氨基酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的蛋白质。将SEQ ID NO:1所示的蛋白命名为RtFASl，将克隆得到的SEQ ID NO:3所示的核苷酸命名为rtfasl ^fSEQ ID NO:2所示的蛋白命名为RtFAS2，将克隆得到的SEQ ID NO:4所示的核苷酸命名为rtfas2。阳性重组质粒分别命名为pMD19T-RtFASl和pMD19T_RtFAS2。
[0119]RtFASl结构域组成和子囊酵母脂肪酸合酶beta亚基相差较大，仅含AT和ER两个结构域，而子囊酵母脂肪酸合酶还携带有DH和MPT结构域(图1)。RtFAS2的结构域组成和子囊酵母脂肪酸合酶alpha亚基相差较大，除含KR)、KS和PPT等典型酵母脂肪酸合酶alpha亚基的共有结构域外，还携带有DH、MPT、以及前后串联的第一酰基载体蛋白(ACP)和第二酰基载体蛋白(ACP)结构域，这种前后串联的双ACP结构域(2XACP)为RtFAS2所特有的(图1)。
[0120]实施例4:圆红冬孢酵母脂肪酸合酶的原核表达、蛋白纯化以及重组菌株产油性能分析
[0121]根据rtfasl核苷酸序列设计加相应酶切位点的引物(引物rtfasl-Nco1-F的下划线部分为NcoI酶切位点，引物rtfasl-Hindlll-R的下划线部分为HindIII酶切位点)，序列如下:
[0122]rtfasl-Nco1-F:ctctccat￡gatgaacggccgagcgacgcggagcgt
[0123]rtfas1-HindII1-R:tctaagctttcagagcccgccgaagacgtcgagct [0124]根据rtfas2核苷酸序列设计加相应酶切位点的引物(引物rtfas2-NdeI_F的下划线部分为NdeI酶切位点，引物rtfas2-AvrI1-R的下划线部分为AvrII酶切位点)，序列如下:
[0125]rtfas2_NdeI_F:ctctcatat￡gtcgcggcgcaggacttgccgct
[0126]rtfas2-AvrI1-R:tctcctaggctacttctgggcgatgacgacggcgc
[0127]以先前构建的克隆载体pMD19T-RtFASl和pMD19T_RtFAS2为模板，利用两对引物rtfas1-Nco1-F/rtfas1-HindII1-R 和 rtfas2-Nde1-F/rtfas2-AvrI1-R 分别扩增 rtfasl和rtfas2编码区序列。rtfasl的PCR扩增产物经Ncol/Hindlll双酶切，连入同样双酶切的pACY⑶uet-l (双表达载体,购自Novagen)载体(回收酶切大片段用于连接)，转化E.coli DH5a化学感受态细胞，经Ncol/Hindlll双酶切和测序验证正确的重组质粒命名为pACYC-RtFASl。Rtfas2 的 PCR 扩增产物经 Ndel/Avrll 双酶切，连入同样 Ndel/Avrll 双酶切的已构建的pACYC-RtFASl载体(回收酶切大片段用于连接)，转化E.coliDH5a化学感受态细胞，经Ncol/Hindlll和Ndel/Avrll酶切和测序双重验证正确的重组质粒命名为pACYC-RtFASl+2。(图 3)。
[0128]将pACYC-RtFASl+2 质粒转化 E.coli B121 (DE3)宿主，得到表达菌株 BL21/pACYC-RtFASl+2。挑单菌落接种于1ml Chl-LB培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl10g/l，并含氯霉素30 μ g/ml)，37 V培养4_6h至OD600nm为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mMIPTG进行诱导，30°C培养过夜。诱导表达结束后，取1ml菌液，于4°C，8000rpm离心5min收集菌体，菌体沉淀用 200 μ I NBP 缓冲液(50mM Na2HP04/NaH2P04,pH = 8.0,0.5M NaCl,20mM咪唑，ImM beta-巯基乙醇，ImM PMSF)中，利用超声破碎法提取可溶性蛋白(冰浴，超细探头，功率为60W，脉冲2s，间歇2s，总时间lmin)，至菌液变澄清；16000Xg，4°C离心10min，取上清为可溶性蛋白部分，利用等体积的裂解缓冲液重悬沉淀；利用SDS-PAGE分析蛋白的表达情况(10%丙烯酰胺凝胶)。结果如图4所示，0.1mM IPTG诱导条件下，重组RtFAS的两个亚基RtFASl和RtFAS2几乎完全可溶表达，重组RtFASl的分子量大约为138kDa (RtFASl理论分子量为137kDa，加标签(Str印-tag II)后融合蛋白分子量为138kDa);重组RtFAS2的分子量大约为319kDa(RtFAS2理论分子量为318kDa，加标签(6XHis)后融合蛋白分子量为 319kDa)。
[0129]重组RtFAS2亚基携带6XHis Tag，由于RtFAS2和RtFASl亚基间的蛋白相互作用，可利用镍亲和层析一步纯化重组RtFAS2和重组RtFASl两个亚基。蛋白纯化过程按照Invitrogen N1-NTA purificat1n system指导说明进行，以镍离子做为亲和离子，依靠咪唑浓度梯度(30-100mM咪唑)洗脱目的蛋白。BL21/pACYC-RtFASl+2进行100ml体积诱导表达(100mlChl-LB培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl 10g/l，并含氯霉素3(^8/!111)，371:培养4-611至00为0.5-0.8，加入终浓度为ImM IPTG进行诱导，30°C培养过夜)，离心收集菌体,加入 50ml NBP 缓冲液(50mMNa2HP04/NaH2P04，pH = 8.0,0.5M NaCl,20mM咪唑，ImM beta-巯基乙醇，ImM PMSF)中，超声破碎法提取可溶性蛋白(冰浴，功率为60W，脉冲2s，间歇3s，总时间30min)，至菌液变澄清;16000 X g，4。。离心10min，取上清可溶性蛋白，利用0.22 μ m低蛋白结合的滤膜过滤后，上样至镍亲和层析柱(体积1ml)，静置结合15min，然后依次用20倍柱体积的含20mM、40mM、60mM和80mM咪唑的洗涤缓冲液(50mMNa2HP04/NaH2P04, pH = 8.0,0.5M NaCl, ImM beta-巯基乙醇，相应浓度的咪唑)依次洗涤，最后用含 250mM 咪唑的洗脱缓冲液(50mMNa2HP04/NaH2P04，pH = 8.0,0.5M NaCl, ImMbeta-巯基乙醇，250mM咪唑)洗脱目的蛋白。所有纯化操作均在4°C进行，并保证预冷所有的相关缓冲液。纯化得到的蛋白保存于20%甘油中，分装后在-70°C保存。蛋白纯度由SDS-PAGE (10%丙烯酰胺凝胶)分析，结果显示，洗脱组分中重组RtFASl亚基和RtFAS2亚基纯度均大于90%。
[0130]将重组大肠杆菌BL21/pACYC-RtFASl+2接种M9-N培养基(M9限氮培养基:2%葡萄糖，0.6% Na2HPO4,0.3% KH2PO4,0.05 % NaCl, ImMMgSO4,0.1mM CaCl2,0.1% (v/v) 1000X微量元素混合液；1000X微量元素混合液成分:2.7% FeCl3.6H20,0.2% ZnCl2.4H20，0.2% CaCl2.2H20,0.2 % Na2MoO4.2H20,1.9% CuSO4.5H20,0.5% H3BO3)，37 °C，200rpm振荡培养24h,每隔6h取样，留做油脂含量分析[Rude M A, SchirmerA.Curr.0pin.Microb1l.2009，12，274-281]。结果发现，发酵终点时，与对照菌株BL21/pACYC Duet-1相比，BL21/pACYC-RtFASl+2胞内油脂含量由10%增加到19.2%，可见，胞内油脂含量提高了92%。证明RtFASl和RtFAS2基因共表达可促进重组大肠杆菌油脂积累，增加其胞内油脂含量。
[0131]实施例5 =RtFAS结构域PPT、ACP的原核表达和蛋白纯化
[0132]步骤一 RtFAS结构域PPT、ACP的原核表达和蛋白纯化
[0133]利用RF 克隆[Van den Ent F, Lowe J.J.B1chem.B1phys.Methods 2006,67,67-74 ；Yang F, Zhang S, Tang ff, Zhao Z.Yeast2008.25(9):623-630]方法构建 RtFAS 结构域PPT、ACP的原核表达载体。根据RtFAS的PPT结构域、ACPI结构域和ACPII结构域的编码基因核苷酸序列设计以下RF克隆引物:
[0134]41-GST-ACP 工-F:
[0135]TGGTGGCTCCGGTGATGACGACGACAAGGTCGCCGACGAGCCGCTCAAGG
[0136]41-GST-ACP 工-R:
[0137]ATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAGCGAGATGCCAGCCATCGAGG
[0138]41-GST-ACP 工工-F:
[0139]TGGTGGCTCCGGTGATGACGACGACAAGGTCCCCGACGAGCCGCTCAAGG
[0140]41-GST-ACP 工工-R:
[0141]ATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAGGGTGATGCCAGCCTGCGAG
[0142]41-GST-PPT-F:
[0143]GGTGGCTCCGGTGATGACGACGACAAGGGTGCTTTCGGCGTCGGCACG
[0144]41-GST-PPT-R:
[0145]ATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTCTGGGCGATGACGACGGCG
[0146]1、RFI 反应:5 XPrimeSTAR Buffer (TakaRa) 10.0 μ I, dNTPs (1mM,TaKaRa) 1.0 μ 1，ACPI 引物 41-GST-ACP1-F 和 41-GST-ACP1-R 各 1.0 μ I (或 ACPII 引物 41-GST-ACPI1-F 和 41-GST-ACPI1-R，或 PPT 引物 41-GST-PPT-F 和 41-GST-PPT-R，各L O μ 1，均 1mM)，PrimeSTAR(TakaRa)0.5 μ 1，实施例 3 中构建的 pMD19T_RtFAS2 载体作为模板(50ng/y 1)2.0μ I, ddH20 补齐至 50 μ 1，于 94°C保温 3min，然后于 98°C 10s，62。。10s，72°C lmin，30个循环，再72°C lOmin，4°C结束反应。扩增产物进行1.2% (质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，观察到预期大小的目的条带(ACPI和ACPII目的条带预期大小均为0.5kb左右，PPT目的条带预期大小0.33kb左右)，利用DNA回收试剂盒(购自北京舟鼎国，货号:NEP013-2)，按照供应商建议步骤(NEP013-2说明书)纯化PCR产物。
[0147]2、RFII 反应:模板 pET41a 质粒 DNA(购自 Novagen, 10ng/ μ I) I μ I,上述步骤I (RFI 反应)产物 8 μ I (约 600ng)，5XPrimeSTAR Buffer (TaKaRa) 10.0 μ I, dNTPs (1mM,TaKaRa) 1.Ομ I, PrimeSTAR (TakaRa) 0.5 μ l，ddH20 补齐至 50 μ 1，于 95°C 预变性 3min,95°Clmin，55°C lmin，68°C 7min，25个循环，4°C结束反应，得到约6.6kb左右的RFII产物(即，带缺口的插入目的基因片段的重组质粒)。
[0148]3、上述步骤 2 (RFII 反应)的 PCR 产物用 DpnI (购自 New England B1labs) I μ I于37°C消化lh，去除甲基化的模板质粒DNA，取5μ1电击转化E.coli DH5 α感受态细胞[分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版]，电击转化参数:2200-2500ν，400Ω，25μ F。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取和测序分析[Van den EntF, Lowe J.J.B1chem.B1phys.Methods 2006,67,67-74]。正确构建的重组质粒分别命名为 pET41a-ACPl、pET41a-ACP2 和 pET41a_PPT。
[0149]4、将上述步骤 3 中构建的 pET41a_ACPl、pET41a_ACP2 和 pET41a_PPT 重组载体分别转化E.coli B121(DE3)感受态细胞，得到表达菌株BL21/pET41a_ACPl、BL21/pET41a-ACP2和BL21/pET41a-PPT。分别挑单菌落接种于10ml Kan-LB培养基(胰蛋白胨 10g/l，酵母粉 5g/l，NaCl 10g/l，并含卡那霉素 50 μ g/ml)，37°C 培养 4_6h 至 OD6tltol 为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM IPTG进行诱导，30°C培养过夜。诱导表达结束后，取Iml菌液，于4°C，8000rpm离心5min收集菌体，菌体沉淀用200 μ I细菌裂解缓冲液(10mM1^8-!1(:1，20%甘油，21111 EDTA, 1.5mM DTT, pH7.5)重悬，利用超声破碎法提取可溶性蛋白(冰浴，超细探头，功率为60W，脉冲2s，间歇2s，总时间lmin)，至菌液变澄清；16000X g，4°C离心10min，取上清为可溶性蛋白部分，利用等体积的裂解缓冲液重悬沉淀；利用SDS-PAGE分析蛋白的表达情况(12% (Μ/V)丙烯酰胺凝胶)。结果显示，0.1mM IPTG诱导条件下，携带GST Tag的RtFAS-ACPl、RtFAS_ACP2和RtFAS-PPT三个重组蛋白(分别简写为GST-wACPl、GST-wACP2和GST_wPPT)几乎完全可溶表达，分子量分别为50kDa、50kDa和45kDa(RtFAS-ACP1、RtFAS-ACP2和 RtFAS-PPT 的理论分子量分别为 20kDa、20kDa、和 15kDa，GST标签蛋白分子量为30kDa)。
[0150]5、蛋白纯化过程按照 Invitrogen N1-NTA purificat1n system 指导说明进行，以镍离子做为亲和离子，依靠咪唑浓度梯度(30-100mM咪唑)洗脱目的蛋白。BL21/pET4Ia-ACP1、BL21/pET41a_ACP2 和 BL21/pET4la-PPT 分别进行 100ml 体积诱导表达(1000ml Kan-LB培养基(含卡那霉素50 μ g/ml)，37 °C培养4_6h至OD为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM IPTG进行诱导，30°C培养过夜)，离心收集菌体，加入50ml NBP缓冲液(50mMNa2HP04/NaH2P04, pH = 8.0,0.5M NaCl，20mM 咪唑，ImM beta-巯基乙醇，ImM PMSF)中，超声破碎法提取可溶性蛋白(冰浴，功率为60W，脉冲2s，间歇3s，总时间1min)，至菌液变澄清；16000Xg，4°C离心10min，取上清可溶性蛋白，利用0.22μπι低蛋白结合的滤膜过滤后，上样至镍亲和层析柱(体积5ml)，静置结合15min，然后依次用20倍柱体积的含 20mM、40mM、60mM 和 80mM 咪唑的洗涤缓冲液(50mMNa2HP04/NaH2P04，pH = 8.0,0.5MNaCl, ImM beta-巯基乙醇，相应浓度的咪唑)依次洗涤，最后用含250mM咪唑的洗脱缓冲液(50mMNa2HP04/NaH2P04，pH = 8.0,0.5M NaCl，ImM beta-巯基乙醇，250mM 咪唑)洗脱目的蛋白。所有纯化操作均在4°C进行，并保证预冷所有的相关缓冲液。纯化得到的蛋白保存于20%甘油中，分装后在-70°C保存。所有纯化操作均在4°C进行，并保证预冷所有的相关缓冲液。纯化得到的蛋白保存于20%甘油中，分装后在-70°C保存。蛋白纯度由SDS-PAGE (12% (Μ/V)丙烯酰胺凝胶)分析，结果如图5所示，洗脱组分中重组GSTiACPl、GST-wACP2和GST-wPPT蛋 白纯度均大于90%。
[0151]6、镍亲和纯化后的重组蛋白 GST-wACPl、GST_wACP2 和 GST-wPPT 使用 MilliporeAmicon Ultra-15超滤管(购自Millipore，截留分子量为10kD，货号:UFC201024PL)浓缩蛋白，并将原洗脱缓冲液置换为酶反应缓冲液(20mM Tris-HCl, 10mM NaCl, 10mM KCl,5mM MgCl2, 1mM CaCl2, ImM beta-巯基乙醇，0.5mM DTT, 15% (w/v)甘油，ρΗ7.5)。操作按UFC201024PL说明书进行，首先将前面纯化的蛋白浓缩至体积约为1ml，加入1ml酶反应缓冲液，再次离心浓缩至体积为1ml，如此重复3次，最后将蛋白定容于2-3ml酶反应缓冲液，此时已经将镍亲和纯化时的洗脱缓冲液中的咪唑降低至1mM以下。测定蛋白浓度，蛋白-20°C保存。
[0152]步骤二 PPT结构域对ACP结构域的4-磷酸泛酰巯基乙胺修饰
[0153]圆红冬孢酵母脂肪酸合酶PPT结构域具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性，可催化新生的ACP(apo-ACP，无活性形式)与辅酶A反应，生成3’，5’-二磷酸腺苷(3’，5’_ADP)和活化的ACP (ho1-ACP, 36位丝氨酸残基的羟基上通过磷脂键连接一个来自辅酶A的4’
磷酸泛酰基巯基乙胺)。
[0154]20 μ g GST-ACP、2yg GST-PPT 和 0.3mM CoA (辅酶 A，购自上海生工生物)混合于 20μ I 酶反应缓冲液(20mM Tris-HCl, pH = 7.5, 10mM NaCl, 10mM KCl,5mM MgCl2,1mM CaCl2, ImM beta-巯基乙醇，0.5mM DTT, 15 % (w/v)甘油)中，30 °C 温育 3 小时。10μ I样品-20°C保存，用于质谱鉴定。剩余10μ I样品中加入1μ 1(?υ/μ I)肠激酶(enterokinase，购自生工生物)，稀释体积至12.5 μ 1，25 °C反应16小时，加入48.5μ IddH20 和 20 μ 14 X SDS-PAGE 样品缓冲液(12% SDS (W/V)，6 % 巯基乙醇(V/V)，30 % 甘油(^)，0.05%考马斯蓝6-250(561^3)，1501111 Tris/HCl (ρΗ7.0))，50 °C 温育 15min。取8 μ I 样品进行 Trcine-SDS-PAGE,凝胶浓度为 16% [ Schagger H.Nat Protoc.2006，I (I)，16-22.]。结果显示，纯化的GST-PPT可以催化GST-ACP发生4’ -磷酸泛酰巯基乙胺修饰，由于ACP被修饰后分子量增加340Dalton，通过Tricine-SDS-PAGE可以在16%聚丙烯酰胺凝胶上分离Apo-ACP和Holo-ACP (图6)
[0155]实施例6:圆红冬孢酵母脂肪酸合酶的真核表达和重组菌株构建
[0156]步骤一、圆红冬孢酵母脂肪酸合酶表达载体pYX212_RtFASl+2构建
[0157]利用酿酒酵母体内高效同源重组优势，基于模块组装策略[Zhou YJ, Gao W，RongQX, Jin GJ, Chu HY, Liu WJ, Yang ff, Zhu Zff, Li GH, Zhu GF, Huang LQ, Zhao ZK.J.Am.Chem.Soc.2012，134，3234-3241]，进行RtFAS重组酿酒酵母菌株的构建和RtFAS的功能互补分析。
[0158]根据RtFASl和RtFAS2编码基因序列以及酿酒酵母组成型表达载体pYX212 [购自B1vector中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心]的DNA序列,设计以下用于模块组装的引物。模块组装过程如图7所示，引物序列信息如表2所示。 [0159]表2.pYX212-RtFASl+2载体构建所需引物
[0160]
引物名称 I别称I序列
【权利要求】
1.一种产油酵母脂肪酸合酶，其由RtFASl亚基和RtFAS2亚基组成，其中所述RtFASl亚基是如下(a)或(b)的蛋白质: (a)由SEQID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将SEQID NO:1的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与具有脂肪酸合酶亚基I功能的由SEQ ID NO:1所衍生的蛋白质； 所述RtFAS2亚基是如下(c)或(d)的蛋白质: (c)由SEQID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (d)将SEQID NO:2的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与具有脂肪酸合酶亚基2功能的由SEQ ID NO:2所衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的产油酵母脂肪酸合酶，其中所述RtFASl亚基的氨基酸序列为SEQ ID N0:1，所述RtFAS2亚基的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
3.一种来源于权利要求1所述的产油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或结构域，所述多肽片段或结构域的氨基酸序列为选自如下片段中的任意一个或者任意两个或更多个片段的组合:
SEQ ID NO:1 的位置 190-599，
SEQ ID NO:1 的位置 611-1142，
SEQ ID NO:2 的位置 60-490，
SEQ ID NO:2 的位置 493-885，
SEQ ID NO:2 的位置 1021-1186，
SEQ ID NO:2 的位置 1212-1378，
SEQ ID NO:2 的位置 1725-1983， SEQ ID NO:2 的位置 2066-2716，和 SEQ ID NO:2 的位置 2815-2926。
4.权利要求3所述的产油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或结构域，其生物活性选自单酰/乙酰转移酶(AT)活性、烯酰ACP还原酶(ER)活性、脱水酶(DH)活性、丙二酰/棕榈酰转移酶(MPT)活性、第一酰基载体蛋白(ACP)活性、第二酰基载体蛋白(ACP)活性、酮脂酰还原酶(KR)活性、酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性或磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)活性中的任一种或者任两种或更多种的组合。
5.编码权利要求1所述的产油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的核苷酸序列，其中编码所述产油酵母脂肪酸合酶的RtFASl亚基的核苷酸序列为SEQ ID NO:3 ;编码所述产油酵母脂肪酸合酶的RtFAS2亚基的核苷酸序列为 SEQ ID NO:4o
7.编码权利要求3所述的产油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或结构域的核苷酸序列，其选自如下核苷酸序列中的任意一个或者任意两个或更多个序列的组合: (a)如SEQID NO:5所示的核苷酸序列，其编码RtFASl亚基的AT结构域； (b)如SEQID NO:6所示的核苷酸序列，其编码RtFASl亚基的ER结构域； (c)如SEQID NO:7所示的核苷酸序列，其编码RtFAS2亚基的DH结构域； (d)如SEQID NO:8所示的核苷酸序列，其编码RtFAS2亚基的MPT结构域； (e)如SEQID NO:9所示的核苷酸序列，其编码RtFAS2亚基的第一 ACP结构域；(f)如SEQID NO:10所示的核苷酸序列，其编码RtFAS2亚基的第二 ACP结构域； (g)如SEQID NO: 11所示的核苷酸序列，其编码RtFAS2亚基的KR结构域； (h)如SEQID NO:12所示的核苷酸序列，其编码RtFAS2亚基的KS结构域； (i)如SEQID NO:13所示的核苷酸序列，其编码RtFAS2亚基的PPT结构域。
8.含有权利要求5-7中任何一项所述的核苷酸序列的表达盒或重组表达载体。
9.含有权利要求5-7中任何一项所述的核苷酸序列的细胞。
10.一种构建油脂生产重组细胞的方法，所述方法包括将权利要求3-7中任何一项所述的核苷酸序列或者权利要求8的表达盒或重组表达载体导入宿主细胞中，得到油脂生产重组细胞。
【文档编号】C12N15/63GK104031896SQ201310067825
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2013年3月4日 优先权日:2013年3月4日
【发明者】赵宗保, 朱志伟, 张素芳 申请人:中国科学院大连化学物理研究所