从临床标本中检测结核菌感染的逆转录pcr方法
【专利摘要】本发明涉及一种从临床标本中检测结核菌感染的逆转录PCR方法，用PCR检测方法对临床标本中结核菌的小RNA进行检测；步骤一：提取临床标本中的总RNA；步骤二：以步骤一中提取的总RNA为模板逆转录合成cDNA；步骤三：针对结核菌小RNA检测引物和步骤二中合成的cDNA进行PCR检测。
【专利说明】从临床标本中检测结核菌感染的逆转录PCR方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及从临床标本中检测结核菌感染的逆转录PCR方法。
【背景技术】
[0002]现有技术中，常用的结核菌感染检测方法包括CSF抗酸杆菌涂片法和结核分枝杆菌培养检测法。CSF抗酸杆菌涂片法存在的不足之处在于阳性率低，约10%，且需要检材中的细菌> IOVmi才能找到，特异性差。结核分枝杆菌培养检测法存在的不足之处在于操作复杂，培养时间较长，需4~8周，且阳性率低，多在20~30%。
【发明内容】
[0003]本发明的发明目的在于提供一种从临床标本中检测结核菌感染的逆转录PCR方法，操作简单，耗时短，阳性率高。
[0004]实现本发明目的的技术方案:
[0005]一种从临床标本中检测结核菌感染的逆转录PCR方法，其特征在于:用PCR检测方法对临床标本中结核菌的小RNA进行检测。
[0006]步骤一:提取临床标本中的总RNA ；
[0007]步骤二:以步骤一中提取的总RNA为模板逆转录合成cDNA ；
[0008]步骤三:针对结核菌小RNA检测引物和步骤二中合成的cDNA进行PCR检测。
[0009]优选地，步骤三中PCR反应体系包括2倍浓缩PCR反应缓冲液、dNTP、结核菌小RNA检测引物、步骤二中合成的cDNA模板和DNA聚合酶。
[0010]优选地，步骤三中PCR反应条件为，98°C 10秒，68°C 30秒，重复45个循环；PCR结果经过琼脂糖凝胶电泳和溴乙锭染色后，在紫外灯下显色拍照，有阳性条带的标本为结核感染患者。
[0011]优选地，步骤三中PCR反应体系为:2倍浓缩PCR反应缓冲液25微升、dNTP0.4mM、结核菌小RNA检测引物I微升、步骤二中合成的cDNA模板I微升、DNA聚合酶1.25单位，加去离子水补充体积至50微升。
[0012]结核菌小RNA检测引物可以为以下各组引物其中的一组:[0013]第一组:正向引物 SEQ ID N0.1:5'-TCGTCGTCGACGCTTAGGTA-3'[0014]反向引物SEQ ID N0.2:5'-TGGGTTGGACGACTCGACGT-3[0015]第二组:正向引物 SEQ ID N0.3:5'-ATCGGTGCCGGACCAGTTCA-3'[0016]反向引物SEQ ID N0.4:5'-AGCTGGTACTTCGCACCGGA-3[0017]第三组:正向引物 SEQ ID N0.5:5'-CGGCCTGCGTATGACCCATA-3'[0018]反向引物SEQ ID N0.6:5'-AGGCGTTGTTGGCCACTTAT-3[0019]第四组:正向引物 SEQ ID N0.7:5'-CGGATAGCCCCGTGTTGTTG-3'[0020]反向引物SEQ ID N0.8:5'-CTGGGTCCCCTCCCACCAGC-3[0021]第五组:正向引物 SEQ ID N0.9:5'-ATAGAGGACGGAGTCGGTGA-3'[0022]反向引物 SEQ ID N0.10:5'-AGAAACTTCGCCTCGAGGTA-3'[0023]第六组:正向引物 SEQ ID N0.11:5'-CCACGTACTCGATCCCGTTG-3'[0024]反向引物 SEQ ID N0.12:5'-ACTTGGGGGGATTGGGAGGT-3'[0025]第七组:正向引物 SEQ ID N0.13:5'-AACTCCCCCAGGGCTGGAAG-3'[0026]反向引物 SEQ ID N0.14:5'-CGTGGGTATACCGAGGTCCA-3'[0027]第八组:正向引物 SEQ ID N0.15:5'-CTCGGCCATAGCCGAGGGTG-3'[0028]反向引物 SEQ ID N0.16:5'-AGGGACGACCCCCGCCAGGG-3'[0029]第九组:正向引物 SEQ ID N0.17:5'-CGGGACTCCTGAGAAGGATC-3'[0030]反向引物 SEQ ID N0.18:5'-CGCACGTCAGCCCCACCCGT-3'[0031]本发明具有的有益效果:[0032]本发明用PCR检测方法对临床标本中结核菌的小RNA进行检测，并对PCR反应体系和反应条件、结核菌小RNA检测引物进行特有设计，检测操作简单、耗时短、阳性率高(可达60%-70%)，便于大规模筛查检测。结核菌的小RNA游离存在于细菌外，标本容易获得，
无需结核菌培养，更安全、快速，大大缩短检测时间；结核菌的小RNA可以抵抗RNA酶的降解作用，可稳定存在，有效提高了检测的敏感性。本发明对PCR反应体系和反应条件的特有设计，可以高灵敏度的检测标本中低水平的结核菌小RNA。本发明根据结核菌的小RNA特点，对结核菌小RNA检测引物进行设计，序列更加优化。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1为各组引物对结核杆菌感染患者血浆标本检测结果图；
[0034]图2为不同来源的血浆使用同一组引物的检测结果图。
【具体实施方式】
[0035]获取临床标本:采集患者外周血3-5毫升，1000-1500转/分，水平离心10分钟。小心吸取上层血浆200微升至无菌1.5毫升离心管中。其他液体样本经13000转/分’离心10分钟，小心吸取上层液体200微升至无菌1.5毫升离心管中。
[0036]步骤一:提取临床标本的总RNA。
[0037]200微升临床标本中，加入500微升酚胍RNA提取液，充分混匀，室温静置5分钟。加入300微升氯仿，混匀后12000转/分离心10分钟。小心吸取上层澄清液体至一无菌2毫升离心管中。加入900微升丙酮，混匀后用硅胶膜吸附。蛋白洗液冲洗一次，100%乙醇和80 %乙醇依次冲洗一次，待乙醇挥发后，用TE或去离子水洗脱RNA，收集与无菌1.5毫升离心管中，即为临床标本中的总RNA。
[0038]步骤二:以步骤一中提取的总RNA为模板逆转录合成cDNA。
[0039]反应体系:总RNA取10微升，9碱基随即引物I微升，dNTPl微升，逆转录酶100单位，5倍浓缩反应缓冲液4微升，0.1M 二硫苏糖醇I微升，去离子水补充体积到20微升。
[0040]反应条件:50°C—小时，75°C 15分钟后，低温保存，即为cDNA。
[0041]步骤三:针对结核菌小RNA检测引物和步骤二中合成的cDNA进行PCR检测。
[0042]PCR反应体系:2倍浓缩PCR反应缓冲液25微升，dNTP0.4mM,结核菌小RNA检测引物I微升，cDNA模板I微升，DNA聚合酶1.25单位，加去离子水补充体积至50微升。[0043]PCR反应条件:98°C 10秒，68°C 30秒，重复45个循环。
[0044]结果判定:PCR结果经过琼脂糖凝胶电泳和溴乙锭染色后，在紫外灯下显色拍照，有阳性条带的标本为结核感染患者。图1中，M泳道为分子量标准，1-9泳道为对应第一组-第九组引物组的检测结果。图2中，M泳道为分子量标准，1-11泳道为临床结核患者，12泳道为正常人标本。
[0045]结核菌小RNA检测引物可以为以下各组引物其中的一组:
[0046]第一组:正向引物SEQIDN0.1:5'-TCGTCGTCGACGCTTAGGTA-3'[0047]反向引物SEQIDN0.2:5/-TGGGTTGGACGACTCGACGT-3'[0048]第二组:正向引物SEQIDN0.3:5/-ATCGGTGCCGGACCAGTTCA-3'[0049]反向引物SEQIDN0.4:5,-AGCTGGTACTTCGCACCGGA-3'[0050]第三组:正向引物SEQIDN0.5:5/-CGGCCTGCGTATGACCCATA-3'[0051]反向引物SEQIDN0.6:5/-AGGCGTTGTTGGCCACTTAT-3'[0052]第四组:正向引物SEQIDN0.7:5'-CGGATAGCCCCGTGTTGTTG-3'[0053]反向引物SEQIDN0.8:5/-CTGGGTCCCCTCCCACCAGC-3'[0054]第五组:正向引物SEQIDN0.9:5/-ATAGAGGACGGAGTCGGTGA-3'[0055]反向引物SEQIDN0.10:5-AGAAACTTCGCCTCGAGGTA-3[0056]第六组:正向引物SEQIDN0.11:5/-CCACGTACTCGATCCCGTTG-3'[0057]反向引物SEQIDNO? 12:5-ACTTGGGGGGATTGGGAGGT-3[0058]第七组:正向引物SEQIDN0.13:5/-AACTCCCCCAGGGCTGGAAG-3'[0059]反向引物SEQIDN0.14:5-CGTGGGTATACCGAGGTCCA-3[0060]第八组:正向引物SEQIDN0.15:5/-CTCGGCCATAGCCGAGGGTG-3'[0061]反向引物SEQIDN0.16:5-AGGGACGACCCCCGCCAGGG-3[0062]第九组:正向引物SEQIDN0.17:5/-CGGGACTCCTGAGAAGGATC-3'[0063]反向 引物SEQIDN0.18:5-CGCACGTCAGCCCCACCCGT-3
【权利要求】
1.一种从临床标本中检测结核菌感染的逆转录PCR方法，其特征在于:用PCR检测方法对临床标本中结核菌的小RNA进行检测。
2.根据权利要求1所述的从临床标本中检测结核菌感染的逆转录PCR方法，其特征在于:步骤一:提取临床标本中的总RNA ；步骤二:以步骤一中提取的总RNA为模板逆转录合成cDNA ；步骤三:针对结核菌小RNA检测引物和步骤二中合成的cDNA进行PCR检测。
3. 根据权利要求2所述的从临床标本中检测结核菌感染的逆转录PCR方法，其特征在于:步骤三中PCR反应体系包括2倍浓缩PCR反应缓冲液、dNTP、结核菌小RNA检测引物、步骤二中合成的cDNA模板和DNA聚合酶。
4.根据权利要求3所述的从临床标本中检测结核菌感染的逆转录PCR方法，其特征在于:步骤三中PCR反应条件为，98°C 10秒，68°C 30秒，重复45个循环；PCR结果经过琼脂糖凝胶电泳和溴乙锭染色后，在紫外灯下显色拍照，有阳性条带的标本为结核感染患者。
5.根据权利要求所述4的从临床标本中检测结核菌感染的逆转录PCR方法，其特征在于:步骤三中PCR反应体系为'2倍浓缩PCR反应缓冲液25微升、dNTP0.4mM、结核菌小RNA检测引物I微升、步骤二中合成的cDNA模板I微升、DNA聚合酶1.25单位，加去离子水补充体积至50微升。
6.根据权利要求1至5任何一项所述的从临床标本中检测结核菌感染的逆转录PCR方法，其特征在于:结核菌小RNA检测引物可以为以下各组引物其中的一组:第一组第二组第三组第四组第五组第六组第七组第八组第九组正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQID N0.1:5/ -TCGTCGTCGACGCTTAGGTA-3'ID N0.2:5/ -TGGGTTGGACGACTCGACGT-3'ID N0.3:5/ -ATCGGTGCCGGACCAGTTCA-3'ID N0.4:5/ -AGCTGGTACTTCGCACCGGA-3'ID N0.5:5/ -CGGCCTGCGTATGACCCATA-3'ID N0.6:5/ -AGGCGTTGTTGGCCACTTAT-3'ID N0.7:5/ -CGGATAGCCCCGTGTTGTTG-3'ID N0.8:5/ -CTGGGTCCCCTCCCACCAGC-3'ID N0.9:5/ -ATAGAGGACGGAGTCGGTGA-3'ID N0.10:5/ -AGAAACTTCGCCTCGAGGTA-31ID N0.11:5/ -CCACGTACTCGATCCCGTTG-3'ID N0.12:5/ -ACTTGGGGGGATTGGGAGGT-31IDN0.13:5/ -AACTCCCCCAGGGCTGGAAG-3'ID N0.14:5/ -CGTGGGTATACCGAGGTCCA-31ID N0.15:5/ -CTCGGCCATAGCCGAGGGTG-3;ID N0.16:5/ -AGGGACGACCCCCGCCAGGG-31ID N0.17:5/ -CGGGACTCCTGAGAAGGATC-3'ID N0.18:5/ -CGCACGTCAGCCCCACCCGT-31
【文档编号】C12Q1/04GK103571938SQ201310068037
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年2月25日 优先权日:2013年2月25日
【发明者】张凤民, 付英梅, 宋武琦, 钱均, 李玉军, 李文静 申请人:哈尔滨医科大学