从临床标本中检测结核菌感染的荧光定量pcr方法
【专利摘要】本发明涉及一种从临床标本中检测结核菌感染的荧光定量PCR方法，用荧光定量PCR检测方法对临床标本中结核菌的小RNA进行检测；步骤一：提取临床标本中的总RNA；步骤二：以步骤一中提取的总RNA为模板逆转录合成cDNA；步骤三：针对结核菌小RNA检测引物和步骤二中合成的cDNA进行荧光定量PCR检测。
【专利说明】从临床标本中检测结核菌感染的荧光定量PCR方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及从临床标本中检测结核菌感染的荧光定量PCR方法。
【背景技术】
[0002]现有技术中，常用的结核菌感染检测方法CSF抗酸杆菌涂片法和结核分枝杆菌培养检测法。CSF抗酸杆菌涂片法存在的不足之处在于阳性率低，约10%，且需要检材中的细菌> 104/ml才能找到，特异性差。结核分枝杆菌培养检测法存在的不足之处在于操作复杂，培养时间较长，需4~8周，且阳性率低，多在20~30%。
【发明内容】
[0003]本发明的发明目的在于提供一种从临床标本中检测结核菌感染的荧光定量PCR方法，操作简单，耗时短，阳性率高。
[0004]实现本发明目的的技术方案:
[0005]一种从临床标本中检测结核菌感染的荧光定量PCR方法，其特征在于:用荧光定量PCR检测方法对临床标本中结核菌的小RNA进行检测。
[0006]步骤一:提取临床标本中的总RNA ；
[0007]步骤二:以步骤一中提取的总RNA为模板逆转录合成cDNA ；
[0008]步骤三:针对结核菌小RNA检测引物和步骤二中合成的cDNA进行荧光定量PCR检测。
[0009]优选地，步骤三中荧光定量PCR反应体系包括2倍浓缩荧光PCR反应缓冲液、结核菌小RNA检测引物、步骤二中合成的cDNA模板。
[0010]优选地，步骤三中荧光定量PCR反应条件为，95°C 10秒，60°C 20秒，重复50个循环；60°C延伸反应时采集荧光亮度值，产物经65°C _95°C缓慢升温，同时检测荧光亮度，绘制溶解曲线；根据溶解曲线与标准比对，判定样本反应产物是否正确，与正常人标本对比，小RNA含量明显升高的临床标本为结核感染患者。
[0011]优选地，步骤三中荧光定量PCR反应体系为:2倍浓缩荧光定量PCR反应混合液10微升，结核菌小RNA检测引物I微升，步骤二中合成的cDNA模板I微升，加去离子水补充体积至20微升。
[0012]结核菌小RNA检测引物可以为以下各组引物其中的一组:
[0013]第一组:正向引物SEQIDN0.1:5'-TCGTCGTCGACGCTTAGGTA-3[0014]反向引物SEQIDN0.2:5/-TGGGTTGGACGACTCGACGT-3[0015]第二二组:正向引物SEQIDN0.3:5/-ATCGGTGCCGGACCAGTTCA-3[0016]反向引物SEQIDN0.4:5'-AGCTGGTACTTCGCACCGGA-3[0017]第三 三组:正向引物SEQIDN0.5:5/-CGGCCTGCGTATGACCCATA-3[0018]反向引物SEQIDN0.6:5'-AGGCGTTGTTGGCCACTTAT-3[0019]第四组:正向引物SEQIDN0.7:5'-CGGATAGCCCCGTGTTGTTG-3
【权利要求】
1.一种从临床标本中检测结核菌感染的荧光定量PCR方法，其特征在于:用荧光定量PCR检测方法对临床标本中结核菌的小RNA进行检测。
2.根据权利要求1所述的从临床标本中检测结核菌感染的荧光定量PCR方法，其特征在于:步骤一:提取临床标本中的总RNA ；步骤二:以步骤一中提取的总RNA为模板逆转录合成cDNA ；步骤三:针对结核菌小RNA检测引物和步骤二中合成的cDNA进行荧光定量PCR检测。
3.根据权利要求2所述的从临床标本中检测结核菌感染的荧光定量PCR方法，其特征在于:步骤三中荧光定量PCR反应体系包括2倍浓缩荧光PCR反应缓冲液、结核菌小RNA检测引物、步骤二中合成的cDNA模板。
4.根据权利要求3所述的从临床标本中检测结核菌感染的荧光定量PCR方法，其特征在于:步骤三中荧光定量PCR反应条件为，95°C 10秒，60°C 20秒，重复50个循环；60°C延伸反应时采集荧光亮度值，产物经65°C _95°C缓慢升温，同时检测荧光亮度，绘制溶解曲线；根据溶解曲线与标准比对，判定样本反应产物是否正确，与正常人标本对比，小RNA含量明显升高的临床标本为结核感染患者。
5.根据权利要求所述4的从临床标本中检测结核菌感染的荧光定量PCR方法，其特征在于:步骤三中荧光定量PCR反应体系为:2倍浓缩荧光定量PCR反应混合液10微升，结核菌小RNA检测引物I微升，步骤二中合成的cDNA模板I微升，加去离子水补充体积至20微升。
6.根据权利要求1至5任何一项所述的从临床标本中检测结核菌感染的荧光定量PCR方法，其特征在于:结核菌小RNA检测引物可以为以下各组引物其中的一组:
【文档编号】C12Q1/68GK103571939SQ201310068046
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年2月25日 优先权日:2013年2月25日
【发明者】张凤民, 宋武琦, 黄颖, 陈小贝, 李爱梅, 钱均 申请人:哈尔滨医科大学