专利名称：一种双适配子试剂盒及其在结核菌抗原检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子免疫学领域。具体涉及一种能特异性结合毒性分枝杆菌H37RV菌 体表面抗原，而不结合BCG的单链DNA适配子试剂盒及其在结核抗原检测中的应用。
背景技术：
结核病是由结核分枝杆菌引起的、人兽共患的慢性消耗性传染病，给人类健康带 来严重威胁。据世界卫生组织(WHO)统计资料显示，全球目前有近三分之一的人感染结核 杆菌，活动性肺结核病人达2000万，每年有300万人死于结核病，每 年新发病人数800 1000万。1993年，世界卫生组织宣布“全球结核病处于紧急状态”，把结核病列为重点控制 的传染病之一。我国是结核病高负担国家，现有活动性肺结核病人500万人，传染性肺结核病人 200万人，每年新增病例约130万人，因结核病死亡15万人之多(《全国结核病防治规划 (2001-2010年)》，国办发[2001]75号文件)。国务院已确定结核病为我国三大重点防治传 染病之一。我国结核病疫情的严重程度仅次于印度，位居世界第二。我国结核病疫情呈三 高一低，即患病率高、死亡率高、耐药率高，年递降率低。近年来由于HIV/AIDS流行、人口流 动、耐药结核菌逐年增加，结核病发病率开始上升，结核病疫情更加严重。运用新型诊断方法对结核病进行早期诊断与治疗具有十分重要的意义，目前国内 外结核已有的诊断技术存在许多缺陷，缺乏特异、有效、快速、方便、廉价的诊断技术和产 品，特别是一直缺乏对结核抗原的敏感早期检测手段。过去PPD (结核菌素纯蛋白衍化物 )也常用于结核病的诊断和流行病学调查，但是其缺乏特异性，敏感性低，有一定应用局限 性；传统的痰抗酸染色的灵敏度难以达到，并且不能区分不同结核分枝杆菌；传统的抗体 检测方法存在窗口期问题，不能达到检测目的，并且不能区分是卡介苗接种还是感染结核 的问题；近些年发展的RT-PCR的诊断方法虽然特异性强，但需昂贵仪器，成本高。临床上对 疑似感染结核的病人，由于缺乏有效的诊断方法，常常采用先抗结核治疗，再以治疗的效果 为依据来进行诊断，如此一来浪费了大量的人力物力，也可能造成对其他疾病的误诊或是 延误治疗。所以，探索新型诊断方法对结核病进行早期诊断研究用于结核病快速、有效、方 便、廉价的特异性检测，特别是急需开发一种比临床上传统使用的抗酸染色方法更灵敏和 快速地用于结核菌抗原诊断的新型试剂，对于及时诊断、治疗结核病人和控制结核病传染 疫情都具有十分重要的意义。
发明内容
针对上述不足，本发明提供一种能够特异性结合毒性结核分枝杆菌H37Rv的两种 单链DNA适配子试剂盒。本发明通过SELEX筛选技术，通过多轮筛选得到两个DNA单链适配子，分别命名为 ZXL2和ZXL3，其核苷酸序列分别如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。ZXL2和ZXL3对结 核分枝杆菌H37Rv具有良好的特异性。
基于此，本发明提供一种双适配子检测试剂盒，其包括适配子ZXL2和ZXL3。上述试剂盒，适配子ZXL2和ZXL3中的一种包被于酶标板，另一种用生物素标记。 优选ZXL2包被于酶标板，ZXL3用生物素标记。上述试剂盒，其还可进一步包括酶标链霉亲和素、PBST和终止液中的一种或多种。 所述酶标链霉亲和素是辣根过氧化物酶标记链霉亲和素。所述终止液为浓硫酸，优选终止 液为2M的H2SO4。本发明首次将此单链适配子与结核病的诊断结合起来，该适配子ZXL2、ZXL3体外 容易合成，且能特异性与结核分枝杆菌H37Rv结核。本发明试剂盒比传统的痰抗酸染色的 诊断方法的优点是本发明试剂盒能区分毒性结核分枝杆菌与其它分支杆菌包括BCG，并 且可以检测低于104CFU/ml的结核菌，而传统的痰抗酸染色的灵敏度难以达到；与传统的抗 体检测方法相比的优点是能检测抗原，且能缩短窗口期，达到早期诊断目的；与RT-PCR的 诊断方法相比的优点是不需昂贵仪器，成本低。而且DNA单链适配子体外合成非常简单， 而且价格低廉，同时我们发明的方法操作简单，操作时间短(1 天完成)，对于结核病人痰培 养阳性的诊断灵敏度和精确度都很高，临床应用前景广阔。
图1双适配子夹心法适配子浓度的确定
两种适配子分别与H37RV、BCG结合，IOOnM非生物标记的适配子ZXL2结合细菌，IOnM 生物素标记的适配子ZXL3检测时，非特异性反应最低(0D45C1<0. 2)，确定与结核杆菌H37Rv 结合的ZXL2适配子的最佳浓度为ΙΟΟηΜ，ZXL3适配子的最佳浓度为ΙΟηΜ。图2本发明双适配子试剂盒的特异性鉴定
图中l、H37Rv ；2、BCG ；3、耻垢分枝杆菌；4、鸟分枝杆菌；5、胞内分枝杆菌；6、藤黄微球 菌；7、绿脓杆菌；8、金黄色葡萄球；9、大肠杆菌；10、金黄色葡萄球菌耐药株；11、白葡萄球 菌。双适配子夹心法可以在环境为PBS，细菌浓度为IO4 CFU/mL的条件下有效的鉴别 出H37Rv与不同非分枝杆菌和分枝杆菌。图3双适配子夹心法检测正常人及病人痰液
正常人痰液使用双适配子方法检测时，OD45tl值< 0. 1。结核病人痰液抗酸染色阳性的， 都能与IOOnM浓度的ZXL2适配子和IOnM浓度的ZXL3适配子反应，且有很高的OD值。OD450 值> 0. 2。
具体实施例方式以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指 明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下面凡是涉及到结核 杆菌的操作，均在生物安全柜中操作。本发明中非生物素标记即指未标记。实施例1试剂盒适配子浓度的确定 实验方法
(1)把从公司合成的生物素标记的ZXL3适配子用无菌的双蒸水分别稀释成10nM，40nM UOOnM,400nM的浓度，_20°C冰箱中保存。
(2)把不同种的细菌结核杆菌标准毒株H37Rv，卡介苗，黄微球菌，绿脓杆菌，金 黄色葡萄球菌，肠炎杆菌，金黄色葡萄球菌耐药株，白色葡萄球菌分别在合适的培养基中培 养，其中结核杆菌标准毒株H37Rv，卡介苗(BCG)在改良罗氏培养基中培养，其他细菌在LB 培养基中培养，然后在使用当天，用生理盐水调成不同的浓度。(3)双适配子法最适浓度的鉴定，将100nM，400nM未标记的适配子ZXL2 (用 0. 05mol/L NaHC03> pH值为8. 0稀释)包被96孔板后，在紫外光下暴露常温过夜。弃掉孔 中的液体，每孔加300 μ 1 PBST (0. 5%。)，洗6次，每孔加入不同浓度(1\1050 ^!111，1\104 CFU/ml、lX103CFU/ml、lX102 CFU/mlUXlO1 CFU/ml)的 H37RV、BCG 100 μ 1，每个浓度 设6个复孔，同时设一个不加细菌的阴性对照孔，4°C，孵育过夜。弃掉孔中的液体，每孔加 300 μ 1 PBST,洗6次，由于每种细菌的每个浓度设8个复孔，因此两种细菌的每个浓度的2 个复孔加一个浓度的适配子，每孔100 μ 1，4°C，孵育过夜。弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST (0. 5 %。)，洗6次，加入不同浓度的生物素标记的适配子ZXL3 (ΙΟηΜ, 40nM、IOOnM, 400nM)，4°C，孵育过夜。弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST (0. 5%。)，洗6次，加入然 后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，37°C，孵育半个小时。弃掉孔中的液体，每孔加 300 μ 1 PBST (0. 5%0)，洗6次，然后用2Μ的H2SO4终止反应。在酶标仪上，用450nm的滤光 片读取OD值。实验结果结果如图1所示，两种适配子分别与H37Rv、BCG结合，IOOnM未标 记的适配子ZXL2结合细菌，IOnM生物素标记的适配子ZXL3检测时，非特异性反应最低 (OD450<0. 2)，确定与结核杆菌H37Rv结合的ZXL2适配子的最佳浓度为ΙΟΟηΜ，ZXL3适配子 的最佳浓度为ΙΟηΜ。实施例2双适配子法特异性的鉴定
将H37Rv、BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、藤黄微球菌、绿脓杆菌、金黄 色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌耐药株、大肠杆菌、白葡萄球菌稀释至浓度为IO4 CFU/mL，备
用。 将IOOnM非生物素标记的适配子ZXL2 (用0. 05mol/L NaHC03、pH值为8. 0稀释) 包被96孔板后，在紫外光下暴露常温过夜。弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBSTC0. 5%0)， 洗6次，每孔分别加入lX103CFU/ml (不同的细菌，同一个浓度)的不同细菌100μ1，每种 细菌设2个复孔，同时设一个不加细菌的阴性对照孔，4°C，孵育过夜。弃掉孔中的液体，每 孔加300 μ 1 PBST,洗6次，加IOnM入生物素标记的适配子ZXL3，4°C，孵育过夜。弃掉孔中 的液体，每孔加300 μ 1 PBSTC0. 5%。)，洗6次，加入然后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲 和素，37°C，孵育半个小时。弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST(0.5%。)，洗6次，然后用 2M的H2SO4终止反应。在酶标仪上，用450nm的滤光片读取OD值。结果如图2所示，双适配子夹心法可以在环境为PBS，细菌浓度为IO4 CFU/mL的条 件下有效的鉴别出H37Rv与不同非分枝杆菌和分枝杆菌。实施例3双适配子法临床诊断与抗酸染色法的比较 材料与方法
(1).取97份正常人痰液，用3%NaHC03等比稀释。正常人痰液收集自武汉地区五所大 学武汉大学基础医学院(20份)、武汉大学本部(20份)、华中师范大学(20份)、武汉理工大 学(17份)、华中农业大学(20份)，采取自愿的形式，随机抽取年龄在18到27岁的97份非结核感染期正常人痰液。其中男生74人，女生23人；59人来自农村，38人来自城市；42人 确认接种过卡介苗，其余55人未接种或者不清楚是否接种过卡介苗；6人家族内有结核患 者；4人曾被结核感染过。(2).取48份结核病人的痰液，一部分拿去做抗酸染色，另一部分用3%NaHC03等 比稀释，进行以下本双适配子法检测。
(3).将 IOOnM 未标记的适配子 ZXL2 (用 0. 05mol/L NaHC03、PH 值为 8. 0 稀释) 包被96孔板后，在紫外光下暴露常温过夜。弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBSTC0. 5%0)， 洗6次，每孔分别加入稀释后的正常人和病人痰液100 μ 1，同时设一个不加痰液的阴性对 照孔，4°C，孵育过夜。弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST，洗6次，加IOnM入生物素标 记的适配子ZXL3，4°C，孵育过夜。弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST (0. 5%。)，洗6次， 加入然后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，37°C，孵育半个小时。弃掉孔中的液体， 每孔加300μ1 PBST (0.5%。)，洗6次，然后用2Μ WH2SO4终止反应。在酶标仪上，用450nm 的滤光片读取OD值。实验结果
__表1
I总符合率(%) I特异性
双适配子夹心法 88. 28_87. 37
抗酸染色丨51.97丨51.87
将武汉市疾病救助中心确诊的结核病人作为阳性比较，正常人作为阴性比较，计算双
适配子夹心法和抗酸染色的总符合率、特异性。表中结果显示双适配子夹心法的总符合
率为88. 28%、特异性为87. 37%。与抗酸染色的符合度为0. 988 ；抗酸染色的总符合率为
51. 97%、特异性为51. 87%。根据本结果说明本方法比抗酸染色的特异性高。双适配子夹心
法与抗酸染色检测方法进行比较，特异性提高35个百分点，敏感度由原来的10000 CFU/mL
提高到100 CFU/mL。将传统通过痰培养的诊断方法从过去的2_8周缩减为1天。如图3所示，正常人痰液使用双适配子方法检测时，OD45tl值< 0. 1。结核病人痰液 抗酸染色阳性的，都能与IOOnM浓度的ZXL2适配子和IOnM浓度的ZXL3适配子反应，且有 很高的OD值。OD45tl值> 0.2。实施例4本发明试剂盒组成 1.包被ZXL2的酶标板；
用pH8. 0的磷酸缓冲液将非生物素标记的适配子ZXL2稀释至浓度为100 nM。按照每 孔IOOml包被96孔ELISA板，4°C包被过夜。2.生物素标记ZXL3 (由上海赛百盛公司合成)
3.辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；
4.底物显色液
A 液TMB 0. 02% (w/v)
B液无水柠檬酸2. lg，无水Na2HPO4 2. 82g，0. 75%的过氧化氢0. 64ml，双蒸水定容至 IOOml
配置方法称取TMB 20mg(固体)，先用无水乙醇IOml溶解，充分振荡(试剂瓶要干净， 干燥)，加双蒸水定容到100 ml，此为底物A.底物B，取无水柠檬酸2. lg，无水Na2HPO4 2. 82g，0. 75%的过氧化氢0. 64ml，双蒸水定容至IOOml (无须调pH值，应在4. 5-5. 0范围)。使用时A:B各取5ml混勻。(合成品订购于达科为生物技术有限公司) 5.终止液2M H2SO4。注
本发明中所用的LB培养基的制备方法为配制IL的用量蛋白胨IOg酵母抽提物 5g NaCl IOg调pH值至7. 0-7. 2.分装后于121摄氏度灭菌15min.
本发明中所用的改良罗氏培养基的制备发法为味精(谷氨酸钠95%以上)7.2g; 磷酸二氢钾2. 4g;硫酸镁0. 24g;柠檬酸镁0. 6g;甘油12mL;蒸馏水600mL;马铃薯淀粉 30g;全卵液1000mL;2%孔雀绿20mL.制备法各盐类成分溶解后，加马铃薯淀粉，混勻， 沸水锅内煮沸30 40min (其间不时摇动，防凝块)，呈糊状，待冷后，加入经消毒纱布过滤 的新鲜全卵液IOOOmL,混勻。加2%孔雀绿20mL，混勻，分装试管(18mmX 180mm)。每一试 管加培养基7mL，培养基斜面高度为培养基占试管底部的三分之二处为宜，置血清凝固器内 凝固。凝固器内温度至90°C时，放入分装试管，以摆放两层为宜。待凝固器内温度达85 90°C，计时，凝固1 1.5h后取出，放冷，无菌试验后放4°C冰箱备用，一个月内使用。本发明中所用包被缓冲液(pH8. 0，0. 05M碳酸盐缓冲液)Na2CO3 1. 59克， NaHCO3 2. 93克加蒸馏水至1000ml，使用前配置。
权利要求
1.一种双适配子夹心试剂盒，包括DNA适配子ZXL2和ZXL3，它们的核苷酸序列分别如 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，ZXL2和ZXL3中的一种包被于酶标板， 另一种用生物素标记。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，ZXL2包被于酶标板，ZXL3用生物素标记。
4.根据权利要求广3任一项所述的试剂盒，其还包括酶标链霉亲和素、PBST和终止液 中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标链霉亲和素为辣根过氧化物 酶标记链霉亲和素。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述终止液为2M的H2SO4。
7.权利要求广6任一项所述的试剂盒在检测结核菌抗原中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种能灵敏和快速地用于结核菌菌体抗原诊断的新型双适配子夹心ELISA试剂盒，其包括ZXL2和ZXL3两个适配子。本发明利用SELEX筛选得到的DNA单链适配子命名为ZXL2、ZXL3，首次建立该双适配子夹心ELISA试剂盒，将其与结核病的早期诊断结合起来，与临床上传统的抗酸染色检测方法进行比较，特异性提高35个百分点，敏感度由原来的10000CFU/ml提高到100CFU/ml。将传统通过痰培养的诊断方法从过去的2-8周缩减为1天。本发明操作简单快速，成本低廉，大大提高了对结核病人诊断特异性、敏感性和精确度，特别是提供了一种新型结核抗原早期诊断试剂盒，临床应用前景广阔。
文档编号G01N33/569GK102128926SQ20101057442
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月6日 优先权日2010年12月6日
发明者章晓联 申请人:武汉大学