从临床标本中检测结核菌感染的基因芯片检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种从临床标本中检测结核菌感染的基因芯片检测方法，用基因芯片检测方法对临床标本中结核菌的小RNA进行检测；步骤一：提取临床标本中的总RNA；步骤二：以步骤一中提取的总RNA为模板逆转录合成cDNA，并标记；步骤三：用基因芯片对步骤二中合成的标记cDNA进行检测。
【专利说明】从临床标本中检测结核菌感染的基因芯片检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及从临床标本中检测结核菌感染的基因芯片检测方法。
【背景技术】
[0002]现有技术中，常用的结核菌感染检测方法包括CSF抗酸杆菌涂片法和结核分枝杆菌培养检测法。CSF抗酸杆菌涂片法存在的不足之处在于阳性率低，约10%，且需要检材中的细菌> IOVmi才能找到，特异性差。结核分枝杆菌培养检测法存在的不足之处在于操作复杂，培养时间较长，需4~8周，且阳性率低，多在20~30%。
【发明内容】
[0003]本发明的发明目的在于提供一种从临床标本中检测结核菌感染的基因芯片检测方法，操作简单，耗时短，阳性率高。
[0004]实现本发明目的的技术方案:
[0005]一种从临床标本中检测结核菌感染的基因芯片检测方法，其特征在于:用基因芯片检测方法对临床标本中结核菌的小RNA进行检测。
[0006]步骤一:提取临床标本中的总RNA ；
[0007]步骤二:以步骤一中提取的总RNA为模板逆转录合成cDNA，并标记；
[0008]步骤三:用基因芯片对 步骤二中合成的标记cDNA进行检测。
[0009]步骤三中的具体检测方法为，取20微升步骤二中合成的标记cDNA，加入20微升2倍杂交缓冲液，65°C杂交过夜；室温洗涤基因芯片3次，每次I分钟；基因芯片扫描，以100%和10%功率各扫描一次，经数据处理软件分析后，得到杂交图。
[0010]基因芯片包括与结核菌小RNA基因相关的探针序列、用于定量的阳性对照基因和用于阴性对照的基因。
[0011 ] 基因芯片具有9组探针序列，每组探针序列与结核囷小RNA的I个基因序列互补，每组探针序列具有4-8个探针。
[0012]本发明具有的有益效果:
[0013]本发明用基因芯片检测方法对临床标本中结核菌的小RNA进行检测，并对基因芯片进行特有设计，检测操作简单、耗时短、阳性率高(可达60% -70% )，便于大规模筛查检测。结核菌的小RNA游离存在于细菌外，标本容易获得，无需结核菌培养，更安全、快速，大大缩短检测时间；结核菌的小RNA可以抵抗RNA酶的降解作用，可稳定存在，有效提高了检测的敏感性。本发明对基因芯片进行特有设计，结核菌小RNA包括9个基因，即Asl726、Asl890、Aspks、F6、Asdes、G2、C8、Bll和B559基因，基因芯片对应包括9组相关探针序列，可以高灵敏度的检测标本中低水平的结核菌小RNA。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]附图为检测结果图。【具体实施方式】
[0015]基因芯片设计及制备:
[0016]1.基因芯片设计。结核菌小RNA基因(目的基因)包括Asl726、Asl890、Aspks、F6、Asdes、G2、C8、Bll和B55基因，前述基因为现有技术。基因芯片包括9组与基因相关的探针序列，每组探针序列与结核菌小RNA的1个基因序列互补，基因芯片还包括1个用于定量的阳性对照基因U6和2个无关序列作为阴性对照。
[0017]2.基因芯片制备。根据目的基因的序列设计探针，每组探针序列具有4-8个探针，长度14-50bp，送试剂公司合成，每种探针20D。
[0018]将探针溶于Tiris-EDTA缓冲液中，终浓度为100 μ M。
[0019]将1OOuL探针与300uL的0.2M的PBS缓冲液混合，室温震荡混匀，以备点样。
[0020]将设计好的探针通过接触式点样点载到尼龙膜、树脂、硝酸纤维素、硅片或玻璃材质的固相载体材料上，室温干燥备用。
[0021]用基因芯片检测方法对临床标本中结核菌的小RNA进行检测:
[0022]获取临床标本:采集患者外周血3-5毫升，1000-1500转/分，水平离心10分钟。小心吸取上层血浆200微升至无菌1.5毫升离心管中。其他液体样本经13000转/分，离心10分钟，小心吸取上层液体200微升至无菌1.5毫升离心管中。
[0023]步骤一:提取临床标本的总RNA。
[0024]200微升临床标本中，加入500微升酚胍RNA提取液，充分混匀，室温静置5分钟。加入300微升氯仿，混匀后12000转/分离心10分钟。小心吸取上层澄清液体至一无菌2毫升离心管中。加入900微升丙酮，混匀后用硅胶膜吸附。蛋白洗液冲洗一次，100%乙醇和80 %乙醇依次冲洗一次，待乙醇挥发后，用TE或去离子水洗脱RNA，收集与无菌1.5毫升离心管中，即为临床标本中的总RNA。
[0025]步骤二:以步骤一中提取的总RNA为模板逆转录合成cDNA，并标记。
[0026]反应体系:总RNA取10微升，9碱基随即引物1微升，1OmM的dNTP1微升，2.5mM的Cy3-dUTPl微升，逆转录酶100单位，5倍浓缩反应缓冲液4微升，0.1M 二硫苏糖醇1微升，去尚子水补充体积到20微升。
[0027]反应条件:50°C—小时，75°C 15分钟后，低温保存，即为Cy3标记的cDNA。
[0028]步骤三:用基因芯片对步骤二中合成的标记cDNA进行检测。
[0029]取20微升标记cDNA，加入20微升2倍杂交缓冲液，65°C杂交过夜。室温洗涤基因芯片3次，每次1分钟。芯片扫描，以100%和10%功率各扫描一次，经数据处理软件分析后，得到杂交图。如附图所示，U6为定量阳性对照基因的对应结果、I为目的基因的对应结果、2为无关序列的对应结果、3为正常人的基因芯片检测结果、4为结核菌感染者的基因芯片检测结果。
【权利要求】
1.一种从临床标本中检测结核菌感染的基因芯片检测方法，其特征在于:用基因芯片检测方法对临床标本中结核菌的小RNA进行检测。
2.根据权利要求1所述的从临床标本中检测结核菌感染的基因芯片检测方法，其特征在于: 步骤一:提取临床标本中的总RNA ； 步骤二:以步骤一中提取的总RNA为模板逆转录合成cDNA，并标记； 步骤三:用基因芯片对步骤二中合成的标记cDNA进行检测。
3.根据权利要求2所述的从临床标本中检测结核菌感染的基因芯片检测方法，其特征在于:步骤三中的具体检测方法为，取20微升步骤二中合成的标记cDNA，加入20微升2倍杂交缓冲液，65°C杂交过夜；室温洗涤基因芯片3次，每次I分钟；基因芯片扫描，以100%和10%功率各扫描一次，经数据处理软件分析后，得到杂交图。
4.根据权利要求1至3任何一项所述的从临床标本中检测结核菌感染的基因芯片检测方法，其特征在于:基因芯片包括与结核菌小RNA基因相关的探针序列、用于定量的阳性对照基因和用于阴性对照的基因。
5.根据权利要求4所述的从临床标本中检测结核菌感染的基因芯片检测方法，其特征在于:基因芯片具有9组探针序列，每组探针序列与结核囷小RNA的I个基因互补，每组探针序列具有4-8个探 针。
【文档编号】C12Q1/68GK103571940SQ201310068058
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年2月25日 优先权日:2013年2月25日
【发明者】张凤民, 李玉军, 付英梅, 翟爱霞, 赵吉子, 李辉 申请人:哈尔滨医科大学