抗原嵌合体、抗原组合物、疫苗及其制备方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种抗原嵌合体，包括：抗原与能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体的融合蛋白，和所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体，其中，所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体选自霍乱毒素B亚单位(CTB)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)中的一种，所述多聚体为五聚体，而且在所述嵌合体中所述融合蛋白与所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体的摩尔比为1:4。本发明利用黏膜免疫佐剂蛋白质能形成五聚体的特性，形成嵌合结构，从而形成效价更高的抗原。同时，利用黏膜免疫佐剂蛋白质增强免疫的作用，起到增强抗原免疫原性的效果。另外，本发明的重组抗原构成的嵌合蛋白抗原刺激黏膜产生分泌型IgA，诱导黏膜免疫产生。
【专利说明】抗原嵌合体、抗原组合物、疫苗及其制备方法和试剂盒
【技术领域】
[0001]本申请涉及免疫领域，特别是用于黏膜免疫的抗原、疫苗及其制备方法和试剂盒。【背景技术】
[0002]黏膜免疫系统是广泛分布于呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道黏膜下及一些外分泌腺处的淋巴组织，是执行局部特异性免疫功能的主要场所。
[0003]由于95%以上的机体相关感染发生在黏膜部位或经由黏膜入侵机体，因此黏膜是病原体侵入体内的最大门户。当前对动物生命与健康危害极大的以及难以防治的重要传染病，如流感、结核、鼻疽、沙门氏菌病等都属于由黏膜入侵或与黏膜相关的疾病，且由此引起的黏膜损伤及黏膜免疫功能的紊乱，常常成为机会性病原菌感染，甚至肿瘤发生的重要机制。
[0004]黏膜免疫系统是机体抵抗病原体入侵的第一道免疫屏障，具有独特结构和功能的独立免疫体系，对于防治病原体的定植和侵入有着积极的意义。有别于传统的系统免疫系统，黏膜免疫系统是大量免疫细胞和免疫分子弥散在黏膜上皮内或黏膜下固有层(弥散淋巴组织)，或由单个或多个淋巴滤泡聚集成的黏膜相关淋巴组织，机体50%以上的淋巴组织和80%以上的免疫细胞集中于黏膜免疫系统。并且黏膜分泌物中的抗体以分泌型IgA和SlgM抗体为主。黏膜免疫系统按功能不同可分为两个部位:诱导部位和效应部位。在诱导部位和效应部位间，主要通过淋巴细胞归巢发生联系。黏膜免疫系统主要功能是对黏膜表面吸入或摄入的大量种类繁多的抗原进行识别并做出反应。既可对大量无害抗原下调免疫反应或产生耐受,也可对有害抗原或病原体产生高效体液和细胞免疫,进行有效免疫排斥或清除。
[0005]黏膜免疫理论上是预防经黏膜感染产生致病作用病原体最为有效的免疫途径，因为通过其它途径免疫时，疫苗难以诱导产生明显的黏膜免疫反应。然而，迄今为止已获批准或正在临床研究中的疫苗，绝大多数却仍旧采用的是注射途径免疫，仅有少数为黏膜途径免疫。究其原因，困扰黏膜免疫疫苗产品开发的主要困难除了局部黏膜免疫特异性抗体检测的困难外，更为重要的是因为机体的宿主防御作用，黏膜免疫无法如注射途径免疫时能准确的控制进入机体的抗原水平。抗原通过口服或者局部给药达到黏膜表面后，将经历黏膜分泌液稀释、粘液凝胶吸附、蛋白酶/核酸酶水解以及被内膜屏障清除，因此只有极少数的抗原能通过黏膜进入体内，发挥有效的黏膜免疫反应。一般，水溶性以及无黏膜作用的抗原黏膜摄取率低，并且部分可能会在肠内产生免疫耐受现象。解决黏膜免疫摄取率低最为有效的方法是通过对天然黏膜病原体的特征模拟，以及应用有效的黏膜佐剂，增强与机体黏膜表面结合水平(最好能选择性的粘附于M细胞)。目前仍然需要更为有效的黏膜免疫疫苗。
【发明内容】
[0006] 为了增强用于黏膜免疫抗原的免疫原性，本发明提供了一种抗原嵌合体，其包括:抗原与能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体的融合蛋白，和所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体，其中，所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体选自霍乱毒素B亚单位(CTB)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)中的一种，所述多聚体为五聚体，并且在所述嵌合体中所述融合蛋白与所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体的摩尔比为1:4，其中所述抗原嵌合体稳定存在的PH大于7.0,优选pH为8.0。CTB和LTB都是非常有效的黏膜免疫佐剂，而且都能够形成稳定的五聚体，利用这一性质制备的抗原嵌合体，不但可保持其黏膜免疫佐剂性质，还增大了抗原体积，易于被抗原递呈细胞(antigenpresenting cell,APC)摄取,有利于进一步促进黏膜免疫和系统免疫的激发。并且,嵌合体的稳定性与其PH值密切相关，在本发明中，所述嵌合体稳定存在的PH大于7.0，优选pH为8.0。而此条件下的嵌合体，特别是CTB形成五聚体的嵌合体，能够最有效地增强黏膜免疫效果。
[0007]在本发明一个实施方式中，所述的抗原嵌合体中的CTB和LTB为其天然组成结构或其能够形成五聚体的突变体。与真核表达时发生糖基化修饰的CTB和LTB相比，通过原核表达载体表达的具有天然结构的CTB和LTB及其突变体能够更加有效地激发抗原的免疫反应，发挥其佐剂的功能。
[0008]在本发明一个实施方式中，所述抗原嵌合体中所述抗原的分子量在10至IOOkD范围内，优选16kD至65kD。在IO-1OOkD范围内的抗原能够更好地保证CTB或LTB折叠成正确的构象，以易于形成稳定的五聚体。抗原分子量过小可能会受CTB或LTB影响，促使融合蛋白其自身形成聚体，从而不能正确折叠，分子量过大则可能产生位阻效应，阻碍CTB或LTB五聚体的形成。
[0009]在本发明的实施方式中，所述抗原为适用于黏膜免疫的抗原。特别是经由黏膜途径感染人体或动物体的病原菌的抗原，包括但不限于幽门螺杆菌抗原、伤寒抗原、流感HA抗原。
[0010]在本发明的一个优选实施方式中，所述幽门螺杆菌抗原选自幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)、幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A(CagA)蛋白和幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白(NAP)中的至少一种。这些抗原具较强的免疫原性，无毒性，是良好的疫苗候选抗原。
[0011]在本发明的实施方式中，所述融合蛋白包含位于所述抗原与所述黏膜免疫佐剂蛋白质单体之间的3个G4S(Gly-Ser-Ser-Ser-Ser)连接体。此柔性连接体的加入可以避免抗原蛋白质与CTB或LTB在复性折叠时的相互影响，有助于形成正确的构象。
[0012]本发明还提供了一种抗原组合物，包含如上所述的抗原嵌合体，其中所述抗原嵌合体稳定存在的PH大于7.0，优选pH为8.0。
[0013]本发明还提供了一种疫苗，包含上述抗原组合物和适用于疫苗的赋形剂。优选地，所述疫苗为口服疫苗、经鼻给药的疫苗或经直肠给药的疫苗。
[0014]本发明还提供了一种用于制备抗原组合物的试剂盒，包括表达上述融合蛋白的载体和表达上述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体的载体。优选地，其中所述载体均为原核表达载体。
[0015]本发明还提供了制备上述抗原嵌合体的方法，包括用上述试剂盒中的载体分别表达所述融合蛋白和所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体，然后通过复性方法使这两种蛋白结合形成所述嵌合体，其中所述复性方法包括将所述两种蛋白共同放置在含有尿素和DTT (或巯基乙醇)的复性液中进行复性的步骤。优选所述复性液中尿素的浓度为1.0M至2.5M。所述DTT或巯基乙醇的浓度为0.2mM至1.0mM。
[0016]本发明还提供了一种通过复性制备嵌合体的方法，所述嵌合体包含(I) 一种蛋白质与能形成多聚体的单体蛋白质的融合蛋白和(2)能形成多聚体的单体蛋白质，通过所述
(I)融合蛋白中的单体蛋白质和所述(2)单体蛋白质形成多聚体来形成嵌合体，所述方法包括:
[0017]将所述⑵能形成多聚体的单体蛋白质在含6M至9M，优选8M的尿素，且pH为3.0至4.0的缓冲液中预复性0.5至3小时，优选预复性I小时；和
[0018]将所述(I)融合蛋白和所述(2)能形成多聚体的单体蛋白质在含有1.0M至2.5M的尿素和0.2mM至1.0mM的DTT或巯基乙醇的复性液中复性形成所述嵌合体，
[0019]优选地，所述复性液的pH大于7.0，更优选所述复性液的pH为8.0。
[0020]在本发明中，我们选择在复性液中保持一定浓度的尿素和DTT (或巯基乙醇)，能够有效避免形成多聚体的单体其自身聚集成为五聚体，并且在一定PH条件下，能够促进嵌合体的形成，提高嵌合体组装的效率，有效克服了采用常规复性处理导致嵌合体组装效率较低的缺陷。该复性方法可用于形成需要形成蛋白质嵌合体的多个领域，并不限于此处所述的疫苗领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为电脑模拟的霍乱毒素(CT)立体结构图；
[0022]图2为电脑模拟的CTB五聚体立体结构图；
[0023]图3为电脑模拟的CTB-UreB融合蛋白立体结构图；
[0024]图4为电脑模拟的CTB_UreB/4CTB嵌合体蛋白的立体结构图；
[0025]图5为根据本发明的实施方式制备的PET-28a-CTB_X质粒双酶切电泳图，其中各个泳道的样品如下:M:DL10000DNA Marker ;泳道1，2，3:PET-28a-CTB-UreB双酶切；泳道4，5，6:PET-28a-CTB-CagA 双酶切；泳道 7:PET-28a-CTB_NAP 双酶切；
[0026]图6为根据本发明的实施方式制备的CTB-UreB融合蛋白的蛋白质电泳图，其中各个泳道的样品如下:M:Fermentas蛋白预染Marker ;泳道I, 2, 3, 4, 5, 6, 7:IPTG诱导后PET-28a-CTB-UreB/BL21-DE3 菌体；
[0027]图7为根据本发明的实施方式制备的CTB-CagA和CTB-NAP融合蛋白的蛋白电泳图，其中各个泳道的样品如下:M:Fermentas蛋白预染Marker ;泳道1，2, 3, 4:IPTG诱导后含 PET-28a-CTB-CagA/BL21-DE3 菌体；泳道 5，6，7，8 =IPTG 诱导后含 PET-28a-CTB_NAP/BL21-DE3 菌体；
[0028]图8为根据本发明的实施方式制备的C T B-Ure B融合蛋白纯化电泳图，其中各个泳道的样品如下:M:Fermentas蛋白预染Marker ;泳道1:SP HP峰前样品；泳道2，3: SP HP洗脱峰样品；泳道4:SP HP峰后样品；
[0029]图9A为根 据本发明的实施方式制备的C T B— U r e B /4 C T B嵌合体蛋白纯化电泳图，其中各个泳道的样品如下:M:Fermentas蛋白预染Marker ;泳道1，2, 3, 4:QHP洗脱峰；
[0030]图9B为根据本发明的实施方式制备的C T B— U r e B /4 C T B嵌合体蛋白稳定性研究结果的电泳图，其中各个泳道的样品如下=M = Fermentas蛋白预染；泳道1_7样品分别为ρΗ9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、3.0条件下处理后的样品电泳结果。
[0031]图10为根据本发明的实施方式制备的CTB-CagA融合蛋白纯化电泳图，其中各个泳道的样品如下:M:Fermentas蛋白预染Marker ;泳道1，2, 3, 4:QHP洗脱峰；
[0032]图1lA为根据本发明的实施方式制备的CTB_CagA/4CTB嵌合体蛋白纯化电泳图，其中各个泳道的样品如下:M:Fermentas蛋白预染Marker ;泳道1，2, 3:SP HP洗脱峰；
[0033]图1lB为根据本发明的实施方式制备的CTB_CagA/4CTB嵌合体蛋白稳定性研究结果的电泳图，其中各个泳道的样品如下=M = Fermentas蛋白预染；泳道1_7样品分别为ρΗ9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、3.0条件下处理后的样品电泳结果；
[0034]图12为根据本发明的实施方式制备的CTB-NAP融合蛋白纯化电泳图，其中各个泳道的样品如下:M:Fermentas蛋白预染Marker ;泳道1:包涵体(8 M尿素);泳道2,3,4:
QHP洗脱峰；
[0035]图13为根据本发明的实施方式制备的CTB-NAP/4CTB嵌合体蛋白纯化电泳图，其中各个泳道的样品如下:M:Fermentas蛋白预染Marker ;泳道1，2, 3:QHP洗脱峰；
[0036]图14为根据本发明的实施方式CTB_UreB/4CTB嵌合体蛋白免疫小鼠血清特异性IgG检测结果；
[0037]图15为根据本发明的实施方式CTB_UreB/4CTB嵌合体蛋白免疫小鼠肠黏膜特异性slgA检测结果；
[0038]图16为根据本发明的实施方式CTB_CagA/4CTB嵌合体蛋白免疫小鼠肠黏膜特异性IgG检测结果；
[0039]图17为根据本发明的实施方式CTB_CagA/4CTB嵌合体蛋白免疫小鼠肠黏膜特异性slgA检测结果；
[0040]图18为根据本发明的实施方式CTB-NAP/4CTB嵌合体蛋白免疫小鼠血清特异性IgG检测结果；
[0041]图19为根据本发明的实施方式CTB-NAP/4CTB嵌合体蛋白免疫小鼠肠黏膜特异性slgA检测结果；
[0042]图20为根据本发明的实施方式CTB_UreB/4CTB嵌合体蛋白免疫小鼠，用HPSSl攻击后其特异性血清IgG抗体检测结果图；
[0043]图21为根据本发明的实施方式CTB_UreB/4CTB嵌合体蛋白免疫小鼠，用HPSSl攻击后其特异性肠黏膜slgA抗体检测结果图；
[0044]图22为根据本发明的实施方式CTB_UreB/4CTB嵌合体蛋白免疫小鼠，用HPSSl攻击后胃组织病理切片检测结果。其中A:CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白组小鼠胃组织切片(X250) ;B:UreB组小鼠胃组织切片(X250) ;C:UreB组小鼠胃组织切片(X400)-；
[0045]图23A和23B分别为UreB_CTA2/5CTB与CTB_UreB/4CTB组装效率比较结果的电泳图，泳道I为对比例I的实验结果，泳道2为根据本发明的实施例的实验结果。
【具体实施方式】
[0046] 为了更加清楚地阐述本发明，下文将详细地说明本发明的各个优选的实施方式，以及各个实施方式的技术效果。[0047]本发明主要提供了增强免疫原性的抗原及其制备方法。一方面，其通过利用黏膜免疫佐剂加强免疫反应；另一方面，利用CTB或LTB形成五聚体的特点，提高黏膜免疫佐剂效果的同时，增大了抗原的体积，易于被APC摄取，更加有利于免疫应答的发生。另外，本发明的发明人选择在复性液中保持一定浓度的尿素和DTT (或尿素和巯基乙醇)，能够有效避免形成多聚体的单体其自身聚集成为五聚体，从而促进嵌合体的形成，提高嵌合体组装的效率。有效克服了采用常规复性处理导致嵌合体组装效率较低的缺陷。
[0048]下面从免疫佐剂的选择、抗原的选择和复性方法等几个方面更加详细地说明本发明的技术方案。
[0049]关于免疫佐剂
[0050]为了增强抗原的免疫原性，本发明选用了 CTB或LTB分别与抗原结合形成新的抗原组合物。
[0051]霍乱毒素是一种强有力的黏膜免疫佐剂，由I个A亚单位和5个B亚单位(见图1)组成。5个B亚单位以非共价结合成非常紧凑稳定的圆桶状五聚体(见图2)，B亚单位单体两侧各有一个三链反平行片层，在五聚体中彼此相邻的单体通过片层和大量的盐键相互作用，使B亚单位五聚体成为最稳定的蛋白复合物之一。CTA是霍乱毒素的活性部分，CTB无毒性，其主要功能是通过与哺乳动物小肠上皮细胞上的单唾液酸神经节苷脂(GMl)结合而使得CTA进入细胞而产生免疫反应。CTB具有很强的免疫原性，因为它除了通过与GMl结合而提高肠道对经它协助的口服疫苗的摄取率，还能特异地影响小肠黏膜细胞间的紧密联结或小带闭锁结构，增加通透性，防止口服疫苗在小肠黏膜处被消化分解，保持其抗原性，从而提高机体产生的抗体效价，使机体产生良好的免疫反应。目前认为CTB是至今为止最有效、最安全的黏膜免疫佐剂之一。 [0052]LTB也是高效的黏膜免疫佐剂。大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)为产肠毒性大肠杆菌分泌到胞周质的一种热不稳定外毒素，是由具有ADP核糖基转移酶活性的A亚单位以及与神经节苷脂结合的B亚单位组成的AB5型六聚体蛋白，A亚单位是其毒性的主要单位，B亚单位具有免疫原性和佐剂功能。LT不仅具有免疫原性，而且是一种有效的黏膜佐剂，能明显增强机体针对候选抗原的IgA和IgG反应，同时还能降低机体对这些候选抗原的免疫耐受性，诱发针对它们的长期记忆，因此LTB作为黏膜佐剂得到了广泛关注。
[0053]本发明提供了一种重组抗原组合物，包括:抗原与CTB或LTB的融合蛋白；和相应的CTB或LTB蛋白。利用5个CTB或LTB非共价键结合的特性，能够形成上述融合蛋白与另外4个相应的CTB或LTB单体的复合物的嵌合结构，从而增大了抗原的有效体积，易于被APC摄取。同时，已知CTB和LTB是强有力的免疫佐剂，能够降低机体对候选抗原的免疫耐受，从而更有效地发挥其免疫促进作用。并由于形成抗原与5个CTB或LTB的嵌合蛋白而形成了效价更高的抗原，从而增强了整个抗原组合物的免疫原性。
[0054]关于抗原
[0055]为了更好地发挥黏膜免疫的作用，优先选用经黏膜感染的病原菌的抗原，包括但不限于幽门螺杆菌抗原、伤寒抗原、流感HA抗原。利用本发明制备的抗原嵌合体，能够增强相关抗原的免疫原性，利于构建更加有效的疫苗。
[0056]下文中以幽门螺杆菌为例，详细说明和验证了本发明的技术方案和技术效果。
[0057]幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, HP)是一种是寄生于胃上皮细胞表面的革兰氏阴性微需氧菌，1983年由澳大利亚学者Warren和Marshall首先从人胃黏膜中分离出，HP能在酸性环境下定植和生存，使机体产生炎症和免疫反应，破坏胃黏膜屏障，使胃黏膜上皮细胞的凋亡增殖平衡失调。HP是人类上消化道疾病的重要致病菌，是慢性胃炎、胃溃疡及十二指肠溃疡的主要病因。1994年WHO已确认其与胃癌的发生密切相关，并将其列为一类致癌因子。HP是全球感染率最高的细菌之一，据报道，90%的亚洲人和60%的欧洲人感染HP,因此预防和治疗HP感染成为了全球关注的焦点。
[0058]目前临床上主要使用二联或三联抗生素治疗HP感染。但存在以下明显不足之处:I)耐药菌株产生；2)易复发与再感染；3)毒副作用与费用较高；4)无法达到群体防治效果，无法有效控制HP传播与感染。因此，研制疗效明确的疫苗对于预防和控制HP感染具有十分重要的意义。目前所研究的HP疫苗主要为全菌疫苗、亚单位疫苗(基因工程疫苗)、活载体疫苗和DNA疫苗。大多数研究采用HP全菌或全菌裂解物，或HP毒性蛋白如尿素酶、空泡毒素、毒素相关蛋白、中性粒细胞激活蛋白等单独或联合不同佐剂进行接种，在动物模型中均能引起保护性应答反应。
[0059]预防性疫苗是通过机体的免疫应答发生作用，因此选择有效的HP抗原免疫机体，可刺激机体产生保护性免疫应答，从而起到预防机体感染HP的作用。随着HP致病机制研究的深入以及分子生物学技术的发展-基因工程菌株的构建和运用为有效抗原的筛选提供了有利条件，同时为预防和根除HP感染迈出了关键的一步。
[0060]以幽门螺杆菌相关疫苗的制备为例，发明人优先选择了幽门螺杆菌尿素酶、幽门螺杆菌CagA蛋白和幽门螺杆菌NAP作为用于幽门螺杆菌的有效抗原。本发明应用基因生物工程技术，制备了三种HP抗原和CTB的融合蛋白(CTB-X(X = UreB, CagA, NAP))(见图3)，并利用5个CTB非共价键结合的特性，形成CTB-X (X = UreB, CagA, NAP) -4CTB的嵌合结构(见图4)，从而通过HP抗原与5个CTB的嵌合蛋白形成效价更高的抗原，并进行了相关的动物免疫原性试验验证。
[0061]尿素酶
[0062]尿素酶(Ure)在HP定植感染过程中有分解尿素、中和胃酸的作用，对HP的致病性具有重要意义，HP尿素酶既是定植因子又是毒力因子。尿素酶基因是所有HP菌株共同拥有的，其编码的蛋白具有很强的尿素酶活性，尿素酶分布于HP表面，占全菌总蛋白量的5~10%。目前发现尿素酶基因大小约为7.5kb，共有9个读码框(ORF)分别为UreA、UreB、UreC、UreD、UreE、UreF、UreG、UreH和UreI。其中UreA和UreB为尿素酶的两个结构亚单位，具有高度的保守性，是PCR检测HP感染常选择的目的基因，以及基因疫苗的侯选基因。
[0063]UreB是HP主要的外膜抗原成分，由569个氨基酸残基编码产生，是HP抗原性最强的保护性蛋白，具有无毒性、抗原性强且相对保守等特点，其在HP的致病过程中起关键作用。通过不同菌株的比较，其尿素酶B亚单位氨基酸同源性达到97.9%以上，表明HP菌株间UreB的抗原变异性极小。此外，UreB的主要活性部分位于菌体表面，其大分子量和颗粒状结构有利于黏膜免疫接种，因此尿素酶分子可以作为疫苗抗原的合理选择。同时在体内HP表面具有黏附胞质蛋白的特性，能够将自溶释放的尿素酶黏附到活菌表面，这给HP疫苗的研究又提供了一个重要的理论依据。经实验证实，通过黏膜免疫途径给予UreB蛋白疫苗，能够诱导并激发机体的保护性免疫应答，表明UreB是HP感染重要的保护性候选抗原之一，也是基因工程疫苗的首选抗原，具有显著的优势。[0064]大量的文献报道，用重组的尿素酶亚单位B(rUreB) 口服免疫预先感染了猫胃螺杆菌(Helicobacter Felis, Hf)的小鼠，结果发现免疫的小鼠不仅彻底清除了 Hf感染，而且能够预防小鼠再次感染；Kleanth0us等用rUreB加上LT作为黏膜佐剂免疫小鼠，与对照组相比结果发现:免疫组胃内尿素酶活性显著降低，且胃黏膜组织HP定量培养显示HP减少97%以上；Michetti等对口服不同剂量(180mg、60mg、20mg，4次/天)的尿素酶与LT(5y g)的安全性和免疫原性进行了临床实验研究，结果发现:所有的志愿者都能够耐受，且能够减少胃内HP的定植，从而减轻了胃炎的程度；Saldinger等采用rUreB结合霍乱毒素(CT)免疫感染了 Hf的BALB/c小鼠，结果发现:免疫组小鼠全部清除了 Hf ;进一步研究发现，脾脏⑶4+T细胞增生，血清中IgGl增加，同时伴随IL-4的增高，Y-干扰素的减少，从而推测rUreB可能诱导了 Th2⑶4+T细胞的增生，有助于清除HP。有学者对HP感染志愿者进行了I期临床实验，用UreB结合LT免疫后，同样发现HP感染的密度显著减少；Lee等对非人灵长类动物进行的类似研究也表明，通过减少胃内HP的密度有助于减轻胃炎的程度。然而Solnick等报道用尿素酶口服和肌肉注射免疫恒河猴，而后进行HP攻击试验，结果发现:UreB虽然能够诱导体液免疫，但是所有给予HP攻击的恒河猴都感染了 HP，而且细菌密度在实验组和对照组中没有统计学差异。上述结果显示目前的UreB相关的HP疫苗还不够完善，有待于进一步研究。 [0065]CagA 蛋白
[0066]CagA基因也称为细胞毒素相关基因,其表达广物为CagA蛋白。作为细菌分泌的一种毒素，它由IV型分泌系统Cag致病岛(pathogenecityisland, PAI)从细菌转运到宿主细胞中被磷酸化，参与宿主细胞的信号转导及引起细胞骨架结构的重排。研究表明，cagA阳性HP为毒力菌株，与萎缩性胃炎、胃癌与消化道溃疡等常见的消化道疾病密切相关，90%以上的HP临床分离菌株cagA呈阳性表达。具有CagA基因的HP几乎都表达CagA蛋白，并产生可测的抗体反应。据文献报道CagA阳性菌株能够直接或间接(通过NF-κΒ)诱导胃上皮细胞分泌IL-8，而IL-8在中性粒细胞趋化和激活过程中起重要作用，可导致胃黏膜的损伤。动物实验发现CagA基因和CagA蛋白与胃炎、消化性溃瘍，尤其是胃癌的发生有良好的相关性。Marchetti等用重组CagA免疫HP小鼠感染模型，证实能产生诱导保护性免疫反应，保护率达到了 70%。Crabtree等应用重组CagA作为抗原，经胃免疫长期感染HP的小鼠，结果成功清除了 HP，且有效保护了小鼠免遭HP的再次感染。提示CagA作为HP疫苗保护性抗原具有较高的可行性，但这种抗原产生的保护作用仅局限于产生CagA的菌株有效，对不产生CagA的菌株无保护作用。可见，目前针对CagA蛋白也尚无满意的疫苗。
[0067]NAP
[0068]Evans等在HP的水溶性抽提物中发现一种NAP，它能够募集并活化嗜中性粒细胞，促进中性粒细胞对胃上皮细胞的黏附，激活中性粒细胞释放反应性氧代谢物，而引起胃黏膜炎症病变。
[0069]NAP高度保守，临床研究发现60%的HP感染者血清中存在NAP特异抗体。NAP是一种铁蛋白，编码它的NAP基因几乎在所有HP中可检测到，但是在体外表达的NAP其活性存在很大差异。它能够通过⑶Ila/⑶18和⑶Ilb/⑶18与内皮细胞间粘附分子(ICAM-1)相互作用，而使白细胞黏附内皮细胞；选择性地与中性粒细胞的酸性糖鞘脂相结合而调节白细胞的功能；与粘蛋白相结合为HP定植于胃黏膜上皮细胞埋下了伏笔，因此NAP在其黏附和致病过程中起重要作用。Satin等采用纯化重组的NAP 口服免疫了 10只小鼠，结果8只小鼠获得了保护性免疫。提示NAP可作为有效的保护性抗原用于HP感染的疫苗防治。[0070] 在本发明优选的实施方式中，本发明提供了一种重组幽门螺杆菌抗原组合物，包括幽门螺杆菌抗原与CTB的融合蛋白和CTB蛋白。借助CTB本身能够形成五聚体的性质，增大抗原的体积，易于被APC摄取。另外，CTB是良好的免疫佐剂。因此，本发明的重组幽门螺杆菌抗原组合物能够有效增强幽门螺杆菌抗原的免疫原性，利于构建更加有效的疫苗。[0071 ] 在进一步的实施方式中，所述幽门螺杆菌抗原选自幽门螺杆菌UreB蛋白、幽门螺杆菌CagA蛋白和幽门螺杆菌NAP中的至少一种。这几种抗原均是目前已知的幽门螺杆菌抗原中无毒性、抗原性强而且相对保守的抗原，更加适合用于疫苗。
[0072]抗原与免疫佐剂的结合方式的选择
[0073]常规免疫佐剂的使用一般是通过与抗原的直接混合，然后与抗原同时给药以激发机体的免疫反应，但是其增强抗原免疫原性的效果不理想。本发明通过制备抗原与黏膜免疫佐剂蛋白质单体的融合蛋白，再将其与这种能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体通过非共价结合形成嵌合蛋白，不但可保持其黏膜免疫佐剂性质，还可增大了抗原体积，更易于被抗原递呈细胞摄取。
[0074]对于融合蛋白的制备，本发明中在抗原和CTB(或LTB)的蛋白之间加入柔性连接体，以使得蛋白融合后抗原和CTB(或LTB)各自的折叠不会受到影响，从而分别形成正确的构象。在一个实施方式中，本发明选择了 3个G4S的连接体。但是，本发明中并不限于用此种连接体，其余连接体，比如螺旋形式的连接体(linker)肽(A(EAAAK)nA)以及葡萄糖球菌蛋白A(PA)等也可用于本发明中。
[0075]进一步地，在保证了融合蛋白两个部分，尤其是CTB (或LTB)构象的基础上，有利于五聚体的正确形成和 形成五聚体的效率。
[0076]嵌合体的制备方法
[0077]本发明还提供了一种试剂盒，包括表达上述抗原与CTB(或LTB)的融合蛋白的载体和表达相应黏膜免疫佐剂单体蛋白(CTB或LTB)蛋白的载体。如本领域普通技术人员所公知，除了目的蛋白之外，所述表达载体中还应包括表达目的蛋白质所必需的元件，例如启动子、终止子、可选的标记基因等。
[0078]所述表达载体优选是原核表达载体，例如，pET系列等原核载体。使用原核表达载体制备目的蛋白的方法和试剂为本领域所公知，可参见本领域常用工具书，例如冷泉港实验室编译的《分子克隆实验指南》((美)萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，北京，科学出版社出版)、《细胞实验指南》((美)D.L.斯佩克特等著，黄培堂等译，北京，科学出版社出版)等。
[0079]对于嵌合体的制备，一直以来都属于一个技术难题。如何在与融合蛋白嵌合之前避免单体自身形成五聚体，是影响嵌合体收率的关键。一般情况下，原核表达蛋白后大部分会形成包涵体，需要经过洗涤之后用尿素溶液溶解包涵体。被尿素溶液所溶解的蛋白质基本属于变性状态，很难产生其天然构象。而常规的复性过程就是逐步除去尿素的过程，以使其逐步重折叠形成正确的构象。但是，对于能够形成多聚体的单体蛋白质，其去除尿素的过程中，很容易自发形成多聚体，而不是跟融合蛋白中的单体蛋白质形成多聚体。因此，常规方法制备嵌合体时产率会非常低。
[0080]本发明的发明人选择在复性液中保持一定浓度的尿素和DTT (或尿素和巯基乙醇)，能够有效避免形成多聚体的单体其自身聚集成为五聚体，促进嵌合体的形成，提高嵌合体组装的效率。有效克服了采用常规复性处理导致嵌合体组装效率较低的缺陷。
[0081]本发明提供了一种通过复性制备嵌合体的方法，所述嵌合体包含(I) 一种蛋白质与能形成多聚体的单体蛋白质的融合蛋白和(2)能形成多聚体的单体蛋白质，通过所述
(1)融合蛋白中的单体蛋白质和所述(2)单体蛋白质形成多聚体来形成嵌合体，所述方法包括:将所述(2)能形成多聚体的单体蛋白质在含6M至9M，优选8M的尿素，且pH为3.0至4.0的缓冲液中预复性0.5至3小时，优选预复性I小时；和将所述(I)融合蛋白和所述
(2)能形成多聚体的单体蛋白质在含有1.0M至2.5M的尿素和0.2mM至1.0mM的DTT或巯基乙醇复性液中复性形成所述嵌合体。
[0082]不同于一般的复性液，本发明采用含一定浓度尿素和还原剂的复性液，使融合蛋白和单体蛋白质缓慢复性过程中组合成为所需的嵌合体。在优选过程中通过在一定pH条件下进行预复性，然后在还原剂存在下，在浓度稍低的尿素溶液中缓慢复性，意外地得到了高收率的嵌合体。
[0083]而对于大规模生产来说，收率的高低直接影响了生产的成本，更直接影响了大规模生产的可能性。采用本发明的方法，嵌合体的收率可以达到实现大规模生产的水平。
[0084]下文通过具体的实施例详细说明本发明的优选实施方式。
[0085]1.抗原的制备方法
[0086]实施例1CTB-UreB/4CTB 制备:
[0087]1.1.1 重组工程菌 PET-28a-CTB-UreB/BL21_DE3 的构建
[0088]1.1.1.1 融合基因 CTB-UreB 的构建:
[0089]UreB DNA序列来自HP菌株MEL-HP27，CTB DNA序列来自霍乱弧菌0395株，在融合DNA片段间引入富含甘氨酸/丝氨酸具有柔性功能的(G4S)3连接体(linker)序列(用斜体下划线表示)，并合成CTB-UreB基因密码子。
[0090]基因序列为SEQ ID N0.1:
[0091]ATGACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACAACACACA 50
[0092]AATACATACGCTAAATGATAAGATATTTTCGTATACAGAATCTCTAGCTG 100
[0093]GAAAAAGAGAGATGGCTATCATTACTTTTAAGAATGGTGCAACTTTTCAA 150
[0094]GTAGAAGTACCAGGTAGTCAACATATAGATTCACAAAAAAAAGCGATTGA 200
[0095]AAGGATGAAGGATACCCTGAGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCG 250
[0096]AAAAGTTATGTGTATGGAATAATAAAACGCCTCATGCGATTGCCGCAATT 300
[0097]AGTATGGCAAAT 'SGTeGTeeTeGTTCTGGTGeTeeTGGTTCTeGTGGTGe 350
[0098]TGGTTCT ATGAAAAAGATTAGCAGAAAAGAATATGTTTCTATGTATGGCC 400
[0099]CTACTACAGGCGATAAAGTGAGATTGGGCGATACAGACTTGATCGCTGAA450
[0100]GTAGAACATGACTACACCATTTATGGCGAAGAGCTTAAATTCGGTGGCGG500
[0101]TAAAACTTTGAGAGAAGGCATGAGCCAATCCAACAACCCTAGCAAAGAAG550
[0102]AACTGGATTTAATCATCACTAACGCTTTAATCGTGGATTACACCGGTATT600
[0103]TATAAAGCGGATATTGGTATTAAAGATGGCAAAATCGCTGGCATTGGCAA650
[0104]AGGCGGCAACAAAGACATGCAAGATGGCGTTAAAAACAATCTTAGCGTGG700
[0105]GTCCTGCTACTGAAGCCTTAGCTGGTGAAGGTTTGATCGTAACTGCTGGT750
【权利要求】
1.一种抗原嵌合体，包括: 抗原与能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体的融合蛋白，和 所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体，其中， 所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体选自霍乱毒素B亚单位和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位中的一种， 所述多聚体为五聚体，而且 在所述嵌合体中所述融合蛋白与所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体的摩尔比为1:4, 其中所述抗原嵌合体稳定存在的PH大于7.0,优选pH为8.0。
2.如权利要求1所述的抗原嵌合体，其中所述霍乱毒素B亚单位和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位为其天然组成结构或其能够形成五聚体结构的突变体。
3.如权利要求1或2所述的抗原嵌合体，其中所述抗原的分子量在10至IOOkD范围内，优选16kD至65kD。
4.如权利要求1至3中任一项所述的抗原嵌合体，其中所述抗原为适用于黏膜免疫的抗原。
5.如权利要求1至4中任一项所述的抗原嵌合体，其中所述抗原选自经由黏膜途径感染人体或动物体的病原菌的抗原，包括但不限于幽门螺杆菌抗原、伤寒抗原、流感血凝素(HA)抗原。
6.如权利要求5所述的抗原嵌合体，其中所述幽门螺杆菌抗原选自幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)、幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A(CagA)蛋白和幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白(NAP)中的至少一种。
7.如权利要求1至6中任一项所述的抗原嵌合体，其中所述融合蛋白包含位于所述抗原与所述黏膜免疫佐剂蛋白质单体之间的3个G4S连接体。
8.—种抗原组合物，包含如权利要求1至7中任一项所述的抗原嵌合体，其中所述抗原嵌合体稳定存在的PH大于7.0，优选pH为8.0。
9.一种疫苗，包含如权利要求8所述的抗原组合物和适用于疫苗的赋形剂。
10.如权利要求9所述的疫苗，为口服疫苗、经鼻给药的疫苗或经直肠给药的疫苗。
11.一种用于制备抗原组合物的试剂盒，包括表达如权利要求1-7中任一项中所定义的融合蛋白的载体和表达如权利要求1-7中任一项中所定义的能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体的载体。
12.如权利要求11所述的试剂盒,其中所述载体均为原核表达载体。
13.制备如权利要求1至7中任一项所述抗原嵌合体的方法，包括用权利要求10所述的试剂盒中的载体分别表达所述融合蛋白和所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体，然后通过复性方法使这两种蛋白结合形成所述嵌合体，其中所述复性方法包括将所述两种蛋白共同放置在含有尿素和二硫苏糖醇(DTT)或尿素和巯基乙醇的复性液中进行复性的步骤，优选所述复性液的PH大于7.0，更优选所述复性液的pH为8.0。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述复性液中尿素的浓度为1.0M至2.5M。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述DTT或巯基乙醇的浓度为0.2mM至.1.0mM0
16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中在所述复性液中进行复性步骤之前，先将所述蛋白质单体在含6M至9M，优选8M的尿素，且pH为3.0至4.0的缓冲液中预复性0.5至3小时，优选预复性I小时。
17.—种通过复性制备嵌合体的方法，所述嵌合体包含(I) 一种蛋白质与能形成多聚体的单体蛋白质的融合蛋白和(2)能形成多聚体的单体蛋白质，通过所述(I)融合蛋白中的单体蛋白质和所述(2)单体蛋白质形成多聚体来形成嵌合体，所述方法包括: 将所述⑵能形成多聚体的单体蛋白质在含6M至9M，优选8M的尿素，且pH为3.0至.4.0的缓冲液中预复性0.5至3小时，优选预复性I小时；和 将所述(I)融合蛋白和所述(2)能形成多聚体的单体蛋白质在含有1.0M至2.5M的尿素和0.2mM至1.0mM的DTT或巯基乙醇的复性液中复性形成所述嵌合体，优选所述复性液的PH大于7.0，更 优选所述复性液的pH为8.0。
【文档编号】A61P31/16GK103990121SQ201410217707
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月20日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】李克英, 耿雨红 申请人:上海联合赛尔生物工程有限公司