专利名称：霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体及抗原捕获elisa试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学领域，具体涉及一种霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，杂交瘤细胞株及抗原捕获ELISA试剂盒。
背景技术：
霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio cholera，VC)引起的烈性肠道传染病，该病起病急、传播快、涉及范围广，属国际检疫传染病，在我国被列为甲类传染病之一，是主要食源性致病微生物之一，时时威胁着人类并给人类带来危害。人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者，主要通过污染的水源或饮食经口传染。在一定条件下，霍乱弧菌进入小肠后，依靠鞭毛的运动，穿过粘膜表面的粘液层，通过菌毛作用粘附于肠壁上皮细胞上，在肠粘膜表面迅速繁殖，经过短暂的潜伏期后便急骤发病。该菌不侵入肠上皮细胞和肠腺，也不侵入血液，在局部繁殖和产生霍乱肠毒素，此毒素作用于粘膜上皮细胞与肠腺使肠液过度分泌，从而患者出现上吐下泻，泻出物呈“米泔水样”并含大量弧菌，此为本病典型的特征。 目前检测食品中致病微生物的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定方法，该方法所需时间长，一般情况下需要5-7天，有时达到10-15天，很难满足快速鉴定的需要；近几年发展起来的PCR技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，增菌液中往往含有PCR抑制剂，从而影响PCR的扩增结果；以抗体为基础的免疫学检测已经成为食品中有毒有害物质及有害生物检测不可或缺的重要技术手段。目前已经发展了多种特异性免疫学检测技术，如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、时间分辨荧光免疫分析(TrFIA)、化学发光免疫分析(CIA)、生物发光免疫分析(BIA)、免疫沉淀反应、免疫凝集反应、ELISA检测试剂盒、免疫胶体金试纸条、免疫乳胶检测试剂等。其中ELISA检测试剂盒、免疫胶体金试纸条等多种以抗体为基础的免疫学检测技术，以其简便、快速、灵敏、准确、实用的特点一直是国境检验检疫安全侦检技术体系中的重要组成，已经成为有害生物及有毒有害物质检测不可或缺的重要技术手段。快速的ELISA方法检测，作为筛选方法具有快速、灵敏的特点，是受到广泛欢迎的筛选方法，但是所使用的试剂盒均来自国外，价格昂贵，而且需要配备其专门的仪器。因而，研究开发具有自主知识产权的食源性致病微生物的抗体,是开发拥有自主知识产权的ELISA检测方法、胶体金检测方法、基于免疫反应为基础的免疫纳米磁珠富集方法的基础。鞭毛是霍乱弧菌的一个重要毒力因子，具有特异性的鞭毛抗原(H抗原)，常作为血清学鉴定的依据之一。细菌的鞭毛具有很重要的理化特性，它的免疫原性在生物学和致病机制研究中具有重要的意义。例如，鞭毛蛋白被认为是一种保护性的抗原用于致病菌的疫苗研究，有研究结果表明，鞭毛蛋白可作为天然免疫应答的诱导剂，诱导产生的天然免疫应答可帮助建立针对外源抗原的获得性免疫应答，从而显示出鞭毛蛋白作为免疫佐剂的特性。迄今用于霍乱特异性诊断的血清和预防用菌苗均为多克隆抗体和复杂的菌体抗原,难以对菌体抗原成分做进一步分析。霍乱弧菌血清群超过200个，但只有01群及0139群引起霍乱大流行。Ol群霍乱弧菌分为稻叶、小川和彦岛(少见)3种血清型。各型弧菌产生类似的肠毒素，临床表现也类似。每一次霍乱流行都会有一个特定的优势型，且流行趋势是在不断变化的。0139血清型霍乱是近10年来肆虐于南亚，并波及亚、欧、美、非、澳五大洲的数十个国家和地区的一种新发现的烈性传染病，目前已成为全球霍乱的优势菌群。目前已研制出专门 针对01群或0139群的抗体。但是，随着环境及其他条件的变化，其他血清型的霍乱弧菌仍然有引发流行病的可能。因此，制备适用于所有血清型的霍乱弧菌的抗体具有重要的意义。在已往的霍乱弧菌单克隆抗体的制备过程中，多使用灭活的VC菌体作为抗原，而菌体的大部分蛋白为菌属共有蛋白，不具有种间特异性，导致收获的单抗很难避免弧菌菌属内的种间交叉反应。本研究选用具有种间特异性的鞭毛蛋白作为抗原，并且在阳性克隆筛选过程中排除交叉反应，制备特异性良好的VC单克隆抗体，并将其应用于制备霍乱弧菌ELISA检测试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体。该单克隆抗体可以用于检测霍乱弧菌。本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种霍乱弧菌鞭毛蛋白捕获ELISA试剂盒。为解决上述技术问题，本发明所提供的技术方案如下本发明所提供的霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No. 6754的小鼠杂交瘤细胞株分泌产生。该小鼠杂交瘤细胞株已于2012年11月I日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No. 6754。保藏编号为CGMCC No. 6754的小鼠杂交瘤细胞株也属于本发明的保护范围。本发明还提供了一种霍乱弧菌鞭毛蛋白捕获ELISA试剂盒，该试剂盒包括已包被霍乱弧菌鞭毛蛋白多克隆抗体的固相载体和酶标记的本发明所述的单克隆抗体。所述酶优选为辣根过氧化酶。进一步地，为了便于检测，本发明试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，以及ELISA反应所需的酶联免疫检测试剂。其中，所述阳性对照为霍乱弧菌鞭毛蛋白，所述阴性对照为未免疫霍乱弧菌鞭毛蛋白的正常小鼠血清或其稀释液。所述酶联免疫检测试齐U，均为常规的酶联免疫检测试剂，包括但不限于，酶的底物反应液、洗涤液和反应终止液。本发明具有以下优点和效果首先，本发明通过特异性实验，证明本发明的霍乱弧菌单克隆抗体显示出良好的特异性和稳定性。在特异性实验中检测了包括41株霍乱弧菌、I株01群霍乱弧菌、I株0139群霍乱弧菌、50株副溶血性弧菌和28株非霍乱弧菌标准菌株，其中包括大部分常见的病原菌。从实验结果可知，本发明的霍乱弧菌单克隆抗体的特异性验证广度远大于其他霍乱弧菌单克隆抗体的验证，并且对不同血清型的霍乱弧菌检测均适用。其次，敏感性实验结果表明本发明试剂盒的检测敏感性为IO3/孔。目前在国内外已商业化生产的试剂盒，其灵敏度基本在IO4/孔左右，因此，本发明的检测灵敏度高于其他试剂盒检测的平均水平，具有理想的应用前景。与微生物传统检测方法相比，本发明的ELISA检测方法与其检测灵敏度相当，但将检测周期从7 10天缩短至f 2天，并且具有快速、高效等优点。
图1.霍乱弧菌鞭毛蛋白的SDS-PAGE图；泳道1:霍乱弧菌鞭毛蛋白r ;泳道2 :蛋白 Marker ；图2.霍乱弧菌鞭毛蛋白电镜；图3. mAb 的 SDS-PAGE 图；泳道1:蛋白 Marker ;泳道 2 :mAb。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备 1.菌体培养及鞭毛蛋白的提取霍乱弧菌(Vibrio cholera) (VC-75，实验室分离保存)接种于TlNl培养基(购自北京陆桥技术有限责任公司，货号CM168)，36°C活化24h ;挑取单菌落接种于含2%NaCl的TSA培养基(购自北京陆桥技术有限责任公司，货号CM417)生长18 24h ;用无菌棉签将生长良好的菌落均匀涂布在TSA (2%NaCl)培养基上，36°C培养18±2h。次日用无菌棉签刮下菌体悬浮于预冷的O. 15M NaCl溶液中，冰浴15 30min，IOOOrpm匀浆45sec，立即置于冰上IOmin0匀浆液4°C条件下IOOOOrpm离心IOmin ;取上清液4°C条件下16000rpm离心2h，弃上清，沉淀重悬于 TET (IOmM Tris, 2mM EDTA，pH 8. O, l%Triton X-100)缓冲液中。离心过程重复3次。操作过程保持低温下进行。最后留取沉淀，溶于少量Tris-EDTA(0.1M Tris,
O.1mM EDTA, pH 7. 8) buffer 中，4°C保存备用。 2. SDS-PAGE 及电镜鉴定提取的鞭毛蛋白进行SDS-PAGE电泳。5%积层胶，10%分离胶，120V电压，电泳至胶底部。凝胶用考马斯亮蓝法染色，脱色后凝胶成像分析系统观察结果。见图1。霍乱弧菌鞭毛蛋白的电镜鉴定见图2。3.动物的免疫(I) BALB/c小鼠的免疫以鞭毛蛋白为抗原，免疫61周龄的BALB/c小鼠5只，设2只不作免疫小鼠做阴性对照。初次免疫抗原加等量福氏完全佐剂充分乳化后，皮下注射免疫小鼠，40 μ g/小鼠。以后每隔两周用相同剂量抗原与福氏不完全佐剂充分乳化后免疫。第五次免疫:Γ5天后尾静脉采血，检测抗血清效价。(2)新西兰纯种兔的免疫用霍乱弧菌鞭毛蛋白免疫雌性新西兰兔O. 5mg/只。每隔两周免疫一次，共免疫5次。五免后3-5天进行心脏大量取血，置37°C I小时，然后放冰箱4°C过夜，隔天取血清纯化得霍乱弧菌鞭毛蛋白多克隆抗体，_20°C冻存备用。4.抗血清效价抗血清效价采用间接ELISA方法用PBS稀释VC抗原浓度至I μ g/mL,加入96孔板，100 μ L/孔，4°C过夜。用PBST洗板3次。2%的牛血清白蛋白溶于PBS溶液中，200 μ L/孔，37°C封闭lh。用PBST洗板。5只免疫鼠血清用PBS梯度稀释加入对应孔中，100 μ L/孔，空白对照为PBS溶液，阴性对照为未免疫小鼠血清37°C包被45min后洗板。HRP标记的羊抗鼠以1:2500倍数稀释加入，10(^17孔，371包被401^11后洗板。每孔加新鲜配制的底物溶液100 μ L，37°C作用15min后每孔加入2M浓硫酸50 μ L，用酶联检测仪测定0D450nm值，读数并观察结果。选择效价高且满足？州值> 2.0的小鼠，一周后加强免疫，3飞天内取小鼠脾细胞进行细胞融合。5. P2/0骨髓瘤细胞的复苏和培养提前对冻存的骨髓瘤细胞(SP2/0)进行复苏，将_80°C冷冻冰箱中冻存的骨髓瘤细胞快速取出后，置于38°C水浴中轻微晃动使其迅速融化，注意冻存管口不能碰到水，以免污染，然后将细胞转移到含6 IOml RPM1-1640完全培养基(含10%小牛血清的RPM1-1640培养基，小牛血清购自Hyclone，货号SH30541. 03)的细胞培养瓶中，放入37°C，5%C02培养箱中培养4飞个小时，待细胞全部贴壁生长时，及时换液，以后每隔2 3天传代一次，并调整细胞使其处于最适生长密度，当细胞达到一定活性，计数，准备进行融合。细胞融合前f 2天对细胞进行I比4传代，用新鲜培养基调整每瓶细胞浓度为f2X 105/ml，一般f 2天即可获得对数生长期的细胞。 6.饲养细胞的制备(I)将BALB/c小鼠拉颈处死，自来水冲洗后，完全浸泡于75%酒精中lOmin，移入超净工作台的平皿中，使其腹部朝上。(2)用镊子提起小鼠胸腹部皮肤，用剪刀剪开一小口，用两把镊子将皮肤撕开一较大的口，然后重新换用新的镊子提起小鼠腹膜，剪开，找到小鼠的胸腺，用镊子，小剪刀小心将胸腺取出，放在一次性平皿中，细心剥去胸腺上附带的脂肪、结缔组织等，加入RPM1-1640培养基(购自Hyclone，货号SH30809. 01) 5ml，研磨胸腺，过筛，将胸腺细胞悬液加入离心管中，IOOOrpm离心lOmin，弃上清，离心洗涤两次。(3)用5ml HAT培养液轻轻将细胞重悬并混和均匀，计数，补加HAT培养液至细胞浓度为I 2 X105/ml。(4)将细胞悬液滴入96孔细胞培养板内，100 μ I/孔(两滴)，放入37°C、5%C02培养箱中培养。7.免疫脾细胞悬液的制备(I)加强免疫3飞天后，选血清效价较高的BALB/c小鼠，摘除眼球，放血，收集并分离血清作为抗体检测的阴性对照。(2)断颈处死，自来水冲洗后浸泡于75%酒精中lOmin，取出小鼠放在无菌超净工作台的平皿中，使其腹部朝上。 (3)用镊子提起小鼠胸腹部皮肤，用剪刀剪开一小口，再用两把镊子将皮肤撕开一较大的口，然后重新换用新的镊子提起小鼠腹膜，剪开，找到小鼠的脾脏，小心将脾脏取出，放在一次性平皿中，细心去除脂肪和结缔组织。(4)用RPM1-1640洗液冲洗后，加入新的RPM1-1640洗液，用注射器针芯研磨，然后过筛，使脾细胞尽可能都通过网孔挤压到溶液中，将脾细胞悬液移入离心管中，IOOOrpm离心IOmin,弃上清,离心洗漆两次。(5)用10ml HAT培养液轻轻将脾细胞重悬，计数，备用。8SP2/0骨髓瘤细胞悬液的制备(I)取4瓶IOOml培养瓶培养好的骨髓瘤细胞(融合前一天换液，融合时细胞应处于对数生长期)，收集于50ml离心管中。(2) IOOOrpm离心5 10分钟，弃上清。(3)沉淀中加入30ml RPM1-1640洗液，轻轻重悬，混匀，同法再离心洗涤一次。(4)用IOml HAT培养液轻轻将脾细胞重悬并混和均匀，计数，备用。9细胞融合
(I)轻轻吹下培养好的骨髓瘤细胞，将其转移到50mL离心管中，1000r/min离心7min,弃上清，IOmL培养基洗液悬浮,计数。(2)将含IX IO8个脾细胞的悬液和含2X IO7个骨髓瘤细胞的悬液混合于一支50ml的离心管内，补加培养基洗液至30ml,充分混勻。(3) IOOOrpm离心7分钟，弃去上清，清洗两次，尽量去上清。(4)用手轻轻弹离心管底，使细胞团块松散均匀呈糊状。置37°C水浴，预热5" Omin,以达到融合温度。(5)从4°C冰箱中拿出已配好的50%PEG (MW4000)、RPM1-1640洗液，放在37°C水浴中，预温备用。(6)将离心管放进含有37 40°C水的烧杯中，转动离心管，用Iml吸管吸取50%的PEG Iml,沿管壁逐滴、缓慢加入离心管，时间控制在60秒内，然后再用30秒的时间吸取细胞悬液，静置30秒，再在30秒内将细胞缓缓吹入离心管内。(7)加入预温好的RPM1-1640洗液，使PEG稀释而失去促融作用，具体方法前两分钟内加2ml,第三分钟加入3ml,最后在3min内加入20ml。(8)室温离心融合细胞，800rpm离心7min,弃上清。(9)加入HAT培养液(50X，购自Sigma，货号H0262)，轻轻吹吸、重悬沉淀细胞。(10)将融合细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔培养板内，100 μ I/孔(两滴)，然后将培养板置37°C、5%C02的培养箱中培养。10阳性克隆的筛选和克隆化培养融合后第3天开始，每天观察各孔细胞生长情况，若有污染，立即用叠氮钠处理。融合后第6d、9d用HAT培养液半量换液，HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT (50X，购自Sigma，货号H0137)培养液半量换液，以后根据细胞生长情况，f 2d换一次液，两周后改用完全培养液。待杂交瘤细胞长满孔底面积的1/10时(约IOd左右)，吸取出现克隆的孔上清用于特异性检测。采用间接ELISA法。交叉反应用副溶血性弧菌弧菌(VP)、创伤弧菌(VV)及溶藻弧菌(VA)的鞭毛蛋白为抗原，包被96孔板，测定VC抗血清与3种弧菌的交叉反应情况。用酶联检测仪测定0D450，满足P/N值> 2. O为阳性。将VC抗原包被板检测结果呈阳性，其他细菌抗原包被板检测结果呈阴性的杂交瘤细胞用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞长满孔底面积的1/10时再用同样方法检测，强阳性孔再克隆。如此反复Γ4次，直到阳性克隆率达到100%。11腹水制备与抗体鉴定对最后筛选出的阳性克隆杂交瘤细胞进行扩大培养，并且已于2012年11月I日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No. 6754。常规腹水体内诱生方法制备单抗腹水。mAb的特性鉴定=(I)Ig类和亚类的检测用小鼠mAb亚类检测试剂盒测定杂交瘤细胞培养上清中Ig的类和亚类，操作步骤按说明书上进行。(2)Western blot检测采用常用Western blot实验方法，测定腹水在1:2000稀释度下的特异性。(3)抗体纯化及效价测定腹水用Protein G Sepharose亲和层析法纯化后得到抗体,纯化后的抗体经倍比稀释后用间接ELISA法测定效价。抗体经SDS-PAGE分析纯度。纯化后抗体经SDS-PAGE电泳得到两条清晰的条带重链分子量50KDa，轻链分子量25KDa，图3所示。抗体ELISA效价结果(见表I)可以看出，稀释度为1:2187000情况下仍有很强的阳性反应。表1. mAb 的 ELISA 效价。
权利要求
1.霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCCNo. 6754的杂交瘤细胞株分泌产生。
2.分泌产生霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.6754。
3.一种霍乱弧菌鞭毛蛋白捕获ELISA试剂盒，其特征在于，包括已包被霍乱弧菌鞭毛蛋白多克隆抗体的固相载体和酶标记的权利要求1所述的单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述酶为辣根过氧化酶。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为霍乱弧菌鞭毛蛋白，所述阴性对照为未免疫霍乱弧菌鞭毛蛋白的正常小鼠血清或其稀释液。
7.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测霍乱弧菌的试剂盒中的应用。
8.权利要求1所述的单克隆抗体在检测霍乱弧菌中的应用。
9.权利要求3所述的试剂盒在检测霍乱弧菌中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体及抗原捕获ELISA试剂盒。该霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.6754的杂交瘤细胞株分泌产生。该霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体可用于检测霍乱弧菌。本发明还公开了一种霍乱弧菌鞭毛蛋白捕获ELISA试剂盒。
文档编号C12N5/20GK102993301SQ20121053229
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者曾静, 张蕾, 马丹, 张西萌, 魏海燕, 刘莉, 周熙城 申请人:北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心