专利名称：一种黑曲霉菌株生产的脂肪酶及其生产方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制品领域，具体涉及利用来源于西藏传统食品中的黑曲霉所产生的胞外脂肪酶，以及脂肪酶的生产方法和应用。
背景技术：
脂肪酶(EC3.1.1. 3)，即三酰基甘油酰基水解酶，能将甘油三酯催化水解为游离脂肪酸和二酰甘油、一酰甘油或甘油。此外，还可以催化一系列反应如酯化反应、酯交换反应、酸解、醇解、氨解等反应(徐玉丽等，微生物学报，2011，51 (2) :233-240)。脂肪酶广泛存在于动物、植物、微生物中(王自社等，安徽农业科学，2011,39 (7) =3798-3800),而微生物脂肪酶比动、植物脂肪酶具备更好的稳定性、更强的耐有机溶剂性、更广的底物特异性(刘海洲等，食品研究与开发，2009，30 (I) :141-143)，胞外脂肪酶被证实为具有高产、高效和高选择的生物催化剂，在制药、食品、化妆品和洗涤剂等工业得到广泛应用(Pandey A，Appl.Biochem. ,1999,29 :119_131)。随着人们对微生物脂肪酶认识的不断加深，应用范围正在不断拓宽，对酶的耐受性(极端温度、压力)要求也越来越高，许多工业用脂肪酶不能够满足苛刻的工艺温度、PH和有机溶剂而限制了其使用(董明奇等，四川大学学报(自然科学版)，2008,45 (4)985-990)。因此，发掘具有特殊酶学性质的产脂肪酶菌株具有很大的工业应用价值，而这些菌株一般都来源于特殊的生长环境。关于黑曲霉产脂肪酶，国内只有零星的菌种选育(任丽虹等，工业微生物，26 (I)23 26，1996)和脂肪酶的分离纯化(舒正玉等，生物工程学报，23 (I) :96 100，2007)报道，而且目前的脂肪酶大部分为 碱性或中性脂肪酶，限制了工业应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黑曲霉菌株产生的脂肪酶及其生产方法和应用，利用来源于西藏传统食品中的黑曲霉，通过发酵培养制备粗酶液，进一步通过盐析、透析和层析分离制备电泳纯脂肪酶。本发明的目的可以通过以下技术方案实现本发明从西藏奶渣中分离出一株脂肪酶产生菌，编号为0512。根据菌株的形态特征和18S rRNA分子鉴定,确定0512菌株为黑曲霉(Aspergillus niger),并进一步将该菌株编号为AN0512。本发明菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期是2012年11月19日，保藏号是CGMCC No. 6835。一种利用上述黑曲霉菌株生产脂肪酶的方法，包括如下步骤将处于对数生长期的黑曲霉(Aspergillus niger) AN0512菌悬液接种于液体发酵培养基，接种量为1. 4%-l. 6%v/v，进行发酵培养，将得到的发酵液离心或过滤去除菌体即得粗酶液；液体发酵培养基主要包括w/w :橄榄油O. 8%-1. 2%，酵母提取物O. 5%-2%，pH5.0-7. O,以及磷酸二氢钾O. 2%、硫酸镁O. 05%、氯化钾O. 05%，余量为水。优选地，所述粗酶液还经如下分离纯化步骤粗酶液经百分饱和浓度为50-70% /V的硫酸铵沉淀，离心取沉淀，用磷酸盐缓冲液溶解沉淀，离心去沉淀，将清液透析除盐后，采用阴离子层析、分子排阻层析分离，获得电泳纯脂肪酶。优选地，所述发酵培养条件为搅拌转速150-250r/m，培养温度27_29°C，发酵时间 90-1OOh。上述所得粗酶液用于催化酯交换或酯化反应，反应温度为25_60°C，pH为
4.0-10. O。优选地，所述粗酶液催化反应的温度为27-35°C，pH为6. 0-8. O。上述所得电泳纯脂肪酶用于催化酯交换或酯化反应的温度为20_60°C，反应的pH为3. 0-8. O。优选地，所述脂肪酶催化反应的温度为45-55°C，pH为4. 0-6. O。进一步优选地，所述脂肪酶的催化反应温度为50°C，pH为5. O。在所述酯交换或酯化反应中添加Cu2+、Ca2+、Co2+、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮或丁醇以促进脂肪酶的催化反应。而加入Fe2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、EDTA、洗涤剂则可以抑制所述脂肪酶的催化反应。本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果1、本发明提供的AN0512菌株具有良好的商业前景，其发酵产酶温度稳定，培养基来源广泛,发酵生产成本低。2、利用本发明所述方法采用常规单批发酵方式培养AN0512，以pNPP (对硝基棕榈酸苯酯)为底物测定粗酶液的酶活，其最大酶活达到30IU/ml，最适酶催化温度为27-35°C，pH为4. 0-6. O ;在25-60°C内具有稳定酶活，温度作用范围广。
3、应用本发明提供的方法分离纯化脂肪酶，脂肪酶比活从6. 2IU/mg提高到1262. 2IU/mg，酶纯度提高了 203. 6倍，酶活性得率为22. 1%。4、本发明提供的电泳纯脂肪酶的最适作用温度为50°C，在20-60°C酶活稳定性较好，在60°C保温30min仍有50%的酶活性，具备较好的高温耐受性；该酶的最适pH为5. 0，在pH4. 0-6. O内具有较好的稳定性内稳定。因此，该酶补充了工业用耐高温酸性脂肪酶的种类，具备较大的意义。5、金属离子Cu2+、Ca2+、Co2+对该脂肪酶活性有激活作用，而且，有机试剂甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮和丁醇对酶活也具有激活作用，说明该酶适用于这些有机溶剂体系的酶催化反应。6、本发明脂肪酶应用于催化酯交换或酯化反应中，具有较高的催化效率及产品得率。本发明脂肪酶能用于食品、医药、纺织、化妆品和洗涤剂等领域。
图1是本发明实施所得菌株AN0512在PDA培养基斜面形态图。图2是本发明实施所得菌株AN0512菌丝体显微观察图(上图为100倍显微观察图，左图为1000倍观察图，右图为400倍显微观察图)。图3是本发明实施所得菌株AN0512 18s rRNA基因进化树，有下划线的为本发明菌株。图4是本发明实施所得粗酶在不同反应温度下的酶活曲线图。
图5是本发明实施所得粗酶在不同反应pH下的酶活曲线图。图6是本发明实施过程各分离步骤获得的酶液的SDS-PAGE凝胶电泳图，分离胶的浓度为12%，从左至右的各条泳道分别为标记蛋白、盐析粗酶液、阴离子交换层析酶液、分子排阻层析酶液和粗酶液。从图中可以明显看出通过分子排阻层析后收集的脂肪酶达到了电泳纯纯度。图7是本发明实施所得电泳纯脂肪酶在不同反应温度下的酶活曲线图。图8是本发明实施所得电泳纯脂肪酶在不同反应pH下的酶活曲线图。图9是金属离子对本发明实施所得脂肪酶酶活的对比图，从图中可以看出多种金属离子对该脂肪酶有激发作用，其中Cu2+最大。图10是有机溶剂对本发明实施所得脂肪酶酶活的对比图，从图可以得到本发明脂肪酶在多种有机溶剂中表现出更大的酶活。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。以pNPP (对硝基棕榈酸苯酯)为底物，采用分光光度法测定粗酶液和电泳纯脂肪酶酶活性。具体测定和计算方法如下测量方法称取3mg pNPP溶于Iml异丙醇中，用作底物溶液；配制20mMpH5. O的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，并加入1%。(w/v)的阿拉伯胶，用作缓冲溶液；取50 μ I底物溶液加入到400 μ I缓冲溶液中，漩涡振荡均匀后，放入37°C水浴摇床中180r/m预热30min，然后加入同样条件下处理的酶液50 μ 1，反应5min后加入0.5ml O. 5M Na2CO3终止反应，10000r/m离心3min取清液在410nm处测定吸光度。计算方法定义反应体系每分钟每毫升底物溶液释放I μ mo I 4_NPP (对硝基苯酚)
为一个酶活单位(IU)。酶活计算公式如下Activity (IU) = A广其中K为摩尔吸光系数，
权利要求
1.一种黑曲霉菌株生产的脂肪酶，其特征在于，所述黑曲霉(Aspergillusniger)AN0512，已于2012年11月19日，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 6835。
2.权利要求1所述脂肪酶的生产方法，其特征在于，包括如下步骤 将处于对数生长期的黑曲霉(Aspergillus niger)AN0512菌悬液接种于液体发酵培养基，接种量为1. 4%-l. 6%v/v，进行发酵培养，将得到的发酵液离心或过滤去除菌体即得粗酶液；液体发酵培养基主要包括w/w :橄榄油O. 8%-1. 2%，酵母提取物O. 5%-2%，pH5. 0-7. O。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述粗酶液还经如下分离纯化步骤粗酶液经百分饱和浓度为50-70%w/v的硫酸铵沉淀，离心取沉淀，用磷酸盐缓冲液溶解沉淀，离心去沉淀，将清液透析除盐后，采用阴离子层析、分子排阻层析分离，获得电泳纯脂肪酶。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养条件为搅拌转速150-250r/m，培养温度 27_29°C，发酵时间 90_100h。
5.根据权利要求2所得粗酶液的应用，其特征在于，所述粗酶液用于催化酯交换或酯化反应的温度为25-60°C, pH为4. 0-10. O。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述粗酶液催化反应的温度为27-35°C，pH 为 6. 0-8. O。
7.根据权利要求3所得电泳纯脂肪酶的应用，其特征在于，所述脂肪酶用于催化酯交换或酯化反应的温度为20-60°C，pH为3. 0-8. O。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述脂肪酶催化反应的温度为45-55°C，pH 为 4. 0-6. O。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述脂肪酶的催化反应温度为50°C，pH为5. O。
10.根据权利7、任意一项所述的应用，其特征在于，在所述酯交换或酯化反应中添加Cu2+、Ca2+、Co2+、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮或丁醇以促进脂肪酶的催化反应。
全文摘要
本发明公开了一种黑曲霉菌株生产的脂肪酶及其生产方法和应用，所述黑曲霉(Aspergillus niger)AN0512，已于2012年11月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，简称CGMCC，保藏号是CGMCC No.6835。黑曲霉在以橄榄油为主要碳源的培养基中发酵后，去除菌体即得脂肪酶粗酶液，粗酶液通过硫酸铵沉淀、透析、阴离子交换层析和分子排阻层析分离，获得电泳纯脂肪酶，该脂肪酶具有较广泛的温度适用范围；在pH4.0-6.0内有较好的活性，具有较好的耐酸性。该脂肪酶可应用于食品加工、药物制备、化工合成等行业。
文档编号C12N9/20GK103060286SQ20121053200
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日
发明者胡松青, 刘光, 李琳, 侯轶, 王昕哲 申请人:华南理工大学