专利名称：酸性脲酶的生产方法
技术领域：
本发明涉及酸性脲酶的生产方法，属于酶制剂技术领域。
背景技术：
脲酶(Urease, urea amidohydrolase, EC 3. 5.),又称尿素氨基水解酶，存在于大多数细菌、曲霉和高等植物里。它是一种酰胺酶、能使有机物质分子中酶键水解。其作用极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。有部分微生物产生的酸性脲酶(acid urease)不同于植物中提取的中性、偏碱性脲酶，酸性脲酶能耐受酸性环境，在ρΗ4· O 5. 5的体系中仍具有活性[1]。在国外，乳酸杆菌已经被用于生产脲酶酶制剂，有效地减少葡萄酒中尿素含量[2_6]。在国内，脲酶已经被用于降低黄酒中尿素含量。但是，酒用脲酶在我国尚未形成生产 能力，目前所用的酶制剂均从国外进口 [7]。例如，浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司购买日本生产的酒用酸性脲酶去除黄酒中的尿素，该酸性脲酶在绍兴黄酒中作用时间48h左右，可有效除去黄酒中约80%的尿素[8]。随着国内对酸性酒用脲酶的需求量不断增加，迫切需要解决酒用脲酶在国内生产能力不足的现状，因此酒用脲酶的研究对我国酿酒业的发展，拓展国际市场等方面均有深远的意义。目前，江南大学分离获得肠出血性大肠埃希氏菌，利用该菌株生产出纯度较高的酒用脲酶制剂，然后将酶制剂添加到黄酒中，24h后尿素去除率为70%以上[9]。由于酒用酸性脲酶被作为食品添加剂直接添加到葡萄酒或者黄酒中，而目前报道的产脲酶菌株都是细菌，普遍从动物粪便(鸟粪、鼠粪、牛羊粪便)，农田土壤，污泥等中分离获得[9]，并且需要一系列复杂的酶纯化提取工艺才能获得高纯度的酶制剂，从而极大的增加了生产成本,也增加了大规模生产的难度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供酸性脲酶的生产方法。本发明的技术方案是酸性脲酶的生产方法，包括如下步骤利用聚多曲霉Aspergillus sydowii JNC-U5 CGMCC No. 6577 发酵，提取，得到脲酶制剂。进一步的，所述的发酵是指将聚多曲霉接种到麦芽汁培养基中，于3(T35°C、15(T250rpm、溶氧(P02)100%条件下发酵5 7天；其中，聚多曲霉的孢悬液浓度为105 106个/mL,孢悬液的体积占麦芽汁培养基体积的2%。。所述的PO2是发酵罐好氧培养时候的一个参数，即发酵罐在运行时，温度、搅拌速度、PH的实际值达到稳定状态，且通入空气使溶氧值不再变化时，将溶氧值校准为100%。校准好后在进行接种。优选的，于35°C，150rpm，培养时间为7天。进一步的，所述的麦芽汁培养基的制备方法如下取大麦芽粉碎，加3飞倍(优选4倍)于麦芽质量的55飞(TC的水，在55飞(TC下保温3 4h，过滤，煮沸，过滤，将麦芽汁浓度调整到5 7波美(°BX)(波美是糖度的单位，本发明中可用蒸馏水调糖度)，115°C下灭菌20分钟备用。进一步的，所述的提取指在发酵完毕后收集菌丝，干燥菌丝，粉碎菌丝。优选的，收集菌丝时用无菌水洗涤菌丝。优选的，粉碎菌丝过80目筛，收集菌丝粉末即得到酶制剂。本发明还提供了所述酸性脲酶的生产方法在生产酸性脲酶中的用途。本发明方法利用高产脲酶的聚多曲霉生产酸性脲酶。该菌株产脲酶活性可达到49. 7U。本发明根据聚多曲霉的特性，对发酵条件以及提取工艺进行了研究优化，使得本发明的生产方法工艺简单、投入少，可规模化大生产。本发明方法为酸性脲酶的生产提供了新的选择。 本发明的聚多曲霉(Aspergillus sydowii)JNC_U5于2012年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 6577，保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
图1pH对脲酶活性的影响图2尿素去除率测定
具体实施例方式本发明的技术方案是酸性脲酶的生产方法，包括如下步骤利用聚多曲霉Aspergillus sydowii JNC-U5 CGMCC No. 6577 发酵，提取，得到脲酶制剂。进一步的，所述的发酵是指将聚多曲霉接种到麦芽汁培养基中，于3(T35°C、15(T250rpm、溶氧(P02)100%条件下发酵5 7天；其中，聚多曲霉的孢悬液浓度为105 106个/mL,孢悬液的体积占麦芽汁培养基体积的2%。。所述的PO2是发酵罐好氧培养时候的一个参数，即发酵罐在运行时，温度、搅拌速度、PH的实际值达到稳定状态，且通入空气使溶氧值不再变化时，将溶氧值校准为100%。校准好后在进行接种。优选的，于35°C，150rpm，培养时间为7天。进一步的，所述的麦芽汁培养基的制备方法如下取大麦芽粉碎，加3飞倍于麦芽质量的55飞(TC的水，在55飞(TC下保温3 4h，过滤，煮沸，过滤，将麦芽汁浓度调整到5 7°BX, 115°C下灭菌20分钟备用。进一步的，所述的提取指在发酵完毕后收集菌丝，干燥菌丝，粉碎菌丝。优选的，收集菌丝时用无菌水洗涤菌丝，以去除发酵液中的培养基成分。优选的，粉碎菌丝过80目筛，收集菌丝粉末即得到酶制剂。本发明方法操作简单，产量高，可用于生产酸性脲酶。本发明还提供了所述酸性脲酶的生产方法在生产酸性脲酶中的用途。实施例1菌株筛选1、菌株的初筛材料四川剑南春(集团)有限责任公司使用的酒曲
培养基蛋白胨10. 0g，葡萄糖18g，0. 4%酚酞溶液3mL，氯化钠5. 0g，磷酸二氢钾2. Og,琼脂20. O,蒸馏水1000mL。除酚酞外，溶解上述各种成分，并调pH为6. 8-6. 9，然后加入酚酞指示剂。分装三角瓶，121°C灭菌15min，待培养基冷至50_55°C时，加入预先过滤灭菌的20%尿素水溶液，使其在培养基中在最终浓度为2%，摇匀后备用。实验方法无菌条件下取10克酒曲于装有90mL无菌水并放有玻珠的25mL三角瓶中，置摇床上室温振荡30分钟。取菌液按10倍的梯度稀释到10_6，取各稀释度菌液ImL放入无菌平皿中，倒入灭菌后冷却至50°C的培养基，混匀，待凝固后放入30°C培养箱培养2 5天，按菌落周围是否变红进行初筛(结果见表I)。因为脲酶分解尿素产生氨使培养基呈碱性；酚酞遇碱变红，颜色的深浅初步表示了菌株产脲酶能力的大小。挑选菌落周围变红的单菌落保存。初筛得到的菌株经形态观察发现主要为霉菌和细菌。表I初筛得到菌株的变红时间及颜色深浅
权利要求
1.酸性脲酶的生产方法，其特征在于包括如下步骤利用聚多曲霉Aspergillus sydowiiJNC-U5 CGMCC No. 6577发酵，提取，得到脲酶制剂。
2.根据权利要求1所述的酸性脲酶的生产方法，其特征在于所述的发酵是指将聚多曲霉接种到麦芽汁培养基中，于30 35°C、15(T250rpm、溶氧100%发酵5 7天；其中，聚多曲霉的孢悬液浓度为10卜106个/mL，孢悬液的体积占麦芽汁培养基体积的广2%0。
3.根据权利要求2所述的酸性脲酶的生产方法，其特征在于所述的发酵条件如下于 35°C，150rpm，培养时间为7天。
4.根据权利要求2或3所述的酸性脲酶的生产方法，其特征在于所述的麦芽汁培养基的制备方法如下取大麦芽粉碎，加3 5倍于麦芽质量的55 60°C的水,在55 60 °C下保温 3 4h，过滤，煮沸，过滤，将麦芽汁浓度调整到5 7波美，115°C下灭菌20分钟。
5.根据权利要求Γ4任一项所述的酸性脲酶的生产方法，其特征在于所述的提取为在发酵完毕后收集菌丝，干燥菌丝，粉碎菌丝。
6.根据权利要求5所述的酸性脲酶的生产方法，其特征在于收集菌丝时用无菌水洗涤菌丝。
7.根据权利要求5或6所述的酸性脲酶的生产方法，其特征在于粉碎菌丝后过80目筛，收集菌丝粉末即得到酶制剂。
8.权利要求f7任一项所述的生产方法在生产酸性脲酶中的用途。
全文摘要
本发明涉及酸性脲酶的生产方法，属于酶制剂技术领域。本发明要解决的技术问题是提供一种生产酸性脲酶的方法。本发明的酸性脲酶的生产方法，包括如下步骤利用聚多曲霉Aspergillus sydowii JNC-U5 CGMCC No.6577发酵，提取，得到脲酶制剂。本发明方法所需设备简单，操作方便，可工业化大生产酸性脲酶。
文档编号C12R1/66GK102994487SQ201210531870
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者唐清兰, 徐姿静, 魏勇, 徐占成, 刘孟华, 樊科权, 焦小川 申请人:四川绵竹剑南春酒厂有限公司