专利名称：一种大豆光合作用相关基因GmDeg1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种大豆光合作用相关基因GmDegl及其应用。
背景技术：
光合作用是生物界赖以生存的源泉和基础，然而在强光下，植物光合功能易受到抑制，光合机构遭到破坏，从而降低了光合效率，这个过程称为光抑制。在长期进化过程中植物体形成了多种保护其免受强光破坏的生物物理和生物化学机制，来灵活地抵御复杂多变的光照胁迫，以将光抑制伤害减小到最低程度。除一些形态上的适应外，光合机构还存在热耗散、光呼吸和Dl蛋白的周转等几种保护机制。光破坏的主要目标是PSII核心蛋白中的Dl蛋白，损伤后的Dl蛋白会影响到电子传递等功能和PSII反应中心结构的变化，导致光合功能的降低。损伤的Dl蛋白被蛋白酶降解后由新合成的Dl蛋白填补上继而完成正常 的生理功能。Deg蛋白酶家族属于丝氨酸类蛋白酶,迄今为止的研究表明拟南芥中有5个Deg蛋白酶家族成员，定位于叶绿体中，并已证明在Dl蛋白的周转过程中发挥着重要作用。大豆作为重要的经济作物，是当今世界上最重要的植物蛋白与食用植物油的来源，而在强光下，大豆不可避免地发生光抑制现象，从而导致大豆产量和品质的下降。因而对于光抑制机制和光保护机制的研究对大豆产量和品质的提高具有重要意义。Krause (1988)和Oquist (1992)指出，PSII活性的下调可以耗散过剩的激发能，是一种避免PSII反应中心遭受强光破坏的保护机制,这已被大量研究所证实(Krause,1991)。对于PSII活性下调的原因，首先由Guenther和Melis (1990)提出是由于Dl蛋白降解与合成修复循环运转造成的。但后来研究表明，用叶绿体蛋白合成抑制剂林肯霉素处理，对Dl蛋白水平和光抑制的恢复都没有影响，因此Aro (1993)提出PSII光化学活性的降低是PSII中心可逆失活的结果。Anderson (1994)研究指出失活的PSII可以聚集在类囊体膜的垛叠区，发生Dl蛋白的磷酸化，从而避免了 Dl蛋白的降解。然而目前对PSII反应中心活性的降低如何转变激发能为热耗散的机理仍不清楚。到目前为止，在大豆中，Deg基因家族还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种大豆光合作用相关基因GmDegl。本发明的另一目的是提供该基因编码的蛋白。本发明的又一目的是提供该基因的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现—种大丑光合作用相关基因GmDegl,核苷酸序列如SEQ ID NO. I所不。本发明所述的大豆光合作用相关基因GmDegl编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示。一种含有本发明所述的大豆光合作用相关基因GmDegl的重组质粒。
本发明所述的重组质粒，其特征在于将本发明所述的大豆光合作用相关基因GmDegl插入pMDC83植物过量表达载体中。本发明所述的大豆光合作用相关基因GmDegl在大豆抗光抑制作用中的应用。本发明所述的大豆光合作用相关基因GmDegl在培育高光效大豆品种中的应用。含本发明所述的大豆光合作用相关基因GmDegl的重组质粒在大豆抗光抑制作用中的应用。含本发明所述的大豆光合作用相关基因GmDegl的重组质粒在培育高光效大豆品种中的应用。有益效果
本发明所提供的大豆光合作用相关基因GmDegl，位于第19条染色体上，读码框长度为1296bp。其编码的蛋白具有典型的催化三联基(Ser、His、Asp)，属于不依赖于ATP的丝氨酸类蛋白酶。蛋白酶定位于类囊体腔侧，对底物要求比较高。序列中存在PDZ结构域，其通过与底物蛋白C-末端的氨基酸残基发生特异性的结合从而起到识别底物和调节蛋白酶活性的作用。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明GmDegl基因导入植物细胞，可获得对光抑制抵抗能力得到提高的转基因植株。使用本发明的基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素、卡那霉素等)。携带有本发明GmDegl的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的基因对大豆抗光抑制作用，特别是培育高光效大豆品种具有重要意义。
图I大豆GmDegl基因的克隆。图2大豆GmDegl基因的表达分析。注用1^处理大豆幼苗，分别于011、111、311、611和1此探索基因表达量的变化。数值以3个重复的平均值土标准差形式表示。图3大豆GmDegl基因在大肠杆菌中的表达分析。注A图.含有pET28a-GmDegl质粒的BL21 (DE3)菌液经ImM IPTG诱导6h，过量表达的蛋白经NI-NTA柱纯化。阴性对照I、阴性对照2、S、P、FL、E1、E2、E3、E4、E5、E6和E7分别表示含有空载pET28a的BL21 (DE3)、不含质粒的BL21 (DE3)、超声后上清、超声后沉淀、穿流液、20mM咪唑洗脱液、20mM咪唑洗脱液、40mM咪唑洗脱液、40mM咪唑洗脱液、IOOmM咪唑洗脱液、250mM咪唑洗脱液和250mM咪唑洗脱液。SDS-PAGE电泳检测样品后，考马斯亮蓝R250染色。B图.Western blot分析(A图)中的组分,一抗为anti-His抗体。图4GmDegl对β -酪蛋白的降解活性。注A1.8yg GmDegl和50 μ gP-酪蛋白混合，在37°C和pH 6. O条件下反应2h，分时段取样SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色。A2. 8 μ g GmDegl 和 50yg@-酪蛋白混合，加入 PMSF 至终浓度 lmM，37°C 和 pH 6. O条件下反应2h，分时段取样SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色。A3. 8 μ g GmDegl和50 μ g β -酪蛋白混合,在pH 6. O和不同的温度条件下反应lh,SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色。A4. 8 μ g GmDegl和50 μ g β _酪蛋白混合,在37°C和不同的pH条件下反应lh,SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色。图5大豆GmDegl基因的植物过量表达载体构建流程。图6转基因苗的筛选和检测。注在含有潮霉素的LB平板上筛选Ttl代种子，结果如A图，红圈表示阳性植株。为得到纯合系转基因植株，繁殖至T3代，潮霉素筛选结果如B图，对T3代植株分别用四对引物PCR检测，结果如C图。图7强光下转基因和野生型植株的PSII活性。注离体叶片在1000 μ mo I · m2 · s_1的光照下照射，在0h、0. 5h、lh、2h和4h测PSII的最大光化学效率(Fv/Fm)，4h后降低光强为80 μ mo I · m_2 · s—^h后测Fv/Fm, A图为转GmDegl植株浮于水上测得的结果，B图为转GmDegl植株浮于林可霉素溶液上测得的结果。数值以3个重复的平均值土标准差的形式表示。
具体实施例方式实施例I、大豆GmDegl基因的克隆用植物总RNA提取试剂盒(购自天根公司)提取大豆品种科丰I号叶片总RNAj^1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。cDNA的合成按照TaKaRa公司SYBR PrimeScriptRT-PCR Kit II试剂盒说明操作。设计引物GmDegl-F :5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCCAACCAAAAACAATGGCCAC-3’(SEQ ID NO. 3)GmDegl-R :5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTGATTCATCAGGCTTTGGCTCC-3’(SEQ ID NO. 4) 按照以下组份顺序配制PCR反应液(50 μ I体系)
10XPCR Buffer5 μ I
ddH,034. 75 μ I
dNTP (2. 5 mM)4 μ I
Mg2. (25 mM)3 μ I
上游引物 GmDegH (10 raM)I μ I
下游引物 GmDegH (10 mM)I μ I
cDNAI μ I
Taq 酶(5 υ/μ I)O. 25 μ I
按以下程序进行PCR反应
权利要求
1.一种大豆光合作用相关基因GmDegl，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.权利要求I所述的大豆光合作用相关基因GmDegl编码的蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一种含有权利要求I所述的大豆光合作用相关基因GmDegl的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于将权利要求I所述的大豆光合作用相关基因GmDegl插入pMDC83植物过量表达载体中。
5.权利要求I所述的大豆光合作用相关基因GmDegl在大豆抗光抑制作用中的应用。
6.权利要求I所述的大豆光合作用相关基因GmeDegl在培育高光效大豆品种中的应用。
7.权利要求3所述的含大豆光合作用相关基因GmDegl的重组质粒在大豆抗光抑制作用中的应用。
8.权利要求3所述的大豆光合作用相关基因GmDegl的重组质粒在培育高光效大豆品种中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，公开了一种大豆光合作用相关基因GmDeg1及其应用。一种大豆光合作用相关基因GmDeg1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明Gmeg1基因导入植物细胞，可获得对光抑制抵抗能力得到提高的转基因植株。本发明的基因对大豆抗光抑制作用，特别是培育高光效大豆品种具有重要意义。
文档编号C12N9/50GK102978225SQ20121053224
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者杨守萍, 孔星, 张璟曜 申请人:南京农业大学