用于增强甲羟戊酸、异戊二烯和类异戊二烯的产量的重组微生物的制作方法

用于增强甲羟戊酸、异戊二烯和类异戊二烯的产量的重组微生物的制作方法
【专利摘要】本发明描述了通过为了增加流向甲羟戊酸生产的碳通量在如下酶途径中对微生物进行工程改造使得所述酶活性中的一者或多者受到调节来增加甲羟戊酸、戊二烯、类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产量的组合物和方法：(a)柠檬酸合酶、(b)磷酸转乙酰酶、(c)乙酸激酶、(d)乳酸脱氢酶、(e)苹果酸酶和(f)丙酮酸脱氢酶。此外，可通过异源表达mvaE和mvaS基因(例如但不限于来自生物体格氏李斯特菌DSM20601、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌EG2和铅黄肠球菌的mvaE和mvaS基因)进一步增大甲羟戊酸、戊二烯、类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产量。
【专利说明】用于增强甲羟戊酸、异戊二烯和类异戊二烯的产量的重组
微生物
[0001]相关专利申请的交叉引用
[0002]本专利申请要求于2011年4月29日提交的美国临时专利申请N0.61/481，121的优先权，将该专利的公开内容以引用方式全文并入本文。
【技术领域】
[0003]本公开涉及用于在重组微生物中增加甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯和类异戊二烯前体分子的产量的组合物和方法以及制备和使用甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯和类异戊二烯前体分子的方法。
发明背景
[0004]R-甲羟戊酸是甲羟戊酸依赖性生物合成途径的中间体，该途径将乙酰辅酶A转化成异戊烯二磷酸和二甲基烯丙基二磷酸。乙酰辅酶A向甲羟戊酸的转化可由上游甲羟戊酸依赖性生物合成途径(MVA途径)的硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶活性催化。根据葡萄糖经由糖酵解 转化为乙酰辅酶A的摩尔转化率,利用MVA上游途径酶硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶产生甲羟戊酸的理论质量产率为54.8%。
[0005]商业上，甲羟戊酸已被用作化妆品中的添加剂、用于生产可生物降解的聚合物，并且可具有作为用于合成其他化学品的手性构造块的价值。
[0006]甲羟戊酸依赖性途径的产物是异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。IPP和DMAPP是异戊二烯以及类异戊二烯的前体。异戊二烯(2-甲基_1，3_ 丁二烯)是天然橡胶的单体并且还是各式各样的其他天然存在的化合物(统称为类异戊二烯)的共同结构基序(structural motif)异戍二烯此外还是多种合成聚合物(最值得注意的是合成橡胶)的关键原料。
[0007]类异戊二烯是衍生自类异戊二烯前体分子IPP和DMAPP的化合物。已鉴定了超过29，000种类异戊二烯化合物并且每年都发现新的类异戊二烯。类异戊二烯可分离自天然产物，例如将类异戊二烯前体分子用作基础构造块以形成类异戊二烯的相对复杂结构的微生物和植物物种。类异戊二烯对大多数活生物体和细胞是至关重要的，为维持细胞膜流动性和电子传递提供了手段。在自然界，类异戊二烯发挥的作用多种多样，从作为植物中的天然杀虫剂到促成与肉桂、丁香和生姜相关的香味。此外，制药和化学界将类异戊二烯用作药品、保健营养品、调味剂和农业害虫防治剂。鉴于它们在生物系统中的重要性以及在广泛应用中的有用性，类异戊二烯已成为倍受科学家重视的焦点。
[0008]获得甲羟戊酸和类异戊二烯的常规手段包括从生物材料(如植物、微生物和动物)提取以及在实验室中部分有机合成或全有机合成。然而，这类手段通常已证明差强人意。尤其对于类异戊二烯，鉴于通常其分子结构的复杂性，有机合成不可行，通常需要若干步骤来获得所需产物。另外，这些化学合成步骤可涉及使用毒性溶剂，同样从生物材料提取类异戊二烯也可涉及使用毒性溶剂。此外，这些提取和纯化方法通常导致所需类异戊二烯收率相对较低，因为生物材料通常仅含有微量的这些分子。不幸的是，获得相对大量的类异戊二烯所涉及的困难已限制了它们的实际应用。
[0009]在制备异戊二烯、类异戊二烯前体分子和类异戊二烯方面的最近的发展公开了用于产生异戊二烯和类异戊二烯的方法，所产生的速率、滴度和纯度可足以满足稳固的商业化生产过程的需求(参见例如国际专利申请公开N0.W02009/076676A2和美国专利N0.7，915，026);然而，仍需要增加异戊二烯和类异戊二烯的产量以及增加异戊二烯和类异戊二烯的产率的改进。
[0010]本发明通过公开组合物和方法以增加作为甲羟戊酸依赖性生物合成途径的中间体的甲羟戊酸的产量以及增加衍生自甲羟戊酸的分子如异戊二烯、类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产量而提供了这些改进。
[0011]在整篇本说明书中，参考了多个专利、专利申请以及其他类型的出版物(如杂志文章)。特此将本文引用的所有专利、专利申请和出版物以引用的方式全文并入本文用于所有目的。

【发明内容】

[0012]本文提供的发明尤其公开了通过在重组微生物中利用特定的基因操纵来增加微生物中甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产量的组合物和方法，该基因操纵导致流向甲羟戊酸生产的碳通量增加。
[0013]因此，在一个方面，本发明提供的是能够增加异戊二烯产量的重组细胞，其中为了增加流向异戊二烯生产的碳通量而对细胞进行工程改造使得来自由如下酶组成的组的一种或多种酶的活性受到调节:柠檬酸合酶、磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、磷酸葡糖酸内酯酶(PGL)和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，并且其中所述细胞还包含一种或多种编码一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽的核酸和一种或多种编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸；并且其中与尚未为增加流向异戊二烯的碳通量而经工程改造的产异戊二烯细胞相比，所述细胞产生增加量的异戊二烯。在一些方面，该一种或多种编码MVA途径多肽的核酸来自MVA上游途径，其中MVA上游途径核酸选自AA-CoA硫解酶核酸、HMG-CoA合酶核酸和HMG-CoA还原酶核酸。在一些方面，所述一种或多种编码甲羟戊酸(MVA)上游途径多肽的核酸为mvaE基因和mvaS基因。在一些方面，mvaE基因和mvaS基因选自:(a)来自格氏李斯特菌(L.grayi)的mvaE基因和mvaS基因；(b)来自尿肠球菌(E.faecium)的mvaE基因和mvaS基因；(c)来自鹁鸡肠球菌(E.gal I inarum)的mvaE基因和mvaS基因；(d)来自铅黄肠球菌(E.casselifIavuS)的mvaE基因和mvaS基因；和(e)来自粪肠球菌(E.faecalis)的mvaE基因和mvaS基因。在一些方面，一种或多种编码MVA途径多肽的核酸来自MVA下游途径，其中MVA下游途径核酸选自MVK、PMK和MVD核酸。在一些方面，MVK选自马氏甲烷八叠球菌(M.mazei)甲羟戊酸激酶、布氏拟甲烧球菌(M.burtonii)甲轻戍酸激酶多肽、乳杆菌(Lactobacillus)甲轻戍酸激酶多肽、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)甲羟戊酸激酶多肽、酵母甲羟戊酸激酶多肽、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甲轻戍酸激酶多妝、链球菌(Streptococcus)甲轻戍酸激酶多肽、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)甲轻戍酸激酶多肽、链霉菌(Streptomyces)甲轻戍酸激酶多肽和链霉菌CL190甲轻戍酸激酶多肽。在一些方面，该细胞还包含一种或多种编码一种或DXP途径多肽的异源核酸。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为来自葛属(Pueraria)或杨属(Populus)或杂种银白杨(Populus alba)x欧洲山杨(Populus tremula)的多肽或其变体。在一些方面，该细胞为革兰氏阳性细菌细胞、链霉菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞、埃希杆菌(Escherichia)细胞、泛菌(Pantoea)细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、木霉(Trichoderma)细胞、曲霉(Aspergillus)细胞或酵母细胞。在一些方面，柠檬酸合酶的活性通过降低内源柠檬酸合酶基因的活性而进行调节。在一些方面，通过用编码NADH非敏感型柠檬酸合酶的转基因对内源柠檬酸合酶基因进行染色体置换来调节柠檬酸合酶的活性。在一些方面，编码NADH非敏感型柠檬酸合酶的转基因源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在一些方面，通过将内源柠檬酸合酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来调节柠檬酸合酶的活性。在任何本文所提供的方面的一些方面中，降低柠檬酸合酶的活性可导致与柠檬酸合酶的表达不降低的微生物相比，更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。在一些方面，通过调节磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过减弱内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的活性来调节磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的活性。在一些方面，通过缺失内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因来减弱内源磷酸转乙酰酶和/或内源乙酸激酶基因表达。在任何本文所提供的方面的一些方面中，该细胞与内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的表达不减弱的微生物相比产生降低量的乙酸。在任何本文所提供的方面的一些方面中，减弱内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的活性导致与内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的表达不减弱的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。在一些方面，通过调节乳酸脱氢酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性来调节乳酸脱氢酶的活性。在一些方面，通过缺失内源乳酸脱氢酶基因来减弱内源乳酸脱氢酶基因表达。在任何本文所提供的方面的一些方面中，该细胞与内源乳酸脱氢酶基因的表达不减弱的微生物相比产生降低量的乳酸。在任何本文所提供的方面的一些方面中，减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性导致与内源乳酸脱氢酶基因的表达不减弱的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。在一些方面，通过调节NADP依赖性苹果酸脱氢酶的活性来将碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过增加NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的活性来调节NADP依赖性苹果酸脱氢酶的活性。在一些方面，NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因是内源基因。在一些方面，通过将内源NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因启动子替换为合成的组成型表达启动子来增加内源NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的表达。在任何本文所提供的方面的一些方面中，细胞还包含编码NADP依赖性苹果酸脱氢酶多肽的异源核酸。在任何本文所提供的方面的一些方面中，该细胞与NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的表达不增加的微生物相比产生增加量的丙酮酸。在任何本文所提供的方面的一些方面中，增加NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的活性导致与NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的表达不增加的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。在一些方面，通过调节丙酮酸脱氢酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过增加丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因的活性来调节丙酮酸脱氢酶的活性，所述丙酮酸脱氢酶复合物由如下组成:(a)丙酮酸脱氢酶(El)、(b) 二氢硫辛酸转乙酰酶和(c) 二氢硫辛酸脱氢酶。在任何本文所提供的方面的一些方 面中，通过减弱内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白基因的活性来调节丙酮酸脱氢酶复合物的活性。在一些方面，丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因为内源基因。在一些方面，通过将一种或多种内源基因启动子替换为一种或多种合成的组成型表达启动子来增加丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种内源基因的表达。在任何本文所提供的方面的一些方面中，该细胞还包含一种或多种编码一种或多种来自由如下酶组成的组的多肽的异源核酸:(a)丙酮酸脱氢酶(El)、(b) 二氢硫辛酸转乙酰酶和(C) 二氢硫辛酸脱氢酶。在一些方面，通过缺失内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白基因来减弱内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白的活性。在任何本文所提供的方面的一些方面中，该细胞与其中丙酮酸脱氢酶活性未受调节的微生物相比产生增加量的乙酰辅酶A。在任何本文所提供的方面的一些方面中，调节丙酮酸脱氢酶的活性导致与丙酮酸脱氢酶表达未受调节的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。在一些方面，通过调节磷酸葡糖酸内酯酶(PGL)的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过减弱内源PGL基因的活性来调节PGL的活性。在一些方面，通过将内源PGL基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来减弱PGL的活性。在一些方面，通过缺失内源PGL基因来减弱内源PGL的活性。在一些方面，通过调节磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过减弱内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的活性来调节磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。在一些方面，通过将内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来减弱磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。在一些方面，通过缺失内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因来减弱内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。在一些方面，该细胞还包含一种或多种编码异戊烯二磷酸S-异构酶(IDI)多肽的核酸。
[0014]在其他方面， 本文提供的是产生异戊二烯的方法，包括:(a)在适于产生异戊二烯的培养条件下培养任何本文所公开方面所提供的任何细胞；以及(b)产生异戊二烯。在另一实施例中，该方法还包括回收异戊二烯。
[0015]在另一个方面，本文提供的是能够增加甲羟戊酸的产量的重组细胞，其中为了增加流向甲羟戊酸生产的碳通量而对细胞进行工程改造，使得一种或多种来自由柠檬酸合酶、磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、磷酸葡糖酸内酯酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶组成的组的酶的活性受到调节，并且其中所述细胞还包含一种或多种编码一种或多种甲羟戊酸(MVA)上游途径多肽的核酸；并且其中该细胞与尚未为增加流向甲羟戊酸的碳通量而经工程改造的产甲羟戊酸细胞相比，产生增加量的甲羟戊酸。在一些方面，所述一种或多种编码甲羟戊酸(MVA)上游途径多肽的核酸为mvaE基因和mvaS基因。在一些方面，mvaE基因和mvaS基因选自:(a)来自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)来自屎肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；(C)来自鹁鸡肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；(d)来自铅黄肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(e)来自粪肠球菌的mvaE基因和mvaS基因。在一些方面，通过降低内源柠檬酸合酶基因的活性来调节柠檬酸合酶的活性。在一些方面，通过用编码NADH非敏感型柠檬酸合酶的转基因对内源柠檬酸合酶基因进行染色体置换来调节柠檬酸合酶的活性。在一些方面，编码NADH非敏感型柠檬酸合酶的转基因源于枯草芽孢杆菌。在一些方面，通过将内源柠檬酸合酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来调节柠檬酸合酶的活性。在任何本文所提供的方面的一些方面中，降低柠檬酸合酶的活性可导致与柠檬酸合酶的表达不降低的微生物相比，更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。在一些方面，通过调节磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过减弱内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的活性来调节磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的活性。在一些方面，通过缺失内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因来减弱内源磷酸转乙酰酶和/或内源乙酸激酶基因表达。在任何本文所提供的方面的一些方面中，该细胞与内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的表达不减弱的微生物相比产生降低量的乙酸。在任何本文所提供的方面的一些方面中，减弱内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的活性导致与内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的表达不减弱的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。在一些方面，通过调节乳酸脱氢酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性来调节乳酸脱氢酶的活性。在一些方面，通过缺失内源乳酸脱氢酶基因来减弱内源乳酸脱氢酶基因表达。在任何本文所提供的方面的一些方面中，该细胞与内源乳酸脱氢酶基因的表达不减弱的微生物相比产生降低量的乳酸。在任何本文所提供的方面的一些方面中，减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性导致与内源乳酸脱氢酶基因的表达不减弱的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。在一些方面，通过调节NADP依赖性苹果酸脱氢酶的活性来将碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过增加NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的活性来调节NADP依赖性苹果酸脱氢酶的活性。在一些方面，NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因是内源基因。在一些方面，通过将内源NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因启动子替换为合成的组成型表达启动子来增加内源NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的表达。在任何本文所提供的方面的一些方面中，细胞还包含编码NADP依赖性苹果酸脱氢酶多肽的异源核酸。在任何本文所提供的方面的一些方面中，其中该细胞与NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的表达不增加的微生物相比产生增加量的丙酮酸。在任何本文所提供的方面的一些方面中，其中增加NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的活性导致与NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的表达不增加的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。在一些方面，通过调节丙酮酸脱氢酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过增加丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因的活性来调节丙酮酸脱氢酶的活性，所述丙酮酸脱氢酶复合物由如下组成:(a)丙酮酸脱氢酶(El)、(b) 二氢硫辛酸转乙酰酶和(c) 二氢硫辛酸脱氢酶。在任何本文所提供的方面的一些方面中，通过减弱内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白基因的活性来调节丙酮酸脱氢酶复合物的活性。在一些方面，丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因为内源基因。在一些方面，通过将一种或多种内源基因启动子替换为一种或多种合成的组成型表达启动子来增加丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种内源基因的表达。在任何本文所提供的方面的一些方面中，该细胞还包含一种或多种编码一种或多种来自由如下酶组成的组的多肽的异源核酸:(a)丙酮酸脱氢酶(El)、(b) 二氢硫辛酸转乙酰酶和(C) 二氢硫辛酸脱氢酶。在一些方面，通过缺失内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白基因来减弱内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白的活性。在任何本文所提供的方面的一些方面中，该细胞与其中丙酮酸脱氢酶活性未受调节的微生物相比产生增加量的乙酰辅酶A。在任何本文所提供的方面的一些方面中，调节丙酮酸脱氢酶的活性导致与丙酮酸脱氢酶表达未受调节的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。在一些方面，通过调节磷酸葡糖酸内酯酶(PGL)的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过减弱内源PGL基因的活性来调节PGL的活性。在一些方面，通过将内源PGL基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来减弱PGL的活性。在一些方面，通过缺失内源PGL基因来减弱内源PGL的活性。在一些方面，通过调节磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过减弱内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的活性来调节磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。在一些方面，通过将内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来减弱磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。在一些方面，通过缺失内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因来减弱内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。在任何本文所提供的方面的一些方面中，与不在三羧酸(TCA)循环活性条件下培养的微生物相比甲羟戊酸产量得到增加，其中通过调节一种或多种来自由如下酶组成的组的酶的活性将细胞中的代谢碳通量导向甲羟戊酸生产:(a)柠檬酸合酶、(b)磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶、(c)乳酸脱氢酶、(d)苹果酸脱氢酶和(e)丙酮酸脱羧酶复合物。在任何本文所提供的方面的一些方面中，通过将内源柠檬酸合酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来调节柠檬酸合酶的活性、通过减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性来调节乳酸脱氢酶的活性以及通过减弱内源乙酸激酶基因的活性来调节乙酸激酶的活性。
[0016]在一些方面，本文提供的是产生甲羟戊酸的方法，包括:(a)在适于产生异戊二烯的培养条件下培养任何本文所公开方面所提供的任何细胞；以及(b)产生甲羟戊酸。在一个实施例中，该方法还包括回收甲羟戊酸。
[0017]在其他方面，本文提供的是能够增加类异戊二烯产量的重组细胞，其中为了增加流向甲羟戊酸生产的碳通量而对细胞进行工程改造使得一种或多种来自由如下酶组成的组的酶的活性受到调节:柠 檬酸合酶、磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、磷酸葡糖酸内酯酶(PGL)和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，并且其中所述细胞还包含(i) 一种或多种编码一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽的核酸和(ii) 一种或多种编码聚丙烯焦磷酸合酶的核酸；并且其中该细胞与尚未为增加流向甲羟戊酸的碳通量而经工程改造的产类异戊二烯细胞相比，产生增加量的类异戊二烯。在一些方面，该一种或多种编码MVA途径多肽的核酸来自MVA上游途径，其中MVA上游途径核酸选自AA-CoA硫解酶核酸、HMG-CoA合酶核酸和HMG-CoA还原酶核酸。在一些方面，所述一种或多种编码甲轻戍酸(MVA)上游途径多肽的核酸为mvaE基因和mvaS基因。在一些方面，mvaE基因和mvaS基因选自:(a)来自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)来自屎肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；(C)来自鹁鸡肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；(d)来自铅黄肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(e)来自粪肠球菌的mvaE基因和mvaS基因。在一些方面，该一种或多种编码MVA途径多肽的核酸来自MVA下游途径，其中MVA下游途径核酸选自MVK核酸、PMK核酸和MVD核酸。在一些方面，MVK选自马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、布氏拟甲烷球菌甲羟戊酸激酶多肽、乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、清酒乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、酵母甲羟戊酸激酶多肽、酿酒酵母甲羟戊酸激酶多肽、链球菌甲羟戊酸激酶多肽、肺炎链球菌甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌甲羟戊酸激酶多肽和链霉菌CL190甲羟戊酸激酶多肽。在一些方面，该细胞还包含一种或多种编码一种或DXP途径多肽的异源核酸。在一些方面，该细胞为革兰氏阳性细菌细胞、链霉菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞、埃希杆菌细胞、泛菌细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、木霉细胞、曲霉细胞或酵母细胞。在一些方面，通过降低内源柠檬酸合酶基因的活性来调节柠檬酸合酶的活性。在一些方面，通过用编码NADH非敏感型柠檬酸合酶的转基因对内源柠檬酸合酶基因进行染色体置换来调节柠檬酸合酶的活性。在一些方面，编码NADH非敏感型柠檬酸合酶的转基因源于枯草芽孢杆菌。在一些方面，通过将内源柠檬酸合酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来调节柠檬酸合酶的活性。在任何本文所提供的方面的一些方面中，降低柠檬酸合酶的活性可导致与柠檬酸合酶的表达不降低的微生物相比，更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。在一些方面，通过调节磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过减弱内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的活性来调节磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的活性。在一些方面，通过缺失内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因来减弱内源磷酸转乙酰酶和/或内源乙酸激酶基因表达。在任何本文所提供的方面的一些方面中，该细胞与内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的表达不减弱的微生物相比产生降低量的乙酸。在任何本文所提供的方面的一些方面中，减弱内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的活性导致与内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的表达不减弱的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。在一些方面，通过调节乳酸脱氢酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性来调节乳酸脱氢酶的活性。在一些方面，通过缺失内源乳酸脱氢酶基因来减弱内源乳酸脱氢酶基因表达。在任何本文所提供的方面的一些方面中，该细胞与内源乳酸脱氢酶基因的表达不减弱的微生物相比产生降低量的乳酸。在任何本文所提供的方面的一些方面中，减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性导致与内源乳酸脱氢酶基因的表达不减弱的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。在一些方面，通过调节NADP依赖性苹果酸脱氢酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过增加NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的活性来调节NADP依赖性苹果酸脱氢酶的活性。在一些方面，该NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因是内源基因。在一些方面，通过将内源NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因启动子替换为合成的组成型表达启动子来增加内源NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的表达。在任何本文所提供的方面的一些方面中，细胞还包含编码NADP依赖性苹果酸脱氢酶多肽的异源核酸。在任何本文所提供的方面的一些方面中，该细胞与NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的表达不增加的微生物相比产生增加量的丙酮酸。在任何本文所提供的方面的一些方面中，增加NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的活性导致与NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的表达不增加的微生物相 比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。在一些方面，通过调节丙酮酸脱氢酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过增加丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因的活性来调节丙酮酸脱氢酶的活性，所述丙酮酸脱氢酶复合物由如下组成:(a)丙酮酸脱氢酶(El)、(b) 二氢硫辛酸转乙酰酶和(c) 二氢硫辛酸脱氢酶。在任何本文所提供的方面的一些方面中，通过减弱内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白基因的活性来调节丙酮酸脱氢酶复合物的活性。在一些方面，丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因为内源基因。在一些方面，通过将一种或多种内源基因启动子替换为一种或多种合成的组成型表达启动子来增加丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种内源基因的表达。在任何本文所提供的方面的一些方面中，该细胞还包含一种或多种编码一种或多种来自由如下酶组成的组的多肽的异源核酸:(a)丙酮酸脱氢酶(El)、(b) 二氢硫辛酸转乙酰酶和(c)二氢硫辛酸脱氢酶。在一些方面，通过缺失内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白基因来减弱内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白的活性。在任何本文所提供的方面的一些方面中，该细胞与其中丙酮酸脱氢酶活性未受调节的微生物相比产生增加量的乙酰辅酶A。在任何本文所提供的方面的一些方面中，调节丙酮酸脱氢酶的活性导致与丙酮酸脱氢酶表达未受调节的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。在一些方面，通过调节磷酸葡糖酸内酯酶(PGL)的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过减弱内源PGL基因的活性来调节PGL的活性。在一些方面，通过将内源PGL基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来增加PGL的活性。在一些方面，通过缺失内源PGL基因来减弱内源PGL的活性。在一些方面，通过调节磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过减弱内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的活性来调节磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。在一些方面，通过将内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来降低磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。在一些方面，通过缺失内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因来减弱内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。在任何本文所提供的方面的一些方面中，其中类异戊二烯选自单萜、二萜、三萜、四萜、倍半萜和多萜。在一些方面，类异戍二烯为倍半職。在一些方面，类异戍二烯选自松香二烯、紫穗槐二烯(amorphadiene)、蒈烯、α-金合欢烯、β-金合欢烯、金合欢醇、香叶醇、香叶基香叶醇、芳樟醇、柠檬烯、月桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β_菔烯、桧烯、Y-職品烯、异松香烯(terpindene)和瓦伦西亚桔烯(valencene)。在一些方面,该细胞还包含一种或多种编码异戍烯二磷酸δ -异构酶(IDI)多肽的核酸。
[0018]在其他方面，本文提供的是产生类异戊二烯的方法，包括:(a)在适于产生类异戊二烯的培养条件下培养任何本文所公开方面所提供的任何细胞；以及(b)产生类异戊二烯。在一个方面，该方法还包括回收类异戊二烯。
[0019]在一个方面，本发明提供重组微生物或其子代，包括为增加流向甲羟戊酸生产的碳通量而经工程改造的细胞，其中对一种或多种来自由如下酶组成的组的酶的活性进行调节:(a)柠檬酸合酶；(b) 磷酸转乙酰酶；(C)乙酸激酶；(d)乳酸脱氢酶；(e)NADP依赖性苹果酸酶；和(f)丙酮酸脱氢酶。在任何本文的方面中，该细胞可还包含mvaE基因和mvaS基因(例如选自如下的mvaE基因和mvaS基因:(a)来自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)来自屎肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；(C)来自鹁鸡肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；(d)来自铅黄肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(e)来自粪肠球菌的mvaE基因和mvaS基因)。
[0020]在任何本文的方面，本发明提供重组微生物或其子代，其中通过调节柠檬酸合酶的活性将增加的碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过降低内源柠檬酸合酶基因的活性调节柠檬酸合酶的活性。在一些方面，通过用编码NADH非敏感型柠檬酸合酶的转基因对内源柠檬酸合酶基因进行染色体置换来调节柠檬酸合酶的活性。在一些方面，编码NADH非敏感型柠檬酸合酶的转基因源于枯草芽孢杆菌。在一些方面，通过将内源柠檬酸合酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来调节柠檬酸合酶的活性。在任何本文的方面，降低柠檬酸合酶的活性导致与柠檬酸合酶的表达不降低的微生物相比，更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
[0021]在任何本文的方面，本发明提供重组微生物或其子代，其中通过调节磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的活性将增加的碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过减弱内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的活性来调节磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的活性。在一个方面，通过缺失内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因来减弱内源磷酸转乙酰酶和/或内源乙酸激酶基因表达。在任何本文的方面，该重组微生物与内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的表达不减弱的微生物相比产生降低量的乙酸。在任何本文的方面，减弱内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的活性导致与内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的表达不减弱的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
[0022]在任何本文的方面，本发明提供重组微生物或其子代，其中通过调节乳酸脱氢酶的活性将增加的碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性来调节乳酸脱氢酶的活性。在一些方面，通过缺失内源乳酸脱氢酶基因来减弱内源乳酸脱氢酶基因表达。在任何本文的方面，该重组微生物与内源乳酸脱氢酶基因的表达不减弱的微生物相比产生降低量的乳酸。在任何本文的方面，减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性导致与内源乳酸脱氢酶基因的表达不减弱的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
[0023]在任何本文的方面，本发明提供重组微生物或其子代，其中通过调节NADP依赖性苹果酸酶的活性将增加的碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过增加NADP依赖性苹果酸酶基因的活性来调节NADP依赖性苹果酸酶的活性。在一些方面，NADP依赖性苹果酸酶基因是内源基因。在一些方面，通过将内源NADP依赖性苹果酸酶基因启动子替换为合成的组成型表达启动子来增加内源NADP依赖性苹果酸酶基因的表达。在一些方面，该重组微生物还包含编码NADP依赖性苹果酸酶多肽的异源核酸。在任何本文的方面，该重组微生物与NADP依赖性苹果酸酶基因的表达不增加的微生物相比产生增加量的丙酮酸。在任何本文的方面，增加NADP依赖性苹果酸酶基因的活性导致与NADP依赖性苹果酸酶基因表达不增加的微生物相比 更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
[0024]在任何本文的方面，本发明提供重组微生物或其子代，其中通过调节丙酮酸脱氢酶的活性将增加的碳通量导向甲羟戊酸生产。在一些方面，通过增加丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因的活性来调节丙酮酸脱氢酶的活性，所述丙酮酸脱氢酶复合物由如下组成:(a)丙酮酸脱氢酶(El)、(b) 二氢硫辛酸转乙酰酶和(C) 二氢硫辛酸脱氢酶。在任何本文的方面，通过减弱内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白基因的活性来调节丙酮酸脱氢酶复合物的活性。在一些方面，丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因为内源基因。在一些方面，通过将一种或多种内源基因启动子替换为一种或多种合成的组成型表达启动子来增加丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种内源基因的表达。在一些方面，该重组微生物还包含一种或多种编码一种或多种来自由如下酶组成的组的多肽的异源核酸:(a)丙酮酸脱氢酶(El)、(b) 二氢硫辛酸转乙酰酶和(C) 二氢硫辛酸脱氢酶。在一些方面，通过缺失内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白基因来减弱内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白的活性。在任何本文的方面，该重组微生物与其中丙酮酸脱氢酶活性未受调节的微生物相比产生增加量的乙酰辅酶A。在任何本文的方面，调节丙酮酸脱氢酶的活性导致与丙酮酸脱氢酶表达未受调节的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
[0025]在任何本文的方面，本发明提供重组微生物，其中与尚未为增加流向甲羟戊酸生产的碳通量而对一种或多种来自由如下酶组成的组的酶进行工程改造的微生物相比甲羟戊酸产量增加:(a)柠檬酸合酶、(b)磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶、(C)乳酸脱氢酶、(d)NADP依赖性苹果酸酶和(e)丙酮酸脱羧酶复合物。[0026]在任何本文的方面，本发明提供重组微生物，其中与不在三羧酸(TCA)循环活性条件下培养的微生物相比甲羟戊酸产量增加，其中通过调节一种或多种来自由如下酶组成的组的酶的活性将重组微生物中的代谢碳通量导向甲羟戊酸生产:(a)柠檬酸合酶、(b)磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶、(C)乳酸脱氢酶、(d)苹果酸酶和(e)丙酮酸脱羧酶复合物。
[0027]在任何本文的方面，本发明提供重组微生物，其中该重组微生物选自酵母、细菌、丝状真菌、藻和蓝藻。在一些方面，重组微生物为大肠杆菌。在一些方面,重组微生物为酵母。
[0028]在任何本文的方面，本发明提供重组微生物，其中通过将内源柠檬酸合酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来调节柠檬酸合酶的活性、通过减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性来调节乳酸脱氢酶的活性以及通过减弱内源乙酸激酶基因的活性来调节乙酸激酶的活性。
[0029]在另一个方面，本发明提供使用任何本文所述重组微生物来产生甲羟戊酸的方法。
[0030]在另一个方面，本发明提供使用任何本文所述重组微生物来产生异戊二烯的方法。
[0031]在另一个方面，本发明提供使用任何本文所述重组微生物来产生类异戊二烯前体的方法。
[0032]在另一个方面，本发明提供使用任何本文所述重组微生物来产生类异戊二烯的方法。
【专利附图】

【附图说明】
[0033]图1示出了显示自葡萄糖产生甲羟戊酸的质量产率的图。误差条代表两次重复的标准偏差。
[0034]图2示出了 pDW34的质粒图谱。
[0035]图3示出了蛋白质印迹，其中显现了来自菌株DW326的MvaE。泳道1_基准标记；泳道2-0.4ug的纯化MvaE ;泳道3-7，来自用0、25、50、100、200uM IPTG诱导的菌株DW326的溶胞产物样品。
[0036]图4示出了用Safestain染色的SDS-PAGE凝胶，其含有:泳道1_基准标记；泳道
2-15-从镍柱洗脱的MvaE蛋白级分的His标签介导的纯化。
[0037]图5示出了大肠杆菌的中心代谢。显示了酶柠檬酸合酶(gltA)、磷酸转乙酰酶(pta)、乙酸激酶(ackA)、乳酸脱氢酶(IdhA)、NADP+-依赖性苹果酸酶(maeB)和丙酮酸脱氢酶复合物(Pdh)。
[0038]图6 示出了菌株 MD09-314、CMP451、CMP452 和 CMP453 的柠檬酸合酶。
[0039]图7 示出了菌株 CMP694、CMP678、CMP680、CMP736 和 CMP832 的生长曲线。在 t =2时添加IOOuM IPTG0绘出了随时间变化的在600nm下的吸光度(EFT =经过的发酵时间(h))。
[0040]图8示出了在对菌株CMP694、CMP832、CMP678、CMP680和CMP736进行摇瓶发酵后从10g/L葡萄糖获得的甲羟戊酸的浓度(g/L)。
[0041]图9示出了大肠杆菌BL21中基因maeB的基因组局部上下文(local context)。[0042]图10示出了大肠杆菌K-12中的丙酮酸脱氢酶复合物(pdhR-aceEF-lpd)的基因组局部上下文。
[0043]图11示出了 aceE基因上游的PL 6启动子插入物。
[0044]图12示出了用于在aceE基因上游插入PL.6启动子的构建体设计。
[0045]图13 示出了菌株 CMP678、MD10-555、CMP711 和 CMP729 的生长曲线。在 t = 2 时添加IOOuM IPTG。绘出了随时间变化的在600nm下的吸光度(EFF=经过的发酵时间(h))。
[0046]图14示出了在对菌株CMP678、MD1-555、CMP711和CMP729进行摇瓶发酵后从IOg/L葡萄糖获得的甲羟戊酸的浓度(g/L)。
[0047]图15示出了随时间推移在15L发酵中1.2gltA菌株(空心正方形)与亲本菌株(实心菱形)相比的从葡萄糖产生异戊二烯的产率。菌株在相同的条件下运行。使用下式计算总产率:从葡萄糖产生的重量产率百分比=异戊二烯总量(t)/[(料Wt (O)-料Wt (t) +50) *0.57)]，其中0.57为葡萄糖料液中葡萄糖的重量百分比，50为在t=O时分批供料进发酵罐中的该进料的克数。(20100278:菌株CMP457(空心正方形)；Gil.2gltA20100131:菌株 MD09-317 (黑色菱形)野生型 gltA)。
[0048]图16示出了随时间推移在15L发酵中1.2gltA菌株(空心正方形)与亲本菌株(实心菱形)相比的滴度。菌株在相同的条件下运行。(20100278:菌株CMP457(空心正方形)；GI1.2gltA20100131:菌株 MD09-317 (黑色菱形)野生型 gltA)。
[0049]图17示出了随时间推移在15L发酵中1.2gltA菌株(空心正方形)与亲本菌株(实心菱形)相比的体积生产率。菌株在相同的条件下运行。(20100278:菌株CMP457(空心正方形);GI1.2gltA20100131:菌株MD09-317(黑色菱形)野生型gltA)。
[0050]图18示出了随时间推移在15L发酵中1.2gltA菌株(空心正方形)与亲本菌株(实心菱形)相比的细胞生产力指数。菌株在相同的条件下运行。(20100278:菌株CMP457 (空心正方形);GI1.2gltA20100131:菌株MD09-317(黑色菱形)野生型gltA)。细胞性能指数(CPI):异戊二烯克数/DCW平均克数=[总HG/[0D*发酵液重量/1.05)/2.7]，其中1.05为假定的发酵液比重(kg/L)，2.7的单位为0D*L/gDCW。
[0051]图19示出了随时间推移在15L发酵中1.2gltA菌株(空心正方形)与亲本(实心菱形)相比的从葡萄糖产生甲羟戊酸的产率。菌株在相同的条件下运行。(20100916:菌株CMP678 (空心正方形);GI 1.2gltA (20100154:菌株MCM1002(黑色菱形)野生型gltA)。使用下式计算总产率:从葡萄糖产生的重量产率百分比=甲羟戊酸总量(t) / [(料Wt (O)-料Wt (t) +50) *0.59)]，其中0.59为葡萄糖料液中葡萄糖的重量分数，50为在t = O时分批供料进发酵罐中的该进料的克数。
[0052]图20示出了随时间推移在15L发酵中1.2gltA菌株(空心正方形)与亲本(实心菱形)相比的从葡萄糖产生甲羟戊酸的细胞生产力指数(CPI)。在这些实验中未直接测量干细胞重量，而是使用经验确定的光密度与干细胞重量的换算系数。该0D/DCW系数在相同培养基配制物中的类似大肠杆菌BL21宿主中产生。菌株在相同的条件下运行。(20100916:菌株 CMP678(空心正方形)；GI1.2gltA (20100154:菌株 MCM1002 (黑色菱形)野生型gltA)。
[0053]图21示出了随时间推移在15L发酵中1.2gltA菌株(空心正方形)与亲本(实心菱形)相比的甲羟戊酸的体积生产率。菌株在相同的条件下运行。(20100916:菌株CMP678 (空心正方形);GI 1.2gltA (20100154:菌株 MCM1002(黑色菱形)野生型 gltA)。
[0054]图22示出了随时间推移在15L发酵中1.2gltA菌株(空心正方形)与亲本(实心菱形)相比的甲羟戊酸发酵液滴度。菌株在相同的条件下运行。(20100916:菌株CMP678(空心正方形);GI 1.2gltA (20100154:菌株MCM1002(黑色菱形)野生型gltA)。
[0055]图23示出了随时间推移在15L发酵物中1.2gltA菌株(空心正方形)与亲本(实心菱形)相比的从葡萄糖产生甲羟戊酸的细胞生产力指数(CPI)。在这些实验中未直接测量干细胞重量，而是使用经验确定的光密度与干细胞重量的换算系数。该0D/DCW系数在相同培养基配制物中的类似大肠杆菌BL21宿主中产生。下面图表中的菌株以相同条件运行。(20100967:菌株 CMP680(空心三角形)ackA，pta-，Idh-GI1.2gltA ；20100916:菌株〇1^678(空心正方形)611.2gltA ；20100154:菌株MCM1002 (黑色菱形)野生型gltA)。
[0056]图24示出了在15L发酵中在36小时时“三联”宿主(CMP680，空心三角形)与1.2gltA菌株(CMP678，空心正方形)相比从葡萄糖产生甲羟戊酸的产率更好并且二者均比亲本(MCM1002，实心菱形)有很大改善。CMP680菌株由于其高的初始产率而值得注意。菌株在相同的条件下运行。(20100967:菌株01^680(空心三角形)&。1^，？七&-，1(111-611.2gltA ；20100916:菌株〇1^678(空心正方形)611.2gltA ；20100154:菌株MCM1002 (黑色菱形)野生型gltA)。
[0057]图25示出了甲羟戊酸的比生产率，其以甲羟戊酸毫克数/升发酵液/小时/光学密度单位(550nm下的吸光度)记录。在15L发酵中“三联”宿主(CMP680，空心三角形)显示与1.2gltA菌株( CMP678，空心正方形)相比O至20小时EFT的比生产率高很多，二者均比亲本(MCM1002，实心菱形)有改善。菌株在相同的条件下运行。(20100967:菌株CMP680(空心三角形)ackA，pta-, ldh-GIl.2gltA ；20100916:菌株 CMP678(空心正方形)Gil.2gltA ；20100154:菌株 MCM1002 (黑色菱形)野生型 gltA)。
[0058]图26示出了甲羟戊酸的体积生产率，其以甲羟戊酸克数/升发酵液/小时经过的发酵时间记录。在15L发酵中“三联”宿主(CMP680，空心三角形)显示与1.2gltA菌株(CMP678，空心正方形)相比体积生产率较低，但二者均比亲本(MCM1002，实心菱形)有改善。菌株在相同的条件下运行。(20100967:菌株CMP680(空心三角形)ackA，pta-, ldh-GIl.2gltA ；20100916:菌株 CMP678 (空心正方形)Gil.2gltA ；20100154:菌株MCM1002 (黑色菱形)野生型gltA)。
[0059]图27显示，与“三联”宿主(CMP680，空心三角形)相比1.2gltA菌株(CMP678，空心正方形)中甲羟戊酸发酵液滴度(或甲羟戊酸发酵液浓度)较高。随时间推移在15L发酵中二者均高于亲本对照(MCM1002，实心菱形)。菌株在相同的条件下运行。(20100967:菌株 CMP680(空心三角形)ackA，pta-, ldh-GIl.2gltA ；20100916:菌株 CMP678(空心正方形)Gil.2gltA ；20100154:菌株 MCM1002 (黑色菱形)野生型 gltA)。
[0060]图28分别示出了 MCM1666和MCM1669菌株中布氏拟甲烷球菌和马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶(MVK)的溶解性。
[0061]图29示出了以小规模进行的工程化大肠杆菌菌株的生长和异戊二烯生产率，该菌株表达大肠杆菌染色体上的布氏拟甲烷球菌甲羟戊酸激酶(A)或马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶(B)。
[0062]图30示出了大肠杆菌15L发酵中马氏甲烷八叠球菌和布氏拟甲烷球菌甲羟戊酸激酶的表达。
[0063]图31示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的自葡萄糖产生异戊二烯的产率。从葡萄糖产生的重量产率百分比=异戊二烯总量(t)/[(料Wt(O)-料fft(t)+83.5)*0.59)]，其中0.59为葡萄糖料液中葡萄糖的重量百分比，83.5为在t_0时分批供料进发酵罐中的该进料的克数。独立地对每次进料测量其重量％。DW708:质粒和染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK (实心菱形)；DW708:质粒和染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK (空心菱形);MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK (实心三角形);MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK (空心三角形)。
[0064]图32示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的自葡萄糖产生异戊二烯的瞬时产率。使用下式计算异戊二烯瞬时产率:异戊二烯瞬时产率(g/g%)=所产生的异戊二烯Urtci)/所消耗的葡萄糖(trO^ioo。DW708:质粒和染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK (实心菱形);DW708:质粒和染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK (空心菱形);MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK(实心三角形)；MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK(空心三角形)。
[0065]图33示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的细胞生产力指数(CPI)。使用下式计算细胞生产力指数(CPI) =CPI =异戊二烯总克数/干细胞重量总克数。DW708:质粒和染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK(实心菱形)；DW708:质粒和染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK(空心菱形)；MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK(实心三角形)；MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK (空心三角形)。
[0066]图34示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的体积生产率。使用下式计算体积生产率:[Σ HGER(t)/1000*68.117) ] / [t_tj，其中求和是从、至t。未纳入罐的周转时间。DW708:质粒和染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK(实心菱形)；DW708:质粒和染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK(空心菱形);MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK(实心三角形)；MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK (空心三角形)。
[0067]图35示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的比生产率。使用下式计算比生产率:比生产率(mg/L/hr/OD) = HgER*68.117g/mol/0D。HgER为异戊二烯放出速率，单位为(mmol/L/hr)。OD =光密度=550nm下的吸光度*在水中的稀释因子。DW708:质粒和染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK (实心菱形)；DW708:质粒和染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK(空心菱形);MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK(实心三角形);MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK (空心三角形)。
[0068]图36示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的自葡萄糖产生异戊二烯的产率。从葡萄糖产生的重量产率百分比=异戊二烯总量(t)/[(料Wt(O)-料fft(t)+83.5)*0.59)]，其中0.59为葡萄糖料液中葡萄糖的重量百分比，83.5为在t = O时分批供料进发酵罐中的该进料的克数。独立地对每次进料测量其重量％。MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK(实心三角形)；MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK(空心三角形)；MCM2126:仅染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK(实心正方形)；MCM2127:仅染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK (星形)。
[0069]图37示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的自葡萄糖产生异戊二烯的瞬时产率。使用下式计算异戊二烯瞬时产率:异戊二烯瞬时产率(g/g%)=所产生的异戊二烯Uftci)/所消耗的葡萄糖(t1-hhlOO。MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK(实心三角形)；MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK(空心三角形)；MCM2126:仅染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK (实心正方形)；MCM2127:仅染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK (星形)。
[0070]图38示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的细胞生产力指数(CPI)。使用下式计算细胞生产力指数(CPI) =CPI =异戊二烯总克数/干细胞重量总克数。MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK(实心三角形)；MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK(空心三角形)；MCM2126:仅染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK(实心正方形)；MCM2127:仅染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK (星形)。
[0071]图39示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的体积生产率。使用下式计算体积生产率:[Σ HGER (t)/1000*68.117) ] / [t_tj，其中求和是从、至t。未纳入罐的周转时间。MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK(实心三角形)；MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK (空心三角形)；MCM2126:仅染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK (实心正方形);MCM2127:仅染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK (星形)。
[0072]图40绘出了随时间推移每个15L发酵中所实现的比生产率。使用下式计算比生产率:比生产率(mg/L/hr/OD) = HgER*68.117g/mol/0D。HgER为异戊二烯放出速率，单位为(mmol/L/hr)。OD =光密度=550nm下的吸光度*在水中的稀释因子。MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK(实心三角形)；MCM2125:仅染色体上的布氏拟甲烷球菌MVK(空心三角形)；MCM2126:仅染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK (实心正方形)；MCM2127:仅染色体上的马氏甲烷八叠球菌MVK (星形)。
[0073]图41示出 了随时间推移每个15L发酵中所实现的自葡萄糖产生异戊二烯的产率。CMP1082(pgl+)由空心三角形示出，而MP1136(pgl_)由实心正方形示出。
[0074]图42示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的自葡萄糖产生异戊二烯的瞬时产率。CMP1082(pgl+)由空心三角形示出，而MP1136(pgl_)由实心正方形示出。
[0075]图43示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的细胞生产力指数(CPI)。CMP1082(pgl+)由空心三角形示出，而MP1136(pgl_)由实心正方形示出。
[0076]图44示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的体积生产率。CMP1082 (pgl+)由空心三角形示出，而MP1136 (pgl-)由实心正方形示出。
[0077]图45示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的比生产率。CMP1082(pgl+)由空心三角形示出，而MP1136 (pgl-)由实心正方形示出。
[0078]图46示出了填充有25mL培养基并在34°C和200rpm下温育的250mLErlenmeyer摇瓶中随时间变化的产异戊二烯培养物的0D600。
[0079]图47示出了随时间变化的产异戊二烯培养物的比生产率(以任意单位)。在34°C和200rpm下在填充有25mL培养基的250mL Erlenmeyer摇瓶中温育培养物。
[0080]图48示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的自葡萄糖产生异戊二烯的产率。从葡萄糖产生的重量产率百分比=异戊二烯总量(t)/[(料Wt(O)-料fft(t)+83.5)*0.59)]，其中0.59为葡萄糖料液中葡萄糖的重量百分比，83.5为在t = O时分批供料进发酵罐中的该进料的克数。独立地对每次进料测量其重量％。CMP1136:野生型ppc启动子(空心三角形)；CMP1237:GI1.2ppc启动子(实心正方形)。[0081]图49示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的自葡萄糖产生异戊二烯的瞬时产率。使用下式计算异戊二烯瞬时产率:异戊二烯瞬时产率(g/g%)=所产生的异戊二烯(t「tQ)/所消耗的葡萄糖(t「tQ)*100。CMP1136:野生型ppc启动子(空心三角形)；CMP1237:GI1.2ppc启动子(实心正方形)。
[0082]图50示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的细胞生产力指数(CPI)。使用下式计算细胞生产力指数(CPI) =CPI =异戊二烯总克数/干细胞重量总克数。CMPl 136:野生型ppc启动子(空心三角形);CMP1237:GI1.2ppc启动子(实心正方形)。
[0083]图51示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的体积生产率。使用下式计算体积生产率:[Σ HGER (t)/1000*68.117)，其中求和是从、至t。未纳入罐的周转时间。CMPl 136:野生型ppc启动子(空心三角形)；CMP1237:GI1.2ppc启动子(实心正方形)。
[0084]图52示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的比生产率。使用下式计算比生产率:比生产率(mg/L/hr/OD) = HgER*68.117g/mol/0D。HgER为异戊二烯放出速率，单位为(mmol/L/hr)。OD =光密度=550nm下的吸光度*在水中的稀释因子。CMPl 136:野生型ppc启动子(空心三角形)；CMP1237:GI1.2ppc启动子(实心正方形)。
[0085]图53示出了大肠杆菌MG1655在FNR周围的基因组组构(来源:GenBank U00096)
[0086]图54示出了填充有25mL培养基并在34°C和200rpm下温育的250mLErlenmeyer摇瓶中随时间变化的产异戊二烯培养物的0D600。
[0087]图55示出了随时间变化的产异戊二烯培养物的比生产率(以任意单位)。在34°C和200rpm下在填充有25mL培养基的250mL Erlenmeyer摇瓶中温育培养物。
[0088]图56示出了填充有25mL培养基并在34°C和50rpm下温育的250mLErIenmeyer摇瓶中随时间变化的产异戊二烯培养物的0D600。
[0089]图57示出了随时间变化的产异戊二烯培养物的比生产率(以任意单位)。在34°C和50rpm下在填充有25mL培养基的250mL Erlenmeyer摇瓶中温育培养物。
[0090]图58示出了随时间变化的产异戊二烯培养物的0D600。
[0091]图59示出了随时间变化的产异戊二烯培养物的比生产率(以任意单位)。
[0092]图60示出了来自CMP457 (产生异戊二烯)和与之比较的MCM1020 (对照菌株)的阵列上的RNA杂交信号。
[0093]图61示出了随时间变化的培养物0D600。
[0094]图62示出了随时间变化的产异戊二烯培养物的比生产率(以任意单位)。
[0095]图63 示出了质粒 pMCM1666-pET24-His-TEV-bMVK 的图谱。
[0096]图64 示出了质粒 pMCM1669-pET24-His-TEV-mMVK(G0)的图谱。
[0097]图65示出了两个顺反子MVK构建体的示意图。
[0098]图66 示出了质粒 pMCM2020-pTrcAlba_bMVK 的图谱。
[0099]图67 示出了质粒 pMCM2095-pTrcAlba_mMVK(del)的图谱。
[0100]图68示出了随时间变化的培养物0D600。
[0101]图69示出了随时间变化的产异戊二烯培养物的比生产率(以任意单位)。
【具体实施方式】[0102]本发明尤其提供了用于增加重组微生物中甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产量的组合物和方法，已对该重组微生物进行了工程改造来增加流向甲羟戊酸生产的碳通量。在一个方面，本发明尤其提供了重组微生物或其子代，包括为增加流向甲羟戊酸生产的碳通量而经工程改造的细胞，其中一种或多种来自由如下组成的组的酶或蛋白质的活性受到调节:(a)柠檬酸合酶；(b)磷酸转乙酰酶；(c)乙酸激酶；(d)乳酸脱氢酶；(e)NADP依赖性苹果酸酶；(f)丙酮酸脱氢酶；(g)6_磷酸葡糖酸内酯酶；(h)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；(i)镁饥饿期间的RssB活性蛋白(RssB activity duringmagnesium starvation protein)的抑制剂；(j)多药外排泵 acrAB-TalC 的 acrA 组分；和(k)延胡索酸盐和硝酸盐还原sRNA(FNR)，在一个方面，本文公开的重组微生物是已经工程改造而异源表达编码一种或多种MVA上游途径多肽的核酸的细胞。在另一个方面，该重组微生物为已经工程改造而异源表达由mvaE和mvaS基因(例如来自微生物格氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、铅黄肠球菌和/或粪肠球菌的mvaE和mvaS基因)编码的多肽的细胞(例如细菌细胞)。设想该重组微生物的任何子代也处于本发明的范围内。
[0103]甲羟戊酸依赖性生物合成途径对于类异戊二烯前体分子二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)和异戊烯焦磷酸盐(IPP)的产生特别重要。甲羟戊酸上游途径的酶经由三个酶促反应将从葡萄糖产生的乙酰辅酶A转化成甲羟戊酸。MVA上游途径基因(例如mvaE和mvaS基因，如来自上述细菌物种的mvaE和mvaS) —起编码具有甲羟戊酸上游途径的酶活性的多肽。不受理论的束缚，据信增加上游甲羟戊酸依赖性生物合成途径中的这三种酶活性的效率和生产率将实质增加甲羟戊酸的细胞内浓度，并因此增加下游类异戊二烯前体分子例如DMAPP和IPP的细胞内浓度。这些菌株产生的甲羟戊酸的产率增加因此对于商业应用是有利的。
[0104]如本文详细描述的，可调节包括柠檬酸合酶、磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、乳酸脱氢酶、苹果酸酶和/或丙酮酸脱氢酶在内的酶途径以增加或降低这些途径中的酶的活性使得更多的碳通量被导向甲羟戊酸生产。对其的调节可增加细胞中流向甲羟戊酸的碳通量的其他因素可包括6-磷酸葡糖酸内酯酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、镁饥饿期间的RssB活性蛋白的抑制剂、多药外排泵acrAB-TalC的acrA组分和延胡索酸盐和硝酸盐还原sRNA。这继而可导致更多的底物用于产生异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯。本专利申请的组合物和方法因而较于此前已在本领域中实践的组合物和方法体现了在可用于增加甲羟戊酸、戊二烯、类异戊二烯前体分子和类异戊二烯的产量的微生物菌株的数目以及在由那些细胞(例如细菌细胞)产生的这些化合物(如甲羟戊酸)的量这两个方面的改善。
[0105]通用技术
[0106]除非另外指明，否则对本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学领域的常规技术，这些技术均为本领域的现有技术。这些技术在以下文献中有完整解释:“Molecular Cloning:A Laboratory Manual (《分子克隆:实验室手册》)”，第二版(Sambrook 等人，1989) ,Oligonucleotide Synthesis (《寡核苷酸合成》)” (M.J.Gait编辑，1984) ;“Animal Cell Culture (《动物细胞培养》)” (R.1.Freshney编辑，1987) ,Methods in Enzymology (《酶学方法》)”(美国学术出版社(Academic Press, Inc.)) ；uCurrent Protocols in Molecular Biology (《现代分子生物学实验技术》)”(F.M.Ausubel等人编辑，1987，以及定期更新版本);“PCR:The PolvmeraseChain Reaction(《PCR:聚合酶链反应》)”，(Mullis 等人编辑，1994)。Singleton 等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.(《微生物学和分子生物学词典第二版》)，约翰威立父子出版公司(J.Wiley&Sons)(纽约1994年)以及March,Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure4th ed.(〈〈高级有机化学反应、机理和结构，第四版》)，约翰威立父子出版公司(纽约1992年)，为本领域技术人员提供了关于本申请中所用的许多术语的一般性指导。
[0107]
[0108]术语“完整的甲羟戊酸(MVA)途径”或“整个甲羟戊酸(MVA)途径”是指将乙酰辅酶A转化为二甲基烯丙基焦磷酸盐(DMAPP)和异戊烯焦磷酸(IPP)以及通过酶乙酰乙酰辅酶A合酶(如硫解酶)、3_羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A合酶、3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)和异戊烯二磷酸异构酶(IDI)催化的细胞代谢途径。
[0109]如本文所用，术语“甲羟戊酸上游途径”或“MVA上游途径”是指细胞中由酶乙酰乙酰辅酶A合酶(如硫解酶)、3_羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A合酶和3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A还原酶催化的一系列反应。
[0110]术语“甲羟戊酸下游途径”或“MVA下游途径”是指细胞中由酶甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)和异戊烯二磷酸异构酶(IDI)催化的一系列反应。
[0111]术语“异戍 二稀”是指2-甲基-1, 3-丁二稀(CAS#78-79-5)。其可以是由3，3- _.甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)消除焦磷酸所得的直接和最终的挥发性C5烃产物。其可能不涉及IPP分子与DMAPP分子的连接或聚合。除非本文中另外指明，否则术语“异戊二烯”通常不旨在受其产生方法的限制。
[0112]如本文所用，术语“多肽”包括多肽、蛋白质、肽、多肽片段和融合多肽。
[0113]如本文所用，“分离的多肽”不是多肽文库(如2种、5种、10种、20种、50种或更多种不同多肽的文库)的一部分，并且与和其一起存在于自然界中的至少一种组分分离。分离的多肽可例如通过编码该多肽的重组核酸的表达来获得。
[0114]所谓“异源多肽”意指由衍生自其他生物体、物种或菌株而非宿主细胞的核酸序列编码的多肽。在一些实施例中，异源多肽不同于存在于自然界中相同宿主细胞内的野生型多肽。
[0115]如本文所使用，“核酸”是指单股或双股形式的共价连接在一起的两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。
[0116]所谓“重组核酸”意指这样的所关注核酸，其缺少在该所关注核酸旁侧的、所关注核酸所源自的有机体的天然存在的基因组中的一种或多种核酸(例如基因)。因此，该术语包括(例如)掺入载体中、掺入自主复制型质粒或病毒中或掺入原核生物或真核生物的基因组DNA中，或者独立于其他序列作为单独的分子(例如，cDNA、基因组DNA片段或通过PCR或限制性核酸内切酶消化产生的cDNA片段)存在的重组DNA。
[0117]所谓“异源核酸”意指衍生自其他生物体、物种或菌株而非宿主细胞的核酸序列。在一些实施例中，异源核酸不同于存在于自然界中的相同宿主细胞内存在的野生型核酸。例如，转化进或整合进大肠杆菌染色体中的由mvaE和mvaS基因(例如但不限于来自格氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌的mvaE和mvaS基因)编码的核酸是异源核酸。
[0118]如本文所用，“表达控制序列”意指引导所关注核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以为启动子(例如组成型或诱导型启动子)或增强子。表达控制序列可以是“天然的”或异源的。天然的表达控制序列衍生自与所表达基因相同的生物体、物种或株系。异源表达控制序列衍生自与所表达基因不同的生物体、物种或株系。“诱导型启动子”是在环境或发育调节下具有活性的启动子。
[0119]所谓“有效连接的”意指核酸表达控制序列(例如启动子)与第二核酸序列之间的功能性连接，其中该表达控制序列引导对应于该第二序列的核酸的转录。
[0120]如本文所用，术语“基本培养基”是指含有细胞生长可能所需的最少营养物、通常不存在氨基酸的培养基。基本培养基通常含有:(I)用于微生物(如细菌)生长的碳源；(2)各种盐，其可因微生物(如细菌)物种和生长条件而变动；和⑶水。从简单的糖如葡萄糖到其他生物质的较复杂水解产物如酵母提取物，碳源可以有很大变化，如下文更详细论述的。盐通常提供必需元素如镁、氮、磷和硫以允许细胞合成蛋白质和核酸。基本培养基还可补充有选择剂，例如抗生素，以针对某些质粒的维持等进行选择。例如，如果微生物对某一抗生素例如氨苄青霉素或四环素具有抗性，则可将该抗生素添加至培养基以便防止缺乏该抗性的细胞生长。培养基可在必要时补充有其他化合物以选择所需的生理或生化特性，例如特定的氨基酸等。
[0121]如本文所用， 术语“类异戊二烯”是指数量大且多样的一类天然存在的一类有机化合物，其由两个或更多个烃单元构成，每个单元由以特定模式排列的五个碳原子组成。如本文所用，明确地将“异戊二烯”从“类异戊二烯”的定义中排除。
[0122]如本文所用，术语“萜类化合物”是指数量大且多样的一类有机分子，该分子衍生自以多种方式组装和修饰并且根据组成员中所用的类异戊二烯单元的数目分组的五碳类异戊二烯单元。半萜类化合物具有一个类异戊二烯单元。单萜类化合物具有两个类异戊二烯单元。倍半萜类化合物具有三个类异戊二烯单元。二萜类化合物具有四个异戊二烯单元。二倍半萜类具有五个异戊二烯单元。三萜类化合物具有六个类异戊二烯单元。四萜类化合物具有八个类异戊二烯单元。多萜类化合物具有超过八个类异戊二烯单元。
[0123]如本文所用，“类异戊二烯前体”是指生物体用于萜类化合物或类异戊二烯的生物合成的任何分子。类异戊二烯前体分子的非限制性例子包括例如异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。
[0124]如本文所用，术语“质量产率”是指细胞(例如细菌细胞)所产生的产物的质量除以细胞(例如细菌细胞)所耗费的葡萄糖的质量乘以100。
[0125]所谓“比生产率”，其意指细胞(例如细菌细胞)所产生的产物的质量除以产生产物的时间、细胞密度和培养物体积。
[0126]所谓“滴度”，其意指细胞(例如细菌细胞)所产生的产物的质量除以培养物的体积。
[0127]如本文所用，术语“细胞生产力指数(CPI) ”是指细胞(例如细菌细胞)所产生的产物的质量除以培养物中产生的细胞(例如细菌细胞)的质量。
[0128]除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的含义相同的含义。
[0129]如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。
[0130]在本说明书通篇中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，就如同此类较低数值限度在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，就如同此类上限值在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一个较窄数值范围，就如同此类较窄数值范围在本文中全部明确地写出一样。
[0131]能够增加甲羟戊酸的产暈的重组细胞(例如细菌细胞)
[0132]甲羟戊酸依赖性生物合成途径(MVA途径)是所有高等真核生物和某些细菌中存在的关键代谢途径。除了对蛋白质异戊二烯化、细胞膜维持、蛋白质锚定和N-糖基化等各种各样的过程中所用的分子的产生是重要的外，甲羟戊酸途径还提供类异戊二烯前体分子DMAPP和IPP的主要来源，这些分子充当萜烯、萜类化合物、类异戊二烯和异戊二烯的生物合成的基础。
[0133]在MVA途径的上游部分中，分子代谢期间所产生的乙酰辅酶A经由具有硫解酶、HMG-CoA还原酶和HMG-CoA合酶酶活性的多肽的作用转化为甲羟戊酸。首先，乙酰辅酶A经由硫解酶的作用转化为乙酰乙酰辅酶A。接着，乙酰乙酰辅酶A通过HMG-CoA合酶的酶促作用转化为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)。该辅酶A衍生物通过HMG-CoA还原酶还原成甲羟戊酸，这是产生类异戊二烯的甲羟戊酸途径的限速步骤。甲羟戊酸然后经由甲羟戊酸激酶的作用转化为甲羟戊酸-5-磷酸，其随后通过磷酸甲羟戊酸激酶的酶活性转化为甲羟戊酸-5-焦磷酸。最后，通过酶甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧酶的活性由甲羟戊酸-5-焦磷酸形成IPP。
[0134]在一些方面，调节任何本文提及的酶可影响该酶的表达(如转录或翻译)、产量、翻译后修饰或任何其他功能。在一些实施例中，与尚未为这种调节而进行工程改造的细胞相比，重组细胞中的酶的功能(如催化能力)增加或降低。在一个实施例中，与尚未经工程改造的细胞相比，酶的功能(如活性)增加。在另一个实施例中，与尚未经工程改造的细胞相比，酶的功能(如活性)降低。
[0135]柠檬酸合酶途径
[0136]柠檬酸合酶催化草酰乙酸和乙酰辅酶A的缩合以形成柠檬酸，其为三羧酸(TCA)循环的代谢物(Ner, S.等人，1983.Biochemistry (《生物化学》)，22:5243-5249 ;Bhayana,V.和 Duckworth, H.1984.Biochemistry (《生物化学》)23 =2900-2905)(图 5)。在大肠杆菌中，这种由gltA编码的酶在表现上与二聚亚基的三聚体相似。该六聚体形式允许该酶由NADH 别构调节。该酶已得到了广泛研究(Wiegand, G.和 Remington, S.1986.Annual Rev.Biophysics Biophys.Chem.(《生物物理和生物物理化学年鉴》)15:97-117 ;Duckworth等人，1987.Biochem Soc Symup.(《生物化学协会文集》)54:83-92 ;Stockell，D.等人，2003.T.Biol.Chem.(《牛.物化学杂志》)278:35435-43 ；Maurus, R.等人，2003.Biochemistry (《生物化学》).42:5555-5565)。为了避免NADH的别构抑制，已考虑用枯草芽孢杆菌NADH非敏感型朽1樣酸合酶进行替换或补充(Underwood等人,2002.Appl.Environ.Microbiol.(《应用和环境微生物学》)68:1071-1081 ;Sanchez 等人，2005.Met.Eng.(《代谢工程》)7:229-239)。[0137]由柠檬酸合酶催化的反应直接与催化甲羟戊酸途径的第一个步骤的硫解酶竞争，因为它们都以乙酰辅酶A作为底物(Hedl等人，2002.J.Bact.(《细菌学杂志》)184:2116-2122)。因此，本领域的技术人员可调节柠檬酸合酶的表达(如，降低酶活性)以允许更多的碳通量进入甲羟戊酸途径，从而增加甲羟戊酸、异戊二烯和类异戊二烯的最终产量。柠檬酸合酶活性降低可以是与未进行操纵时相比，比活性或总活性降低任何量。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%,25%,30%,35%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%、95%、96%、97%、98%或99%。在一些方面，通过降低内源柠檬酸合酶基因的活性来调节柠檬酸合酶的活性。这可通过用编码NADH非敏感型柠檬酸合酶的转基因对内源柠檬酸合酶基因进行染色体置换或通过使用衍生自枯草芽孢杆菌的编码NADH非敏感型柠檬酸合酶的转基因来实现。还可通过将内源柠檬酸合酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来调节(如降低)柠檬酸合酶的活性。在另一个方面，柠檬酸合酶活性的降低可导致与柠檬酸合酶的表达不降低的微生物相比，更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。[0138]涉及磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的途径
[0139]憐酸转乙酸酶(pta)(Shimizu 等人，1969.Biochim.Biophys.Acta (《生物化学与生物物理学学报》)191 =550-558)催化乙酰辅酶A与乙酰磷酸(乙酰基-P)之间的可逆转化，而乙酸激酶(ackA) (Kakuda, H.等人，1994.J.Biochem.(《生物化学杂志》)，11 =916-922)使用乙酰基-P来形成乙酸。这些基因可在大肠杆菌中作为一个操纵子转录。它们一起催化乙酸的异化，同时释放ATP。因此，本领域的技术人员可通过降低磷酸转乙酰酶基因(如内源磷酸转乙酰酶基因)和/或乙酸激酶基因(如内源乙酸激酶基因)的活性而增加可用乙酰辅酶A的量。一种实现降低的方式是通过缺失磷酸转乙酰酶(pta)和/或乙酸激酶(ackA)。这可通过如下方式实现:将一个或两个基因替换为氯霉素表达盒，然后将该盒环出(looping out) ο乙酸由大肠杆菌因多种原因而产生(Wolfe, A.2005.Microb.Mol.Biol.Rev.(《微生物学与分子生物学评论》)69:12-50)。不受理论的约束，由于ackA-pta利用乙酰辅酶A，因此缺失那些基因可能使碳不转向乙酸并从而增加甲羟戊酸、异戊二烯或类异戊二烯的产率。
[0140]在一些方面，重组微生物与内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的表达不减弱的微生物相比产生降低量的乙酸。所产生的乙酸的量的降低可通过本领域技术人员已知的常规测定法进行测量。乙酸减少的量与未进行分子操纵时相比为至少约1%、2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10% ,15%,20%,25%,30%,35%,35%,40%,45%,50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0141]磷酸转乙酰酶(pta)和/或乙酸激酶(ackA)的活性还可通过对酶进行其他分子操纵来降低。酶活性降低可以是与未进行操纵时相比，比活性或总活性降低任何量。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%,25%,30%,35%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0142]在一些情况下，降低内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的活性导致与内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的表达不减弱的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
[0143]涉及乳酸脱氢酶的途径
[0144]在大肠杆菌中，D-乳酸通过酶乳酸脱氢酶(IdhA-图5)由丙酮酸产生(Bunch,P.等人，1997.Microbiol.(《微生物学》)143:187-195)。乳酸的产生伴随NADH的氧化，因此，当氧被限制并且无法适应所有还原当量时，将产生乳酸。因此，乳酸的产生可能是碳消耗源。这样，为了改善通向甲羟戊酸生产(以及异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯生产，如果需要的话)的碳流量，本领域技术人员可调节乳酸脱氢酶的活性，例如通过降低该酶的活性来调节。
[0145]因此，在一个方面，可通过降低内源乳酸脱氢酶基因的活性来调节乳酸脱氢酶的活性。这种降低可通过缺失内源乳酸脱氢酶基因来实现。也可以使用本领域技术人员已知的减弱乳酸脱氢酶基因活性的其他方式。通过操纵涉及乳酸脱氢酶的途径，重组微生物与内源乳酸脱氢酶基因的表达不减弱的微生物相比产生降低量的乳酸。所产生乳酸的量的降低可通过本领域技术人员已知的常规测定法测量。乳酸减少的量与未进行分子操纵时相比为至少约 I %>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或 99%。
[0146]乳酸脱氢酶的活性还可以通过对酶进行其他分子操纵来降低。酶活性降低可以是与未进行操纵时相比，比活 性或总活性降低任何量。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约 I2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,35%,40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或99%。
[0147]因此，在一些情况下，减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性导致与内源乳酸脱氢酶基因表达不减弱的微生物相比，更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
[0148]涉及苹果酸酶的途径
[0149]苹果酸酶(在大肠杆菌中，为sfcA和maeB)是通过如下方程式催化苹果酸转化成丙酮酸(利用NAD+或NADP+)的回补酶:
[0150]
(S)-苹果酸+ NAD(P)+#__.+ CO2 + NAD(P)H
[0151]因此，该酶的两种底物为(S)-苹果酸和NAD (P)+，而其三种产物为丙酮酸、CO2和NADPH0
[0152]NADP依赖性苹果酸酶(maeB-图5)的表达(Iwikura等人，1979.J.Biochem.(《生物化学杂志》)85:1355-1365)可通过如下方式有助于增加甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯产率:1)将碳从TCA循环带回至甲羟戊酸途径的丙酮酸即乙酰辅酶A的直接前体(乙酰辅酶A为甲羟戊酸自身的直接前体)，以及2)产生可用于HMG-CoA还原酶反应的额外 NADPH (0h，MK 等人，(2002) J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)277:13175-13183)；Bologna, F.等人(2007) J.Bact.(《细菌学杂志》)189:5937-5946)。
[0153]这样，可通过调节(例如增加)苹果酸酶的活性和/或表达来实现更多的用于下游产生甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的起始底物(丙酮酸和乙酰辅酶A)。NADP依赖性苹果酸酶基因可以是内源基因。实现此目的的一种非限制性方式是将内源NADP依赖性苹果酸酶基因启动子替换为合成的组成型表达启动子。另一种增加酶活性的非限制性方式是通过使用一种或多种编码NADP依赖性苹果酸酶多肽的异源核酸。本领域的技术人员可使用易得的分子生物学技术在发酵或培养过程中监测maeBRNA的表达。
[0154]因此，在一些实施例中，重组微生物与NADP依赖性苹果酸酶基因的表达不增加的微生物相比产生增加量的丙酮酸。在一些方面，增加NADP依赖性苹果酸酶基因的活性导致与NADP依赖性苹果酸酶基因表达不增加的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
[0155]所产生丙酮酸的量的增加可通过本领域技术人员已知的常规测定法测量。丙酮酸增加的量与未进行分子操纵时相比可为至少约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10% ,15%,20%,25%,30%,35%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0156]苹果酸酶的活性还可以通过对酶进行其他分子操纵来增加。酶活性增加可以是与尚未进行操纵时相比，比活性或总活性增加任何量。在一些情况下，酶活性的增加为至少约I 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,35%,40%,45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0157]涉及丙酮酸脱氢酶复合物的途径
[0158]催化丙酮酸脱羧成乙酰辅酶A的丙酮酸脱氢酶复合物由基因aceE、aceF和IpdA编码的蛋白质构成。那些基因的转录由数种调节因子调节。因此，本领域的技术人员可通过调节丙酮酸脱氢酶复合物的活性来增加乙酰辅酶A。调节可以是增加丙酮酸脱氢酶复合物的活性和/或表达(例如，恒定表达)。这可通过不同的方式实现，例如通过在操纵子前设置强组成型启动子如 PL.6 (aattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtg-λ启动子，GenBank NC_001416)，或使用一个或多个合成的组成型表达启动子。
[0159]因此，在一个方面，丙酮酸脱氢酶的活性通过增加丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因的活性来调节，所述丙酮酸脱氢酶复合物由如下组成:(a)丙酮酸脱氢酶(E1)，(b) 二氢硫辛酸转乙酰酶和(c) 二氢硫辛酸脱氢酶。应当理解，可操纵这些基因中的任何一种、两种或三种以增加丙酮酸脱氢酶的活性。在另一方面，可通过减弱内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白基因的活性来调节丙酮酸脱氢酶复合物的活性，下文进一步进行了详细描述。内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白的活性可通过缺失内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白基因来减弱。
[0160]在一些情况下，丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因为内源基因。增加丙酮酸脱氢酶复合物活性的另一种方式是通过向微生物引入一种或多种编码一种或多种来自由如下酶组成的组的多肽的异源核酸:(a)丙酮酸脱氢酶(El)，(b) 二氢硫辛酸转乙酰酶和(C) 二氢硫辛酸脱氢酶。
[0161]通过使用任何这些方法，重组微生物与其中丙酮酸脱氢酶活性未受调节的微生物相比可产生增加量的乙酰辅酶。调节丙酮酸脱氢酶活性可导致与丙酮酸脱氢酶表达未受调节的微生物相比，更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
_2] 突变的组合
[0163]应当理解，对于本文所述的任何酶和/或酶途径，明确地设想调节本文所述的酶和/或酶途径(如其中两者、三者、四者、五者或六者)的任何组合的分子操纵。为了便于对组合进行表述，柠檬酸合酶(gltA)定为A,磷酸转乙酰酶(ptab)定为B,乙酸激酶(ackA)定为C,乳酸脱氢酶(IdhA)定为D,苹果酸酶(sfcA或maeB)定为E,丙酮酸脱羧酶(aceE、aceF和/或IpdA)定为F, 6-磷酸葡糖酸内酯酶(ybhE)定为G,磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppi)定为H。如上所述，丙酮酸脱羧酶复合物的aceE、aceF和/或IpdA酶可单个地使用、或三种酶中的两种或三种酶中的三种一起使用，以增加丙酮酸脱羧酶活性。
[0164]因此，对于酶A-H的任何两种的组合，可以使用的非限制性组合为:AB、AC、AD、AE、AF、AG、AH、BC、BD、BE、BF、BG、BH、CD、CE、CF、CG、CH、DE、DF、DG、DH、EF、EG、EH 和 GH。对于酶A-H的任何三种的组合，可以使用的非限制性组合为:ABC、ABD、ABE、ABF、ABG, ABH、BCD、BCE、BCF, BCG、BCH、CDE、CDF、CDG、CDH、DEF, DEH、ACD、ACE、ACF, ACG, ACH、ADE, ADF, ADG,ADH、AEF、AEG、AEH、BDE, BDF、BDG, BDH、BEF、BEG、BEH、CEF、CEG, CEH、CFG、CFH 和 CGH。对于酶A-H的任何四种的组合，可以使用的非限制性组合为:ABCD、ABCE, ABCF, ABCG, ABCH、ABDE、ABDF、ABDG,ABDH、ABEF,ABEG,ABEH、BCDE、BCDF、BCDG、BCDH、CDEF、CDEG、CDEH、ACDE、ACDF、ACDG、ACDH、ACEF、ACEG, ACEH、BCEF, BDEF, BGEF, BHEF, ADEF。对于酶 A-H 的任何五种的组合，可以使用的非限制性组合为:ABCDE、ABCDF、ABCDG、ABCDH、ABDEF, ABDEG, ABDEH、BCDEF、BCDEG、BCDH1、ACDEF、ACDEG、ACEDH、ABCEF、ABCEG 和 ABCEH。对于酶 A-H 的任何六种的组合，可以使用的非限制性组合为:AB⑶EF、AB⑶EG、AB⑶H!、B⑶EFG、B⑶Ei7H和⑶EFGH。对于酶A-H的任何七种的组合，可以使用的非限制性组合为:AB⑶EFG、AB⑶EFH、B⑶EFGH。在另一方面，使用所有 八种酶的组合AB⑶EFGH。
[0165]因此，与不在三羧酸(TCA)循环活性条件下培养的微生物相比本文所述的重组微生物可实现增加的甲羟戊酸产量，其中重组微生物中的代谢碳通量通过调节一种或多种来自由如下酶组成的组的酶的活性而被导向甲羟戊酸生产:(a)柠檬酸合酶，(b)磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶，(C)乳酸脱氢酶，(d)苹果酸酶和(e)丙酮酸脱羧酶复合物。
[0166]用于增加产暈的其他调节因子和因素
[0167]可将其他分子操纵用于增加流向甲羟戊酸生产的碳流量。一种方法是减少、降低或消除供料进甲羟戊酸途径的途径的负调节因子的影响。例如，在一些情况下，基因aceEF-lpdA与第四个上游基因pdhR处于操纵子中。pdhR是其操纵子转录的负调节因子。在不存在丙酮酸的情况下，它结合其靶启动子并抑制转录。其还以相同的方式调节ndh和cyoABCD(Ogasawara，H.等人，2007.nBact.(《细菌学杂志》)189:5534-5541)。在一个方面，缺失pdhR调节因子可提高甲羟戊酸的供应，并因而提高甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的产量。
[0168]在其他方面，将6-磷酸葡糖酸内酯酶(PGL)引入缺少PGL的微生物(例如多种大肠杆菌菌株)可用于提高甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的产量。PGL可使用染色体整合或染色体外载体(如质粒)而引入。在其他方面，可从表达PGL的细胞(例如，微生物，如多种大肠杆菌菌株)的基因组缺失PGL，以提高甲羟戊酸和/或异戊二烯的产量。在另一个方面，可在不内源表达PGL的细胞中表达编码PGL多肽的异源核酸。在一些方面，缺失PGL导致与表达PGL的微生物相比异戊二烯百分比产率高出约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中的任一者，包括这些百分数，例如这些百分数之间的任何值。在其他方面，缺失PGL导致与表达PGL的微生物相比异戊二烯瞬时百分比产率高出约 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100%中的任一者，包括这些百分数以及这些百分数之间的任何值。在其他方面，缺失PGL导致与表达PGL的微生物相比针对异戊二烯的细胞生产力指数高出约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中的任一者，包括这些百分数以及这些百分数之间的任何值。在其他方面，缺失PGL导致与表达PGL的微生物相比异戊二烯的体积生产率高出约10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 %中的任一者，包括这些百分数以及这些百分数之间的任何值。在其他方面，缺失PGL导致与表达PGL的微生物相比异戊二烯的峰值比产力高出约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100 % 中的任一者，包括这些百分数以及这些百分数之间的任何值。在一些方面，缺失PGL导致与表达PGL的微生物相比峰值比生产率维持较长的一段时间。
[0169]在另一个方面，调节磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(大肠杆菌中的ppc)基因表达可用于提高任何本文所公开的细胞中甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的产量。在一个方面，可通过将PPC基因的启动子序列替换为导致与野生型细胞相比PPC基因表达降低的另一启动子来降低磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因表达。在一些方面，与野生型细胞相比，PPC 基因表达可降低约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 100%中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在一些方面，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表达降低导致与以野生型水平表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的微生物相比，异戊二烯百分比产率高出约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中的任一者，包括这些百分数，例如这些百分数之间的任何值。在其他方面，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表达降低导致与以野生型水平表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的微生物相比，异戊二烯的瞬时百分比产率高出约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在其他方面，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表达降低导致与以野生型水平表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的微生物相比，异戊二烯的细胞生产力指数高出约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在其他方面，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表达降低导致与以野生型水平表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的微生物相比，异戊二烯的体积生产率超出约 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100% 中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在其他方面，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表达降低导致与以野生型水平表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的微生物相比，异戊二烯的峰值比生产率高出约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在一些方面，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表达降低导致与以野生型水平表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的微生物相比，峰值比生产率维持较长的一段时间。
[0170] 在另一个方面，调节镁饥饿期间的RssB活性的抑制剂(大肠杆菌中的iraM)基因表达可用于提高任何本文所公开的细胞中甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的产量。在一个方面，可通过将iraM基因的启动子序列替换为导致与野生型细胞相比iraM基因表达增加的另一启动子来增加iraM的基因表达。在一些方面，与野生型细胞相比，iraM 基因表达可增加约 10% ,20% ,30% ,40% ,50% ,60% ,70% ,80% ,90%^； 100% 中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在一些方面，iraM基因表达增加导致与以野生型水平表达iraM基因的微生物相比，异戊二烯的百分比产率高出约10%、20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100% 中的任一者，包括这些百分数，例如这些百分数之间的任何值。在其他方面，iraM基因表达增加导致与以野生型水平表达iraM基因的微生物相比，异戊二烯的瞬时百分比产率高出约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在其他方面，iraM基因表达增加导致与以野生型水平表达iraM基因的微生物相比，异戊二烯的细胞生产力指数高出约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在其他方面，iraM基因表达增加导致与以野生型水平表达iraM基因的微生物相比，异戊二烯的体积生产率高出约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100 %中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在其他方面，iraM基因表达增加导致与以野生型水平表达iraM基因的微生物相比，异戊二烯的峰值比生产率高出约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在一些方面，iraM基因表达增加导致与以野生型水平表达iraM基因的微生物相比，峰值比生产率维持较长的一段时间。
[0171]在另一个方面,调节多药外排泵acrAB-TolC中的acrA组分(大肠杆菌中的acta)的基因表达可用于提高任何本文所公开的细胞中甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的产量。在一个方面，可通过将acta基因的启动子序列替换为导致与野生型细胞相比acta基因表达降低的另一启动子来降低acta的基因表达。在一些方面，与野生型细胞相比，acta 基因表达可降低约 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^；100%中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在另一个方面，可例如通过缺失细胞基因组中的acta基因，使得其不再产生功能性acta蛋白，来完全消除acta的表达。在一些方面，缺失acta基因或降低其表达导致与以野生型水平表达acta基因的微生物相比，异戊二烯的百分比产率高出约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中的任一者，包括这些百分数，例如这些百分数之间的任何值。在其他方面，缺失acta基因或降低其表达导致与以野生型水平表达acta基因的微生物相比，异戊二烯的瞬时百分比产率高出约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在其他方面，缺失acta基因或降低其表达导致与以野生型水平表达acta基因的微生物相比，异戊二烯的细胞生产力指数高出约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 100% 中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在其他方面，缺失actA基因或降低其表达导致与以野生型水平表达actA基因的微生物相比，异戊二烯的体积生产率高出约10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 %中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在其他方面，缺失actA基因或降低其表达导致与以野生型水平表达actA基因的微生物相比，异戊二烯的峰值比生产率高出约10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 %中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在一些方面，缺失actA基因或降低其表达导致与以野生型水平表达actA基因的微生物相比，峰值比生产率维持较长的一段时间。
[0172] 在另一个方面，调节FNR DNA结合转录调节因子(FNR)基因表达可用于提高任何本文所公开的细胞中甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的产量。在一个方面，可通过将编码FNR的基因的启动子序列替换为导致与野生型细胞相比FNR表达增加的另一启动子来增加FNR的基因表达。在其他方面，可在不内源表达FNR的细胞中表达编码FNR的异源核酸。在一些方面，与野生型细胞或不内源表达FNR的细胞相比，FNR表达可增加约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 100% 中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在一些方面，FNR表达增加导致与野生型细胞或不内源表达FNR的细胞相比，异戊二烯的百分比产率高出约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中的任一者，包括这些百分数，例如这些百分数之间的任何值。在其他方面，FNR表达增加导致与野生型细胞或不内源表达FNR的细胞相比，异戊二烯的瞬时百分比产率高出约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在其他方面，FNR表达增加导致与野生型细胞或不内源表达FNR的细胞相比，异戊二烯的细胞生产力指数高出约30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 %中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在其他方面，FNR表达增加导致与野生型细胞或不内源表达FNR的细胞相比，异戊二烯的体积生产率高出约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在其他方面，FNR表达增加导致与野生型细胞或不内源表达FNR的细胞相比，异戊二烯的峰值比生产率高出约10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100% 中的任一者，包括这些百分数，包括这些百分数之间的任何值。在一些方面，FNR表达增加导致与野生型细胞或不内源表达FNR的细胞相比，峰值比生产率维持较长的一段时间。
[0173]除了可增加流向甲羟戊酸生产的碳通量的用于调节本文所述的多种酶途径的宿主细胞(如微生物)突变之外，可将表达一个或多个拷贝的编码MVA上游途径多肽的异源核酸的宿主细胞与该宿主细 胞突变结合使用以增加所需终产物例如甲羟戊酸、戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的产量。在另一实施例中，可将编码来自多个物种的mvaE和mvaS的基因与该宿主细胞突变结合使用以增加所需终产物例如甲羟戊酸、戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的产量。
[0174]此外，可利用来自MVA上游和下游途径的其他酶以及mvaE和mvaS基因产物。MVA途径多肽的非限制性例子包括乙酰辅酶乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽和具有两种或更多种MVA途径多肽的活性的多肽(如融合多肽)。MVA途径多肽可以包括具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性MVA途径核酸包括编码具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性MVA途径多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然多肽和核酸。
[0175]可使用的MVA途径多肽的非限制性例子在国际专利申请公开N0.W02009/076676、W02010/003007 和 W02010/148150 中描述。
[0176]编石马mvaE和mvaS多妝的基因[0177]在一些微生物(例如但不限于格氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、铅黄肠球菌和粪肠球菌)中，mvaE基因编码既具有硫解酶活性又具有HMG-CoA还原酶活性的多肽。事实上，mvaE基因产物代表存在于真细菌中的IPP生物合成的第一双功能酶和融合到另一种天然蛋白质上的HMG-CoA还原酶的第一个例子(Hedl等人，J Bacteriol.(《细菌学杂志》)2002年4月；184(8) =2116-2122) ?另一方面，mvaS基因编码具有HMG-CoA合酶活性的多肽。此前已将一不同细菌物种即粪肠球菌的mvaE和mvaS基因掺入大肠杆菌菌株中以产生甲羟戊酸(参见US2005/0287655A1，将其公开内容以引用的方式并入本文；Tabata，K.和 Hashimoto, S.-1.Biotechnology Letters (《生物技术快讯》)26:1487-1491, 2004)。
[0178]因此，可对细胞(例如细菌细胞，如大肠杆菌)进行工程改造以表达一种或多种mvaE和mvaS基因(例如但不限于来自格氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、铅黄肠球菌和/或粪肠球菌的mvaE和mvaS基因)，以增加甲羟戊酸的产量、峰值滴度和细胞生产率。可以在多拷贝质粒上表达该一种或多种mvaE和mvaS基因。质粒可以是闻拷贝质粒、低拷贝质粒或中等拷贝质粒。或者，可以将一个或多个mvaE和mvaS基因整合进宿主细胞的染色体中。对于一种或多种mvaE和mvaS基因在质粒上或作为宿主细胞染色体的整合部分的两种异源表达而言，可以用诱导型启动子或组成型表达启动子驱动基因的表达。启动子可以是该一种或多种mvaE和mvaS基因的表达的强驱动子，可以是表达的弱驱动子，或可以是表达的中等驱动子。
[0179]任何编码MVA上游途径的基因均可用于本发明。在某些实施例中，单独的mvaE和mvaS基因(例如但不限于来自格氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、铅黄肠球菌和/或粪肠球菌的mvaE和mvaS基因)或所述基因与编码来自MVA上游途径的蛋白质的一种或多种其他mvaE和mvaS基因相结合的多个选项设想处于本发明的范围内。因而，在某些方面，可以任何上文所述方式在细胞(例如细菌细胞)中表达表1中设想的任何基因组合。
[0180] 表1:设想用于本发明的在宿主细胞中表汰mvaE矛口 mvaS基因的诛.顶。
[0181]
【权利要求】
1.一种能够增加异戊二烯的产量的重组细胞，其中为了增加流向异戊二烯生产的碳通量而对所述细胞进行工程改造使得一种或多种来自由如下酶组成的组的酶的活性受到调节: (a)柠檬酸合酶、 (b)磷酸转乙酰酶、 (C)乙酸激酶、 (d)乳酸脱氢酶、 (e)苹果酸脱氢酶、 (f)丙酮酸脱氢酶、 (g)磷酸葡糖酸内酯酶和 (h)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶， 并且其中所述细胞还包含⑴一种或多种编码一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽的核酸和(ii) 一种或多种编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸；并且其中与尚未为增加流向异戊二烯的碳通量而进行程改造的产异戊二烯细胞相比，所述细胞产生增加量的异戊二烯。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述一种或多种编码MVA途径多肽的核酸来自MVA上游途径，其中所述MVA上游途径核酸选自AA-CoA硫解酶核酸、HMG-CoA合酶核酸和HMG-CoA还原酶核酸。
3.根据权利要求2所述的细胞，其中所述一种或多种编码甲羟戊酸(MVA)上游途径多肽的核酸为mvaE基因和mvaS基因。
4.根据权利要求3所述的细胞,其中所述mvaE基因和所述mvaS基因选自:(a)来自格氏李斯特菌(Listeria grayi)的mvaE基因和mvaS基因；(b)来自屎肠球菌(Enterococcusfaecium)的 mvaE 基因和 mvaS 基因;(C)来自鹁鸡肠球菌(Enterococcus gal I inarum)的mvaE基因和mvaS基因；(d)来自铅黄肠球菌(Enterococcus casselif IavuS)的mvaE基因和mvaS基因；和(e)来自幾肠球菌(Enterococcus faecalis)的mvaE基因和mvaS基因。
5.根据权利要求1所述的细胞，其中所述一种或多种编码MVA途径多肽的核酸来自MVA下游途径，其中所述MVA下游途径核酸选自MVK核酸、PMK核酸和MVD核酸。
6.根据权利要求5所述的细胞,其中所述MVK选自马氏甲烧八叠球菌(Methanosarcinamazei)甲轻戍酸激酶、布氏拟甲烧球菌(Methanococcoides burtonii)甲轻戍酸激酶多肽、乳杆菌(Lactobacillus)甲轻戍酸激酶多肽、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)甲轻戍酸激酶多肽、酵母甲轻戍酸激酶多肽、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甲轻戍酸激酶多肽、链球菌(Streptococcus)甲轻戍酸激酶多肽、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)甲轻戍酸激酶多肽、链霉菌(Streptomyces)甲轻戍酸激酶多肽和链霉菌CL190甲羟戊酸激酶多肽。
7.根据权利要求1所述的细胞，其中所述细胞还包含一种或多种编码一种或多种DXP途径多肽的异源核酸。
8.根据权利要求1所述的细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽为来自葛属(Pueraria)或杨属(Populus)或杂种银白杨X欧洲山杨(Populus alba x Populus tremula)的多肽或其变体。
9.根据权利要求1所述的细胞，其中所述细胞为革兰氏阳性细菌细胞、链霉菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞、埃希杆菌(Escherichia)细胞、泛菌(Pantoea)细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、木霉(Trichoderma)细胞、曲霉(Aspergillus)细胞或酵母细胞。
10.根据权利要求1所述的细胞，其中通过降低内源柠檬酸合酶基因的活性来调节柠檬酸合酶的活性。
11.根据权利要求10所述的细胞，其中通过用编码NADH非敏感型柠檬酸合酶的转基因对内源柠檬酸合酶基因进行染色体置换来调节柠檬酸合酶的活性。
12.根据权利要求11所述的细胞，其中所述编码NADH非敏感型柠檬酸合酶的转基因源于枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)。
13.根据权利要求10所述的细胞，其中通过将所述内源柠檬酸合酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来调节柠檬酸合酶的活性。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的细胞，其中降低柠檬酸合酶的活性导致与柠檬酸合酶的表达不降低的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
15.根据权利要求1所述的细胞，其中通过调节磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。
16.根据权利要求15所述的细胞，其中通过减弱内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的活性来调节磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的活性。
17.根据权利要求16所述的细胞，其中通过缺失内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因来减弱内源磷酸转乙酰酶和/或内源乙酸激酶基因表达。
18.根据权利要求15或16所述的细胞，其中与内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的表达不减弱的微生物相比所述细胞产生降低量的乙酸。
19.根据权利要求1-9或15-18中任一项所述的细胞，其中减弱所述内源磷酸转乙酰酶基因和/或所述内源乙酸激酶基因的活性导致与内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的表达不减弱的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
20.根据权利要求1所述的细胞，其中通过调节乳酸脱氢酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。
21.根据权利要求20所述的细胞，其中通过减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性来调节乳酸脱氢酶的活性。
22.根据权利要求21所述的细胞，其中通过缺失内源乳酸脱氢酶基因来减弱内源乳酸脱龜!酶基因表达。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的细胞，其中与内源乳酸脱氢酶基因的表达不减弱的微生物相比所述细胞产生降低量的乳酸。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的细胞，其中减弱所述内源乳酸脱氢酶基因的活性导致与内源乳酸脱氢酶基因的表达不减弱的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
25.根据权利要求1中任一项所述的细胞,其中通过调节NADP依赖性苹果酸脱氢酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。
26.根据权利要求25所述的细胞，其中通过增加NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的活性来调节NADP依赖性苹果酸脱氢酶的活性。
27.根据权利要求26所述的细胞，其中所述NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因是内源基因。
28.根据权利要求27所述的细胞，其中通过将所述内源NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因启动子替换为合成的组成型表达启动子来增加所述内源NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的表达。
29.根据权利要求25或26所述的细胞，其中所述细胞还包含编码NADP依赖性苹果酸脱氢酶多肽的异源 核酸。
30.根据权利要求25-29中任一项所述的细胞，其中与NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的表达不增加的微生物相比所述细胞产生增加量的丙酮酸。
31.根据权利要求25-30中任一项所述的细胞，其中增加NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的活性导致与NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的表达不增加的微生物相比更多的碳通量进入所述甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
32.根据权利要求1中任一项所述的细胞，其中通过调节丙酮酸脱氢酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。
33.根据权利要求32所述的细胞，其中通过增加由(a)丙酮酸脱氢酶(El)、(b)二氢硫辛酸转乙酰酶和(C) 二氢硫辛酸脱氢酶组成的丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因的活性来调节丙酮酸脱氢酶的活性。
34.根据权利要求32或33所述的细胞，其中通过减弱内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白基因的活性来调节丙酮酸脱氢酶复合物的活性。
35.根据权利要求34所述的细胞，其中所述丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因为内源基因。
36.根据权利要求35所述的细胞，其中通过将一种或多种内源基因启动子替换为一种或多种合成的组成型表达启动子来增加所述丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种内源基因的表达。
37.根据权利要求32或33所述的细胞，其中所述细胞还包含一种或多种编码一种或多种来自由如下酶组成的组的多肽的异源核酸:(a)丙酮酸脱氢酶(El)、(b) 二氢硫辛酸转乙酰酶和(C) 二氢硫辛酸脱氢酶。
38.根据权利要求34所述的细胞，其中通过缺失内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白基因来减弱所述内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白的活性。
39.根据权利要求32-38中任一项所述的细胞，其中与其中丙酮酸脱氢酶活性未受调节的微生物相比所述细胞产生增加量的乙酰辅酶A。
40.根据权利要求32-39中任一项所述的细胞，其中调节丙酮酸脱氢酶的活性导致与丙酮酸脱氢酶表达未受调节的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
41.根据权利要求1所述的细胞，其中通过调节磷酸葡糖酸内酯酶(PGL)的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。
42.根据权利要求41所述的细胞，其中通过减弱内源PGL基因的活性来调节PGL的活性。
43.根据权利要求42所述的细胞，其中通过将所述内源PGL基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来减弱PGL的活性。
44.根据权利要求43所述的细胞，其中通过缺失内源PGL基因来减弱所述内源PGL的活性。
45.根据权利要求1所述的细胞，其中通过调节磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。
46.根据权利要求45所述的细胞，其中通过减弱内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的活性来调节磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。
47.根据权利要求46所述的细胞，其中通过将内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来减弱所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。
48.根据权利要求47所述的细胞，其中通过缺失内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因来减弱所述内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。
49.一种产生异戊二烯的方法，包括:(a)在适于产生异戊二烯的培养条件下培养根据权利要求1所述的细胞；以及(b)产生异戊二烯。
50.一种能够增加甲羟戊酸的产量的重组细胞，其中为了增加流向甲羟戊酸生产的碳通量而对所述细胞进行工程改造使得一种或多种来自由如下酶组成的组的酶的活性受到调节: (a)柠檬酸合酶、 (b)磷酸转乙酰酶、 (C)乙酸激酶、 (d)乳酸脱氢酶、 (e)苹果酸脱氢酶、 (f)丙酮酸脱氢酶、 (g)磷酸葡糖酸内酯酶和 (h)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶， 并且其中所述细胞还包含一种或多种编码一种或多种甲羟戊酸(MVA)上游途径多肽的核酸；并且其中所述细胞与尚未为增加流向甲羟戊酸的碳通量而进行工程改造的产甲羟戊酸细胞相比产生增加量的甲羟戊酸。
51.根据权利要求50所述的细胞，其中所述一种或多种编码甲羟戊酸(MVA)上游途径多肽的核酸为mvaE基因和mvaS基因。
52.根据权利要求50所述的细胞,其中所述mvaE基因和所述mvaS基因选自:(a)来自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)来自屎肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；(C)来自鹑鸡肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；(d)来自铅黄肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(e)来自幾肠球菌的mvaE基因和mvaS基因。
53.根据权利要求50所述的细胞，其中通过降低内源柠檬酸合酶基因的活性来调节柠檬酸合酶的活性。
54.根据权利要求53所述的细胞，其中通过用编码NADH非敏感型柠檬酸合酶的转基因对内源柠檬酸合酶基因进行染色体置换来调节柠檬酸合酶的活性。
55.根据权利要求54所述的细胞，其中所述编码NADH非敏感型柠檬酸合酶的转基因源于枯草芽孢杆菌。
56.根据权利要求53所述的细胞，其中通过将所述内源柠檬酸合酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来调节柠檬酸合酶的活性。
57.根据权利要求53-54中任一项所述的细胞，其中降低柠檬酸合酶的活性导致与柠檬酸合酶的表达不降低的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
58.根据权利要求50所述的细胞，其中通过调节磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。
59.根据权利要求58所述的细胞，其中通过减弱内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的活性来调节磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的活性。
60.根据权利要求59所述的细胞，其中通过缺失内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因来减弱所述内源磷酸转乙酰酶和/或内源乙酸激酶基因表达。
61.根据权利要求58或权利要求59所述的细胞，其中与内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的表达不减弱的微生物相比所述细胞产生降低量的乙酸。
62.根据权利要求50-52或58-61中任一项所述的细胞，其中减弱所述内源磷酸转乙酰酶基因和/或所述内源乙酸激酶基因的活性导致与内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的表达不减弱的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
63.根据权利要求50所述的细胞，其中通过调节乳酸脱氢酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。
64.根据权利要求63所述的细胞，其中通过减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性来调节乳酸脱氢酶的活性。
65.根据权利要求64所述的细胞，其中通过缺失内源乳酸脱氢酶基因来减弱所述内源乳酸脱氢酶基因表达。
66.根据权利要求64-65中任一项所述的细胞，其中与内源乳酸脱氢酶基因的表达不减弱的微生物相比所述细胞产生降低量的乳酸。
67.根据权利要求64-66中任一项所述的细胞，其中减弱所述内源乳酸脱氢酶基因的活性导致与内源乳酸脱氢酶基因的表达不减弱的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
68.根据权利要求50所述的细胞，其中通过调节NADP依赖性苹果酸脱氢酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。
69.根据权利要求68所述的细胞，其中通过增加NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的活性来调节NADP依赖性苹果酸脱氢酶的活性。
70.根据权利要求69所述的细胞，其中所述NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因是内源基因。
71.根据权利要求70所述的细胞，其中通过将所述内源NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因启动子替换为合成的组成型表达启动子来增加所述内源NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的表达。
72.根据权利要求68或69所述的细胞，其中所述细胞还包含编码NADP依赖性苹果酸脱氢酶多肽的异源核酸。
73.根据权利要求68-72中任一项所述的细胞，其中与NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的表达不增加的微生物相比所述细胞产生增加量的丙酮酸。
74.根据权利要求68-73中任一项所述的细胞，其中增加NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的活性导致与NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的表达不增加的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
75.根据权利要求50所述的细胞，其中通过调节丙酮酸脱氢酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。
76.根据权利要求75所述的细胞，其中通过增加由(a)丙酮酸脱氢酶(El)、(b)二氢硫辛酸转乙酰酶和(c) 二氢硫辛酸脱氢酶组成的丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因的活性来调节丙酮酸脱氢酶的活性。
77.根据权利要求75或76所述的细胞，其中通过减弱内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白基因的活性来调节所述丙酮酸脱氢酶复合物的活性。
78.根据权利要求77所述的细胞，其中所述丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因为内源基因。
79.根据权利要求78所述的细胞，其中通过将一种或多种内源基因启动子替换为一种或多种合成的组成型表达启动子来增加所述丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种内源基因的表达。
80.根据权利要求75或76所述的细胞，其中所述细胞还包含一种或多种编码一种或多种来自由如下酶组成的组的多肽的异源核酸:(a)丙酮酸脱氢酶(El)、(b) 二氢硫辛酸转乙酰酶和(C) 二氢硫辛酸脱氢酶。
81.根据权利要求77所述的细胞，其中通过缺失所述内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白基因来减弱所述内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白的活性。
82.根据权利要求75-81中任一项所述的细胞，其中与其中丙酮酸脱氢酶的活性未受调节的微生物相比所述细胞产生增加量的乙酰辅酶A。
83.根据权利要求75-82中任一项所述的细胞，其中调节丙酮酸脱氢酶的活性导致与丙酮酸脱氢酶表达未受调节的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
84.根据权利要求50所述的细胞，其中通过调节磷酸葡糖酸内酯酶(PGL)的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。
85.根据权利要求84所述的细胞，其中通过减弱内源PGL基因的活性来调节PGL的活性。
86.根据权利要求85所述的细胞，其中通过将所述内源PGL基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来减弱PGL的活性。
87.根据权利要求85所述的细胞，其中通过缺失内源PGL基因来减弱所述内源PGL的活性。
88.根据权利要求50所述的细胞，其中通过调节磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。
89.根据权利要求88所述的细胞，其中通过减弱内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的活性来调节磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。
90.根据权利要求89所述的细胞，其中通过将所述内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来减弱磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。
91.根据权利要求89所述的细胞，其中通过缺失内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因来减弱所述内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。
92.一种产生甲羟戊酸的方法，包括:(a)在适于产生异戊二烯的培养条件下培养根据权利要求50所述的细胞；以及(b)产生所述甲羟戊酸。
93.根据权利要求50-92中任一项所述的细胞，其中与不在三羧酸(TCA)循环活性条件下培养的微生物相比甲羟戊酸产量得到增加，其中通过调节一种或多种来自由如下酶组成的组的酶的活性将所述细胞中的代谢碳通量导向甲羟戊酸生产:(a)柠檬酸合酶、(b)磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶、(C)乳酸脱氢酶、(d)苹果酸脱氢酶和(e)丙酮酸脱羧酶复合物。
94.根据权利要求50-92中任一项所述的细胞，其中通过将所述内源柠檬酸合酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来调节柠檬酸合酶的活性、通过减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性来调节乳酸脱氢酶的活性以及通过减弱内源乙酸激酶基因的活性来调节乙酸激酶的活性。
95.一种能够增加类异戊二烯的产量的重组细胞，其中为了增加流向甲羟戊酸生产的碳通量而对所述细 胞进行工程改造使得一种或多种来自由如下酶组成的组的酶的活性受到调节: (a)柠檬酸合酶、 (b)磷酸转乙酰酶、 (C)乙酸激酶、 (d)乳酸脱氢酶、 (e)苹果酸脱氢酶、 (f)丙酮酸脱氢酶； (g)磷酸葡糖酸内酯酶和 (h)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶， 并且其中所述细胞还包含⑴一种或多种编码一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽的核酸和(ii) 一种或多种编码聚丙烯焦磷酸合酶的核酸；并且其中所述细胞与尚未为增加流向甲羟戊酸的碳通量而进行工程改造的产类异戊二烯细胞相比产生增加量的类异戊二烯。
96.根据权利要求95所述的细胞，其中所述一种或多种编码MVA途径多肽的核酸来自MVA上游途径，其中所述MVA上游途径核酸选自AA-CoA硫解酶核酸、HMG-CoA合酶核酸和HMG-CoA还原酶核酸。
97.根据权利要求96所述的细胞，其中所述一种或多种编码甲羟戊酸(MVA)上游途径多肽的核酸为mvaE基因和mvaS基因。
98.根据权利要求97所述的细胞,其中所述mvaE基因和所述mvaS基因选自:(a)来自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)来自屎肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；(C)来自鹑鸡肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；(d)来自铅黄肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(e)来自幾肠球菌的mvaE基因和mvaS基因。
99.根据权利要求95所述的细胞，其中所述一种或多种编码MVA途径多肽的核酸来自MVA下游途径，其中所述MVA下游途径核酸选自MVK核酸、PMK核酸和MVD核酸。
100.根据权利要求99所述的细胞，其中所述MVK选自马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、布氏拟甲烷球菌甲羟戊酸激酶多肽、乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、清酒乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、酵母甲羟戊酸激酶多肽、酿酒酵母甲羟戊酸激酶多肽、链球菌甲羟戊酸激酶多肽、肺炎链球菌甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌甲羟戊酸激酶多肽和链霉菌CL190甲羟戊酸激酶多肽。
101.根据权利要求95所述的细胞，其中所述细胞还包含一种或多种编码一种或多种DXP途径多肽的异源核酸。
102.根据权利 要求95所述的细胞，其中所述细胞为革兰氏阳性细菌细胞、链霉菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞、埃希杆菌细胞、泛菌细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、木霉细胞、曲霉细胞或酵母细胞。
103.根据权利要求95所述的细胞，其中通过降低内源柠檬酸合酶基因的活性来调节柠檬酸合酶的活性。
104.根据权利要求103所述的细胞，其中通过用编码NADH非敏感型柠檬酸合酶的转基因对内源柠檬酸合酶基因进行染色体置换来调节柠檬酸合酶的活性。
105.根据权利要求104所述的细胞，其中所述编码NADH非敏感型柠檬酸合酶的转基因源于枯草芽孢杆菌。
106.根据权利要求103所述的细胞，其中通过将所述内源柠檬酸合酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来调节柠檬酸合酶的活性。
107.根据权利要求103-106中任一项所述的细胞，其中降低柠檬酸合酶的活性导致与柠檬酸合酶的表达不降低的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
108.根据权利要求95所述的细胞，其中通过调节磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。
109.根据权利要求108所述的细胞，其中通过减弱内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的活性来调节磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的活性。
110.根据权利要求109所述的细胞，其中通过缺失内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因来减弱所述内源磷酸转乙酰酶和/或内源乙酸激酶基因表达。
111.根据权利要求108或109所述的细胞，其中与内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的表达不减弱的微生物相比所述细胞产生降低量的乙酸。
112.根据权利要求95-102或108-111中任一项所述的细胞，其中减弱所述内源磷酸转乙酰酶基因和/或所述内源乙酸激酶基因的活性导致与内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的表达不减弱的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
113.根据权利要求95所述的细胞，其中通过调节乳酸脱氢酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。
114.根据权利要求113所述的细胞，其中通过减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性来调节乳酸脱氢酶的活性。
115.根据权利要求114所述的细胞，其中通过缺失内源乳酸脱氢酶基因来减弱所述内源乳酸脱氢酶基因表达。
116.根据权利要求113-115中任一项所述的细胞，其中与内源乳酸脱氢酶基因的表达不减弱的微生物相比所述细胞产生降低量的乳酸。
117.根据权利要求113-116中任一项所述的细胞，其中减弱所述内源乳酸脱氢酶基因的活性导致与内源乳酸脱氢酶基因的表达不减弱的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
118.根据权利要求95中任一项所述的细胞，其中通过调节NADP依赖性苹果酸脱氢酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。
119.根据权利要求118所述的细胞，其中通过增加NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的活性来调节NADP依赖性苹果酸脱氢酶的活性。
120.根据权利要求119所述的细胞，其中所述NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因是内源基因。
121.根据权利要求119所述的细胞，其中通过将所述内源NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因启动子替换为合成的组成型表达启动子来增加所述内源NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的表达。
122.根据权利要求118或119所述的细胞，其中所述细胞还包含编码NADP依赖性苹果酸脱氢酶多肽的异源核酸。
123.根据权利要求118-122中任一项所述的细胞，其中与NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的表达不增加的微生物相比所述细胞产生增加量的丙酮酸。
124.根据权利要求118-123中任一项所述的细胞，其中增加NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的活性导致与NADP依赖性苹果酸脱氢酶基因的表达不增加的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
125.根据权利要求95中任一项所述的细胞，其中通过调节丙酮酸脱氢酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。
126.根据权利要求125所述的细胞，其中通过增加由(a)丙酮酸脱氢酶(El)、(b)二氢硫辛酸转乙酰酶和(c) 二氢硫辛酸脱氢酶组成的丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因的活性来调节丙酮酸脱氢酶的活性。
127.根据权利要求125或126所述的细胞，其中通过减弱内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白基因的活性来调节所述丙酮酸脱氢酶复合物的活性。
128.根据权利要求127所述的细胞，其中所述丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因为内源基因。
129.根据权利要求128所述的细胞，其中通过将一种或多种内源基因启动子替换为一种或多种合成的组成型表达启动子来增加所述丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种内源基因的表达。
130.根据权利要求125或126所述的细胞,其中所述细胞还包含一种或多种编码一种或多种来自由如下酶组成的组的多肽的异源核酸:(a)丙酮酸脱氢酶(El)、(b) 二氢硫辛酸转乙酰酶和(C) 二氢硫辛酸脱氢酶。
131.根据权利要求130所述的细胞，其中通过缺失所述内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白基因来减弱内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白的活性。
132.根据权利要求125-131中任一项所述的细胞，其中与其中丙酮酸脱氢酶活性未受调节的微生物相比所述细胞产生增加量的乙酰辅酶A。
133.根据权利要求125-132中任一项所述的细胞，其中调节丙酮酸脱氢酶的活性导致与丙酮酸脱氢酶表达未受调节的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
134.根据权利要求95所述的细胞，其中通过调节磷酸葡糖酸内酯酶(PGL)的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。
135.根据权利要求134所述的细胞，其中通过减弱内源PGL基因的活性来调节PGL的活性。
136.根据权利要求135所述的细胞，其中通过将所述内源PGL基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来降低PGL的活性。
137.根据权 利要求136所述的细胞，其中通过缺失所述内源PGL基因来减弱内源PGL的活性。
138.根据权利要求95所述的细胞，其中通过调节磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性将碳通量导向甲羟戊酸生产。
139.根据权利要求138所述的细胞，其中通过减弱内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的活性来调节磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。
140.根据权利要求139所述的细胞，其中通过将内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来降低磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。
141.根据权利要求140所述的细胞，其中通过缺失内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因来减弱所述内源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。
142.根据权利要求93-141所述的细胞，其中所述类异戊二烯选自单萜、二萜、三萜、四萜、倍半萜和多萜。
143.根据权利要求142所述的细胞，其中所述类异戊二烯为倍半萜。
144.根据权利要求142所述的细胞，其中所述类异戊二烯选自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、α-金合欢烯、β-金合欢烯、金合欢醇、香叶醇、香叶基香叶醇、芳樟醇、柠檬烯、月桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β_菔烯、桧烯、Y-萜品烯、异松香烯和瓦伦西亚桔烯。
145.一种产生类异戊二烯的方法，包括:(a)在适于产生异戊二烯的培养条件下培养根据权利要求1所述的细胞；以及(b)产生所述类异戊二烯。
146.根据权利要求49所述的方法，还包括(c)回收所述异戊二烯。
147.根据权利要求92所述的方法，还包括(c)回收所述甲羟戊酸。
148.根据权利要求145所述的方法，还包括(c)回收所述类异戊二烯。
149.根据权利要求1所述的细胞，还包含一种或多种编码异戊烯二磷酸δ-异构酶(IDI)多肽的核酸。
150.根据权利要求95所述的细胞，还包含一种或多种编码异戊烯二磷酸δ-异构酶(IDI)多肽的核酸。
【文档编号】C12P7/04GK103930541SQ201280031900
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年4月27日 优先权日:2011年4月29日
【发明者】Z·Q·贝克, M·C·米勒, C·M·派瑞斯, Y·A·普里马克, J·P·普奇, D·H·韦尔斯 申请人:丹尼斯科美国公司, 固特异轮胎和橡胶公司