专利名称：一种小麦甲羟戊酸激酶基因TaMVK及其分离克隆、酶活性测定方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种从小麦品种济南13中获得的，参与小麦叶绿素、类胡萝卜素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素、长萜醇、类萜、辅酶Q、留醇和植物毒素等类异戊二烯物质合成的关键酶基因甲羟戊酸激酶基因TaMVK的分离克隆、酶蛋白的原核表达、酶蛋白的分离纯化及其酶活性的体外检测技术。
背景技术：
类异戊二烯物质存在于所有生物体中，在植物中含量尤其丰富，是维持植物生长发育、光合作用等所必需的重要有机物质。目前，已经发现了 3万余种植物类异戊二烯， 而且这个数字还在逐年增加。该类物质在生物体中具有各种不同的作用，可作为光合色素 (如叶绿素、类胡萝卜素)、生长物质和植物激素(细胞分裂素、脱落酸、赤霉素和油菜素内酯)、膜结构的一部分如谷留醇、电子传递受体如质体醌、作为葡萄糖基化反应中葡萄糖的受体如多萜醇，并能调控细胞的生长(如异戊烯基蛋白，细胞分裂素)。此外，很多植物类异戊二烯还具有重要的商业价值如作为食物香料、饮料、维生素A、D、E，天然杀虫剂如除虫菊素和橡胶等。类异戊二烯物质的生物合成主要由甲羟戊酸途径中的一系列酶酶促合成的，甲羟戊酸激酶(MVk，MK ；ATP :mevalonate-5-phosphotransferase ；EC2. 7. 1. 36)是该代谢途径中三个连续ATP依赖酶中的第一个，它将ATP γ位上的一个磷酸基团转移到甲羟戊酸第5 位的羟基上形成甲羟戊酸-5-磷酸，并伴随着ADP的释放，是控制整个代谢途径的限速酶之一。目前已分别从拟南芥(Arabidopsis thaiiana)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、高梁(Sorghumbicolor)、檢胶(Hevea brasiliensis)、蓖麻(Ricinus communis)等植物中分离克隆了甲羟戊酸激酶基因，但是现有技术中还没有成功的从小麦品种中分离出甲羟戊酸激酶基因的先例，因此制约了克隆甲羟戊酸激酶基因在小麦生产中的应用。在本发明申请之前，还没有公开或发表过关于从任何一种小麦(Triticum aestivum)品种中分离克隆甲羟戊酸激酶基因TaMVK、编码蛋白酶的原核基因表达、酶蛋白的分离纯化及其酶活性体外检测和动力学参数等研究资料信息。
发明内容
针对现有技术中在小麦中甲羟戊酸激酶基因相关技术的缺失，本发明的发明人提供了一整套关于小麦，特别是小麦品种“济南13”甲羟戊酸激酶基因TaMVK克隆、编码蛋白酶的原核基因表达、酶蛋白的分离纯化及其酶活性体外检测和动力学参数测定的技术。测得自小麦品种济南13克隆获得的甲羟戊酸激酶的Vmax为24. 6士3. 2ym0l/min/mg，Kcat 为 7. 2士0. 9S、Kcat/KM 为 5. 9xl0VS_1,甲羟戊酸的 Km 值为 1227士351 μ M，ATP 的 Km 值为对7. 5士73. 4μΜ，证明克隆的小麦甲羟戊酸激酶基因具有天然生物学活性。本发明为进一步构建甲羟戊酸激酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物，尤其是靠次生代谢获取重要商业价值的植物，探讨甲羟戊酸激酶基因在受体植物中的过量表达与次生代谢产物、籽粒大小及粒重等重要农艺性状的关系，进而提高农作物产量，以及对甲羟戊酸激酶基因内含子、外显子及启动子结构进行剖析，研究启动子功能、开发有关分子标记提供重要技术储备。本发明所提供的小麦甲羟戊酸激酶基因TaMVK编码区基因序列如kq ID No:l所示，其编码的氨基酸序列如ID No:2所示。上述的小麦甲羟戊酸激酶基因TaMVK是从小麦品种济南13中克隆获得的，该基因 cDNA总长为1752bP，翻译起始密码子ATG自273位核苷酸开始，终止密码子TAA位于1437 位核苷酸处，在1734位核苷酸处有polyA尾巴。因此，小麦品种济南13TaMVK全长cDNA包括1个27!3bp的5'非编码区、1167bp编码区和1个3'非编码区，编码一条包含388aa的多肽，分子量约为46kDa。发明人进一步公开了该基因的分离克隆、编码蛋白酶的原核基因表达、酶蛋白的分离纯化及其酶活性体外检测和动力学参数测定的技术，具体如下具体的分离克隆方法为1.小麦叶片RNA的分离提取根据TaKaRa广谱型total RNA提取试剂盒(Takara RNAisoTm Plus)的说明书进行。获得的RNA保存在DEPC水中备用。2. cDNA第一条链的合成按照PrimeScriptTm 1st Strand cDNA Synthesis kit 的说明书进行合成。3.基因中间序列扩增、连接与转化根据已知部分小麦MVK的EST序列，用ft~imer5. 0引物设计软件和DNAMAN软件设计引物，上游引物为WmvkF :5' GTTGGCGGAACGGAGTGGCA 3'，基因序列如kq ID No :3所示；下游引物为WmvkR :5' CGACTTTGAAGCAGCGGAAACCAT3‘，基因序列如 kq ID No :4 所示。进行 PCR，利用 DNA胶回收试剂盒 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2. 0 回收特异条带。将回收的DNA片段和pGEM-T Easy Vector进行连接。利用热激法转化大肠杆菌 DH 5 α，挑取阳性克隆，制备质粒DNA并进行DNA测序，通过NCBI比对获得目的基因片段。4.利用RACE技术快速获得基因末端序列4. IRACE 引物设计通过DNAMAN比对所获得的目的基因中间序列，以及橡胶(AB29469!3)、拟南芥 (X77793、NM_12^27. 4)、褐家鼠(NM_031063)、小家鼠(匪_02；3556)、玉米(BT062051. 1)、水稻(ΝΜ001070895)、高粱(XM 002453136. 1)的基因序列，寻找最保守的区域，用DNAMAN手工设计引物序列为5' RACE 引物5' CCATGCACTGGAGCAAACCTTGG 3'，基因序列如 kq ID No :5 所示；3' RACE 引物；5' TGGTAGGAACACCAAGGCTCTGGT 3‘，基因序列如 kq ID No :6 所示；4. 2基因末端序列快速扩增根据Clontech Laboratories INC 的 SMARTTm RACE cDNA Amplification kit 的方法快速扩增基因的5'和3'末端，筛选重组子，并测序。4. 3基因中间序列和RACE序列使用Contig Express 9. 1拼接全长序列，然后对所得的contig序列进行人工校对。5基因全长序列的扩增5.1基因全长引物的设计根据中间序列和RACE序列contig结果，设计全长扩增引物。上游引物序列为WfsmvkF:5' ATGGAGATCCGCGCCCGCGCGCCCGGCAAGA 3'，基因序列如kqlD No 7所示下游引物序列为MVKfslR:5' GACTGGCAAACTCGCTTATT3 ‘，基因序列如 kq ID No 8所示；5. 2全长基因的PCR扩增以第一链cDNA为模板扩增全长目的基因，进行全长基因PCR产物的胶回收、连接、 转化、PCR重组子检测、质粒提取和测序。6基因的原核表达6. 1基因原核表达引物设计根据所得的全长序列测序结果，利用DNAMAN软件把所得的基因序列翻译成氨基酸序列，然后同NCBI已知生物甲羟戊酸激酶氨基酸序列进行比对来确定小麦甲羟戊酸激酶基因的0RF，设计连入pLMl表达载体的引物。在基因的5'端，设计带有核糖体结合位点 (AGGAGGA)、限制性内切酶BamHI酶切位点(GGATCC)、起始密码子、6个组氨酸密码子以及含有甲羟戊酸激酶基因中编码6个氨基酸的正向引物5 ‘ CGCGCGGATCCAGGAGGAATTTAAAATGA GAGGATCGCATCATCACCACCATCAC GAG ATC CGC GCC CGC GCGC 3'，基因序列如义。ID No 9 所示；在基因的3'端，设计具有限制性内切酶MlI酶切位点(GTCGAC)、终止密码子(TTA) 以及含有编码9个氨基酸的反向引物5' CTGCAGGTCGACTTA TCCTTG GTG AAT CTG AAG ACC TTG 3'，基因序列如kq ID No :10所示。6. 2基因原核表达载体的构建包括基因原核表达序列PCR扩增产物的酶切、酶切产物与载体的连接、转化、阳性克隆重组子PCR鉴定、酶切鉴定、质粒DNA提取、DNA测序验证。6. 3甲羟戊酸激酶基因表达首先进行甲羟戊酸激酶蛋白表达条件的优化，包括IPTG浓度、诱导温度的优化等。根据确定的优化条件，进行甲羟戊酸激酶蛋白的大量表达。7甲羟戊酸激酶蛋白的纯化利用离子交换柱分离纯化甲羟戊酸激酶蛋白。过柱纯化的蛋白质，装于透析袋中在一定溶液中透析去盐，纯化的蛋白质于_86°C保存备用。8采用丙酮酸激酶与乳酸脱氢酶偶联反应的方法测定甲羟戊酸激酶活性检测测得自小麦品种济南13克隆获得的甲羟戊酸激酶的Vmax为6 士 3. 2 μ mol/min/ mg，Kcat 为 7.2士0. 9S、Kcat/KM 为 5. θχΚΛΓ^1，甲羟戊酸的 Km 值为 1227士351 μ M，ATP 的Km值为Μ7. 5士73.4 μ Μ，证明克隆的酶基因具有天然生物学活性。本发明为进一步构建甲羟戊酸激酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物，尤其是靠次生代谢获取重要商业价值的植物，探讨甲羟戊酸激酶基因在受体植物中的过量表达与次生代谢产物、籽粒大小及粒重等重要农艺性状的关系，进而提高农作物产量， 以及对甲羟戊酸激酶基因内含子、外显子及启动子结构进行剖析，研究启动子功能、开发有关分子标记提供重要技术储备。
图1为小麦三叶期叶片RNA电泳图谱，图中1为DNA Marker I ;2为0. 2 μ L小麦济南13的RNA样品；3为0. 2 μ L中国春小麦RNA样品；4为0. 2 μ L小麦地方品种玉麦RNA样品；图2为小麦甲羟戊酸激酶基因中间序列PCR产物电泳图谱，图中1为IOObp DNA maker ；2-3为小麦济南13甲羟戊酸激酶基因中间序列的PCR 产物；4-5为小麦地方品种玉麦甲羟戊酸激酶基因中间序列的PCR产物；6-7为中国春小麦甲羟戊酸激酶基因中间序列的PCR产物；图3为小麦品种济南13甲羟戊酸激酶基因末端序列快速扩增PCR产物电泳图，图中 Al 为 3，RACE PCR 产物；A2 为 DNA IOObp maker ；Bl 为 5，RACE PCR 产物；B2 为 DNA M200maker ；B3 为 DNA MlOOmaker ；图4为原核基因表达载体pLMl结构示意图，图中Ampcilin表示氨苄青霉素抗性，T7promoter为启动子，poly linker为多克隆位点，EcoRI和Hind III为多克隆位点边缘的限制性内切酶；图5为纯化的小麦品种济南13甲羟戊酸激酶蛋白SDS-PAGE电泳图，图中1为蛋白质分子量标准；2为纯化的第一管蛋白；3为纯化的第二管蛋白；图6为丙酮酸激酶与乳酸脱氢酶偶联反应检测小麦甲羟戊酸激酶活性示意图。
具体实施例方式实施例1 (小麦叶片RNA提取)(1)用蛭石于恒温培养箱)培养小麦品种济南13长至三叶期。(2)液氮中将叶片研磨至粉末状，移到DEPC处理的EP管中。(3)加入适量 RNAiso Plus。(4)室温下静置5min。(5)加入1/5 RNAiso Plus体积的氯仿。振荡至乳白状。(6)室温下静置5Hiin。(7) 12000g，4°C 离心 15min。(8)上清移到新的DEPC处理的EP管中，加入与上清等体积的异丙醇，混勻。室温下静置lOmin。(9) 12000g，4°C离心 lOmin。(10)向沉淀中加入ImL用DEPC水配制的75%乙醇。I2OOOg 4°C离心5min。(11)保留沉淀，通风橱中干燥至无色。(12)加入40 μ L DEPC水溶解。半小时后分装并电泳检测。取0. 5 μ L和0. 8 μ L RNA样品，1. 0%琼脂糖非变性凝胶电泳，电压140V，电泳30min，凝胶成像系统拍照纪录，如图1所示。
实施例2 (cDNA第一条链的合成)(1)在DEPC处理的PCR管中依次加入
Oligo dT Primer (5. Oum) 1 μ L dNTP mixture (IOmM) 1 μ L Rnase free water5 μ L
Total RNA3 μ (2)在PCR仪上运行；65°C 5min然后冰上急冷。(3)在PCR管中加入
5 χ Primerscriptlni Bf4 μ L
RNase inhibitor (40U/ μ )0. 5 μ LPrimerscriptlni Rtase ( 200U/ μ L ) 1 μ L
Rnase free water4. 5 μ L
上述退火反应液_10 μ
20 μ (4)在 PCR 仪上进行42°C 60min, 70°C 15min实施例3 (中间序列扩增)1中间序列的引物设计用ft~imer5. 0引物设计软件和DNAMAN软件，根据部分小麦甲羟戊酸激酶EST序列设计引物。上游引物为WmvkF:5' GTTGGCGGAACGGAGTGGCA 3‘ (Seq ID No 3)下游引物为WmvkR:5' CGACTTTGAAGCAGCGGAAACCAT3 ‘ (Seq ID No 4)PCR 体系为water 9. 3 μ L、IOxPCR buffer 1· 5 μ L、dNTP 0· 7 μ L、Pl 0. 6 μ L、Ρ2 0. 6 μ L> LATag 0· 3μ L0PCR 程序为94°C 5min、94°C 45s、68°C 45s,72°C 90s,72°C lOmin，32cycles。
2中间序列的PCR结果检测取8 μ L PCR扩增产物与IyL溴酚蓝混勻，点入1.5%琼脂糖凝胶中，在120V电压下电泳45min，紫外凝胶成像系统观察并照相，如图2所示，以检查是否扩到目的片段，以便进行连接和测序。3扩增片段的回收PCR产物经常规琼脂糖凝胶(TaKaRa Agarose, 1. 5 %浓度)电泳，在紫外灯(波长302nm)下观察，割取目的DNA条带。以DNA胶回收试剂盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification KitVer2. 0，大连宝生物产品)回收特异条带。(1)在紫外灯下用干净、无菌手术刀片切除含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体，此时应注意尽量切除不含有目的DNA部分的凝胶。(2)向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer。(3)混勻后75°C加热融化胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分融化(约6 IOmin)。(4)加入DR-I Buffer 体积量的DR-II Buffer，吹吸混勻，当分离400bp左右的DNA片段时，在上述溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。
(5)将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。(6)将上述操作的溶液转移至Spin Column中，12000rpm，离心lmin，弃滤液。将滤液再加入Spin Column中，离心一次，可以提高DNA回收率。(7)加入 500 μ L Rinse A，12000rpm 离心 lmin，弃滤液。(8)加入 700 μ L Rinse B, 12000rpm 离心 lmin,弃滤液。(9)重复(8) —次。(10)将Spin Column安置于新的1. 5mL离心管上，在Spin Column膜中央处加入 25 μ L 60°C预热的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置lmin。(11) 12000rpm 离心 lmin，洗脱 DNA，-20°C保存 DNA 备用。4回收产物的电泳检测取5μ L回收的中间序列PCR产物，用1. 5%琼脂糖凝胶中电泳检测回收效率。5PCR产物的连接根据回收片段的浓度确定产物和pGEM-T Easy Vector之间的比例。连接步骤如下(1)加入 DNA 3. 75 μ L，T 载体 0.25 μ L，轻轻混勻。(2)45°C水浴5min，立即转入冰上5min。(3)再加入 T4 DNA 连接酶 0. 5μ !^和 hRapid Ligation BufferO. 5 μ L 混勻，于 PCR仪上16°C连接16h以上。6转化、培养(1)将5μ L连接液加入含50μ L感受态细胞的离心管中，吹吸混勻，冰上放置 30mino(》42°C水浴热激90s，立即冰浴anin。(3)加入950yL LB液体培养基，置于37°C摇床，230rpm振荡培养lh，使细胞复苏并表达抗性。(4)3000rmp离心3min。于超净工作台中去900 μ L上清，留100 μ L。(5)取70 μ L菌液均勻地涂布于LB固体培养基上，剩余30 μ L涂布在另外一个LB 固体培养基上。37°C倒置培养12 16h，直至出现菌落。7阳性重组子鉴定用灭菌枪头挑取单个白斑菌落于4mL含有100 μ g/mL Amp的LB液体培养基中， 230rpm，37°C过夜振荡培养。以菌液为模板，用PCR方法对含有插入片段的克隆进行筛选。 菌液PCR反应体系和反应程序参照以上方法。取2. 5 μ L PCR反应产物，经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。8质粒DNA提取(1)取1500μL菌液加入Eppendorf管中，12000rpm，离心lmin，弃上清，浙干残液。(2)加250yL solution I，置于涡旋振荡器上振荡，充分悬浮菌体。(3)加250 μ L solution II，轻轻颠倒混勻4-6次，室温下lmin。整个过程不要超过 5min。(4)加 350 μ L solution III，轻轻混勻，室温下放置 5min。
(5) 12000rmp，离心 lOmin。(6)取上清液，移入柱中。8000rmp离心anin。(7)去废液，力口入 500 μ L washing solutions, lOOOOrmp，lmin。(8)重复(7)。(9)去废液，柱子于lOOOOrmp离心anin。(10)柱子室温下放置lOmin。(11)将柱子套到新的Eppendorf管中，加入50 μ L Elution Buffer。室温下放置 2min, lOOOOrmp 离心 2min。(Elution Buffer 预热到 60°C效果最好)(12)-20°C 保存备用。9质粒DNA浓度检测和测序取2. 5 μ L质粒于1. 0%琼脂糖凝胶中电泳检测浓度。取15个阳性质粒送上海生工生物技术有限公司测序。IODNA序列分析通过DNAMAN和NCBI比对分析，即可发现小麦甲羟戊酸激酶基因序列。实施例4 (通过RACE技术快速获得末端序列)RACE是基于PCR技术基础上由已知一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法。该方法同筛库法相比较，有许多优点首先RACE技术是通过 PCR技术实现的，无需建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有价值的信息。其次，只要引物设计正确，在初级产物基础上就可以获得感兴趣基因的全长。再次，该技术节约了实验时间和经费。IRACE引物的设计通过DNAMAN比对所获得的中间序列，以及NCBI甲羟戊酸激酶基因(橡胶 AB294693,拟南芥 X77793，NM_122627. 4，褐家鼠 NM_031063，小家鼠匪_02；3556 加上玉米 BT062051. 1，水稻ΝΜ001070895，高粱XM 002453136. 1)的序列，寻找最保守的区域。然后用 DNAMAN手工设计引物。引物序列为5' RACE 引物5' CCATGCACTGGAGCAAACCTTGG3‘ (Seq ID No 5)3' RACE 引物；5' TGGTAGGAACACCAAGGCTCTGGT3‘ (Seq ID No 6)2第一链cDNA合成(1)①对于 5' -RACE-ReadycDNA
RNA2 μ L
5'-CDS primer A 1 |aL SMART II A oligo 1 μ L DEPC water1 μ L②对于3' -RACE-Ready cDNARNA2μ L3' -CDS primer A 1 μ LDEPC water2μ L(2)微离心。(3)在 PCR 仪上进行 7O "C anin。
(4)冰上放置anin，微离心。(5)向上管中分别加入
权利要求
1.一种小麦甲羟戊酸激酶基因TaMVK编码区基因序列如kq IDNo 1所示，其编码的氨基酸序列如ID No 2所示。
2.如权利要求1所述的小麦甲羟戊酸激酶基因TaMVK在构建甲羟戊酸激酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物上的应用。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，涉及一种从小麦品种济南13中获得的，参与小麦叶绿素、类胡萝卜素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素、长萜醇、类萜、辅酶Q、甾醇和植物毒素等类异戊二烯物质合成的关键酶基因甲羟戊酸激酶基因TaMVK的分离克隆、酶蛋白的原核表达、酶蛋白的分离纯化及其酶活性的体外检测技术。为进一步构建甲羟戊酸激酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物，尤其是靠次生代谢获取重要商业价值的植物，探讨甲羟戊酸激酶基因在受体植物中的过量表达与次生代谢产物、籽粒大小及粒重等重要农艺性状的关系，进而提高农作物产量，以及对甲羟戊酸激酶基因内含子、外显子及启动子结构进行剖析，研究启动子功能、开发有关分子标记提供重要技术储备。
文档编号A01H5/00GK102433348SQ20111038359
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月28日 优先权日2011年11月28日
发明者刘爱峰, 李永波, 李玉莲, 楚秀生, 樊庆琦, 王宝莲, 隋新霞, 高洁, 黄承彦 申请人:山东省农业科学院作物研究所