降低胆固醇水平的脂质体的制作方法

专利名称：降低胆固醇水平的脂质体的制作方法
技术领域：
本申请总体上涉及脂质颗粒(例如，脂质体)，所述脂质颗粒本身作为治疗剂是有用的或者所述脂质颗粒可用于递送药物和药物的递送方法，并且，具体而言，本申请涉及使用诸如脂质体之类的脂质颗粒递送药物的方法。

发明内容
本发明提供一种降低细胞胆固醇水平的方法，所述方法包括将含有诸如脂质体或胶束之类的脂质颗粒的组合物给药于有此需要的受治者，所述脂质颗粒能够进入细胞。


图1表示a)甲羟戊酸途径和类异戊二烯的合成以及b)不同治疗剂对不同细胞靶标的影响。PP =焦磷酸盐，FTI =法呢基转移酶抑制剂，GGTI =香叶基香叶基转移酶抑制剂，IPP =异戊基焦磷酸盐。图 2 是下列脂质的示意图，A)22:6PE ；B)22:6PC ；C)PI ；D)PS ；Ε)DOPE ；F)CHEMS0图3表示使用了抗肌动蛋白和抗HMGCS抗体的22:6ER脂质体处理的、JC_1_感染的Huh 7. 5细胞(Μ0Ι = 0. 5)的蛋白质印迹分析结果。图 4 表示 22:6PE:22:6PC:PI:PS 处理的、JCl 感染的 Huh7. 5 细胞(Μ0Ι = 0. 5)中
游离胆固醇和总胆固醇的定量结果。图5表示用22 6脂质体处理的PHA刺激的PBMC的定量结果。图6(A)至图6(E)表示与用22:6ER脂质体处理了 16天的JC-I-感染的Huh 7. 5 细胞(Μ0Ι = 0. 02)有关的数据。(A)整个处理过程中Huh 7. 5细胞中JC-I HCVcc感染水平。(B)JC-I HCVcc分泌。(C)分泌的JC-I HCVcc颗粒的感染性。(D)细胞中游离的胆固醇水平。(E)细胞中酯化的胆固醇。数据代表来自两个独立的实验的一式三份样品的平均值。图7表示22:6 ER脂质体处理的JC-I HCVcc、PEG化的22 6 ER脂质体处理的JC-I HCVcc以及未处理的JC-I HCVcc的感染性数据，所述JC-I HCVcc用外源性胆固醇处理(胆固醇的最终浓度为15 μ g/ml和150 μ g/ml)。图8表示在用JC-I HCVcc感染(Μ0Ι = 0. 5)之前用22:6 ER脂质体处理了 4天的未感染的Huh 7. 5细胞的定量结果。图9(A)显示用22:6 ER脂质体处理4天的过程中HIV-I的三种基因不同的初级分离物(LAI，93UG067和93RW024)的平均分泌。图9 (B)显示22:6 ER脂质体处理的PBMC 分泌的HIV-I的感染性。
图10显示未感染的Huh 7. 5细胞的实验结果，所述细胞在存在用于上调和下调脂蛋白受体表达的药物(分别为SQ和25-HC)的条件下在无血清完全DMEM中培养M小时。图11显示在Huh 7. 5细胞感染1小时的过程中，将22:6 puER脂质体加至HCVcc 病毒原液中的实验结果。
具体实施例方式
术语的定义
除非另有说明，单数形式(“a”或“an”)是指一个(一种)或一个以上(一种以上)。
如本文使用的术语“病毒感染”描述了疾病状态，在所述疾病状态中，病毒入侵健康细胞，使用所述细胞的再生机制以繁殖或复制并且最终溶解所述细胞，导致细胞死亡，释放病毒颗粒并且通过新产生的子代病毒感染其他细胞。一些病毒的潜在性感染也可能是由病毒感染引起的。如本文使用的术语“治疗或预防病毒感染”是指抑制特定病毒的复制，抑制病毒传播或防止病毒定居于其宿主中，以及改善或缓解由病毒感染引起的疾病的症状。如果病毒载荷降低，死亡率和/或发病率降低，那么认为所述治疗是治疗性的。术语“治疗剂”是指药剂，例如，分子或化合物，所述药剂可有助于治疗生理病症， 例如病毒感染或由此引起的疾病。术语“脂质体”可被定义为含有脂质的双层结构的颗粒，所述脂质体通常是球形双层结构。术语“脂质体”包括单层脂质体和多层脂质体。本文所讨论的脂质体可包括由下列缩写所表示的一种或一种以上脂质。CHEMS代表琥珀酸胆固醇单酯脂质。DOPE代表二油酰基磷脂酰基乙醇胺脂质。DOPC代表二油酰基磷脂酰基胆碱脂质。PE代表磷脂酰基乙醇胺脂质或其衍生物。PEG-PE代表与聚乙二醇(PEG)结合的PE脂质。PEG-PE的一个实例可以是聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰基乙醇胺脂质。PEG的PEG组分的分子量可不同。Rh-PE代表丽丝胺若丹明B-磷脂酰基乙醇胺脂质。MCC-PE代表1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-W-(ρ-马来酰亚胺基甲基)环己烷-羧酰胺]脂质。PI代表磷脂酰肌醇脂质。PS代表磷脂酰丝氨酸脂质。术语“细胞内递送”是指将包封的物质从脂质体递送进入任何细胞内腔室。IC50或IC90 (抑制浓度50或90)是指用于达到使病毒感染分别降低50%或90% 的治疗剂的浓度。PBMC代表外周血单核细胞。s⑶4代表可溶的⑶4分子。“可溶的⑶4”或“S⑶4”或“D1D2”是指⑶4分子或其片段，如本领域普通技术人员所理解的，所述CD4分子或其片段在水溶液中并且可通过改变HIV Env的构型来模拟天然的膜锚定的⑶4的活性。可溶的⑶4的一个实例是在如Salzwedel 等人，J. Virol. 74 326 333,2000 中描述的双结构域可溶 CD4 (sCD4 或 D1D2)。MAb代表单克隆抗体。DNJ代表脱氧野尻霉素。NB-DNJ代表N- 丁基脱氧野尻霉素。NN-DNJ代表N-壬基脱氧野尻霉素。BVDV代表牛病毒性腹泻病毒。HBV代表乙型肝炎病毒。HCV代表丙型肝炎病毒。HIV代表人免疫缺陷病毒。Ncp代表非细胞病变。Cp代表细胞病变。ER代表内质网。CHO代表中国仓鼠卵巢细胞。MDBK代表马达氏牛肾细胞。PCR代表聚合酶链反应。FOS代表游离寡糖。HPLC代表高效液相色谱。
PHA代表植物红血球凝集素。FBS代表胎牛血清。TCID50代表50%组织培养物感染剂量。ELISA代表酶联免疫吸附分析。IgG代表免疫球蛋白。DAPI代表4’，6- 二脒基_2_苯基吲哚。PBS代表磷酸盐缓冲盐水。LD代表脂质小滴。NS代表非结构性。“Μ0Ι”是指感染复数。DMEM是指Dulbecco改良的Eagle培养基。相关文件本申请公开的内容通过引用合并了美国专利公开第20080138351号、第 20090252785号和第200301M160号的全部内容。巨噬细胞和胆固醇代谢巨噬细胞像其他细胞(除了肝细胞)一样不能将胆固醇降解至任何可检测的程度。因此，细胞胆固醇含量基本上会是胆固醇摄入和胆固醇流出之间的平衡。将胆固醇递送至细胞的两个主要机制可以是受体介导的摄取血浆低密度脂蛋白(LDL)和细胞内胆固醇的生物合成。递送胆固醇的这两个主要途径中的每一个可完全满足在缺乏胆固醇的情况下细胞的需要，并且可被高度调节(Brown and Goldstein 1999，完全引用内容请参见下面参考文献部分的内容)。然而，在一些病理生理学条件下，例如炎症、高血浆LDL浓度和氧化应激可导致形成修饰的(大多数是氧化的)LDL (Meiberg，Parthasarathy等人，1989)。修饰的LDL可与在若干细胞类型(包括巨噬细胞)上表达的清道夫受体(SR)相互作用。修饰的脂蛋白的摄取不以响应细胞胆固醇含量的方式被调节并且可导致过量的胆固醇不受控制地递送至巨噬细胞(Hajjar and Haberland 1997 ；Dhaliwal and Steinbrecher 2000)。 如果不通过增加胆固醇的流出来补偿，那么这可导致胆固醇积累并且形成富脂泡沫细胞， 随后在动脉壁形成脂肪纹，这是动脉粥样硬化斑块形成中最早期的步骤之一。富胆固醇巨噬细胞也可以是动脉粥样硬化发病机制的其他要素的可能的起因，所述其他要素例如，炎症长期存在，平滑肌细胞的表型修饰以及细胞外基质蛋白的过量产生(Lusis 2000)。过量胆固醇可通过下调胆固醇生物合成以及LDL受体的表达来补偿。然而，细胞通过降低LDL 摄取和胆固醇生物合成来补偿由修饰的LDL递送的严重过量的胆固醇的能力可受到限制。 补偿过量的游离胆固醇的两种其他机制可以是合成胆固醇酯和胆固醇流出。虽然合成胆固醇酯可提供暂时的缓解，但是胆固醇酯的连续产生可导致细胞内脂质小滴的过量积累。巨噬细胞过量负载胆固醇可导致所述巨噬细胞凋亡和坏死，这促使晚期动脉粥样硬化斑块的核心坏死和钙化(Tabas 2002 ；Tabas 2002)。细胞中胆固醇生物合成的甲羟戊酸途径甲羟戊酸-类异戊二烯途径的第一步可包括通过HMG-CoA合成酶(HMGCQ的作用从乙酰基-CoA通过乙酰乙酰基CoA合成3-羟基-3-甲基戊二酰基(HMG) -CoA。HMG-CoA 还原酶(HMGCR)本质上是最高度调节的酶之一，HMG-CoA还原酶(HMGCR)可催化HMG-CoA转化为甲羟戊酸(Goldstein and Brown 1990)。已广泛研究了通过他汀类药物和双膦酸盐对甲羟戊酸途径和下游类异戊二烯生物合成途径进行合理的治疗剂控制并且已发现上述合理的治疗剂控制在多种疾病中是令人关注的且是革命性的选择(Buhaescu and Izzedine 2007)。图1表示甲羟戊酸途径和类异戊二烯生物合成。也表示了一些关键治疗剂对其不同的细胞靶标的作用。胆固醇和病毒复制许多病毒可依赖胆固醇进行病毒复制。这些病毒包括但不限于属于疱疹病毒科家族的病毒，例如，单纯疱疹病毒(参见，例如，Itzhaki and Wozniak 2006)和艾伯斯坦-巴尔病毒(参见，例如，Katzman and Longnecker 2003)，所述单纯疱疹病毒可以是 HSVl病毒或HSV2病毒；属于正黏液病毒科家族的病毒，例如流感病毒(参见，例如，Sun and Whittaker 2003)，所述流感病毒可以是流感病毒Α、流感病毒B或流感病毒C ；逆转录酶病毒，例如，鼠白血病病毒(参见，例如，Beer，Pedersen等人，200 和人类免疫缺陷病毒 (HIV)(参见，例如，Mafies,del Real 等人，2000 ；Campbell，Crowe等人，2001) (HIV1 或HIV2 病毒)；属于痘病毒科家族的病毒，例如，牛痘病毒(参见，例如，Chung，Huang等人，2005)； 多瘤病毒(参见，例如，Kaur, Gopalakrishna等人，2004)；属于披膜病毒科家族的病毒，例如西门利克(Semiliki)森林病毒(参见，例如，Chatterjee, Eng等人，2002)；属于丝状病毒科家族的病毒，例如，埃博拉病毒(参见，例如，Empig and Goldsmith 2002)和马尔堡病毒(参见，例如，Bavari, Bosio等人，2002)；属于黄病毒科家族的病毒，包括属于黄病毒属的病毒(例如，登革病毒(参见，例如，Reyes-del Valle，Chavez-Salinas等人，2005))和属于丙型肝炎病毒属的病毒(例如，丙型肝炎病毒(HCV)(参见，例如，AizakLMorikawa等人，2008))；属于副粘病毒科家族的病毒，例如，麻疹病毒(参见，例如，Manie, Debreyne等人，2000)；以及属于肝脱氧核糖核酸病毒科家族的病毒，例如，乙型肝炎病毒(HBV)(参见，例如，Bremer，Bimg等人，2009)。不是所有这些病毒可感染巨噬细胞，这说明胆固醇需求不限于特定细胞类型的感染。尽管普遍认为胆固醇可以是包装病毒的膜的重要成分，但是令人惊讶的是，几乎不知道为什么胆固醇参与病毒复制以及胆固醇如何参与病毒复制。对胆固醇在病毒复制中的作用的大多数认识可限于质膜中的脂筏、富含神经鞘脂的微结构域和富含胆固醇的微结构域的作用。若干包装的病毒可使用类筏结构域作为病毒组装的平台， 例如，HIV(Campbell, Crowe等人，2001)，埃博拉病毒和马尔堡病毒(Bavari，Bosio等人，
2002)，麻疹病毒(Vincent,Gerlier 等人，2000)以及流感病毒(Scheiffele, Rietveld 等人，1999;LeSer and Lamb 2005)。基于发现了红血球凝集素在脂筏中聚集，脂筏也可用作病毒感染过程中的进入点，如流感病毒所表现的(Takeda，Leser等人，2003)。胆固醇耗竭对HIV的作用胆固醇耗竭对HIV复制的作用也可以是间接的，由响应细胞胆固醇含量变化和/ 或胆固醇合成速度变化的细胞代谢的多种变化引起。例如，通过他汀类药物抑制胆固醇生物合成可降低HMG-CoA还原酶的所有上游中间体的固定浓度，包括那些蛋白质异戊二烯化作用中所涉及的中间体(Buhaescu and Izzedine 2007)。小G蛋白的异戊二烯化作用的降低可导致抑制Mio-鸟苷三磷酸酶(GTPase)和Mio-A活化，这使得病毒进入减少(del Real, Jimenez-Baranda等人，2004)。此外，他汀类药物可具有不依赖于其对胆固醇生物合成的作用的多重有益作用，所述多重有益作用可降低HIV感染。这些作用可包括由他汀类药物抑制粘附分子表达的能力(Jain and Ridker 2005)或抑制诸如ICAM-1和LFA-I 之类的受体-配体对在内皮细胞和白细胞上的相互作用(Nishibori，K. Takahashi等人，
2003)的能力而产生的抗炎性质。通过他汀类药物抑制ICAM-I和LFA-I的相互作用可减少HIV粘附至细胞(Giguere and Tremblay 2004)。许多研究已调查了胆固醇在HIV生命周期中的作用。在脂筏处出现HIV-I从宿主细胞中出芽，这导致较高的病毒包膜的胆固醇与磷脂的摩尔比例(> 1. 0) (Aloia, Tian 等人，1993 ；Nguyen and Hildreth，2000)。与筏的这种亲和性可由Gag前体确定，所述亲和性尤其可与这些膜的结构域相关(Ono and Freed 2001 ；Ding，Derdowski 等人，2003 ;Holm，Weclewicz 等人 2003)。脂筏结合可由 Gag 的N-末端介导并且可通过(iag-Gag相互作用结构域显著增强。细胞胆固醇的耗竭和筏数量的减少可显著地并且特异性地降低HIV-I颗粒的产量(Ono and Freed 2001)。除了上述降低胆固醇的药物对HIV进入的间接作用之外，一些研究还提出脂筏作为HIV进入点的作用。该模型依赖于⑶4、HIV细胞受体以及趋化因子受体在HIV进入位点的共帽现象 (Alfano, khmidtmayerova等人，1999)，所述模型也可依赖于胆固醇(Nguyen，Giri等人， 2005)。Viard和其他人的研究(Viard，Parolini等人，200 说明胆固醇耗竭的细胞不能形成病毒-细胞融合必需的⑶4和CXCR4(或CCR5)簇。Manes等人也报道了类似的观察结果(Maiies, del Real等人，2000)，Manes等人提出了对gp_120诱导的筏的横向重组作用，该作用使CD4-gpl20复合物与筏相关趋化因子受体集中在一起。然而，后来的报道显示CD4和趋化因子受体与筏的结合可能不是HIV感染所必需的(Percherancier,Lagane 等人，2003 ;Popik and Alce 2004)。对这些发现结果的一般解释可能是许多研究使用过表达HIV受体的细胞来进行。这些细胞通常可具有与原代细胞不同的行为，如先前对从趋化因子受体发出的信号所证明的，这些细胞可以是HIV进入原代细胞所必需的(Alfano， khmidtmayerova等人1999)。所有这些文章在以下方面意见一致HIV进入依赖于靶细胞膜中的胆固醇，因为胆固醇耗竭抑制了由筏相关CD4以及筏排除CD4介导的HIV进入 (Popik and Alce 2004)。胆固醇在HIV病毒粒子的感染性方面的重要性通过实验来证明，在实验中，用螯合胆固醇的药物(例如，Μβ⑶)处理HIV颗粒使得病毒不能进入细胞(Campbell，Crowe等人2002 ；Guyader,Kiyokawa等人200 。胆固醇耗竭的HIV-I病毒粒子可显示出病毒粒子脂质双层的瓦解(Campbell，Crowe等人2002)，还可显示出正常水平的gpl20Env (Guyader， Kiyokawa等人2002)。一个研究表明Μβ⑶可渗透病毒膜，导致成熟的Gag蛋白(衣壳基质和P6)损失而不损失Env糖蛋白(Graham，Chertova等人2003)。电子显微镜揭示了胆固醇耗竭的病毒粒子的病毒膜内的孔以及病毒核心结构的扰动(Graham，Chertova等人2003)。HIV和动脉粥样硬化HIV感染可持续地与形成动脉粥样硬化的风险增加有关(Hsue，Lo等人2004 ；van Wijk, de Koning等人2006)并且与冠状动脉疾病(CAD)的风险增加至少三倍有关(Hsue and Waters 2005)。这种相关性先前仅归因于抗逆转录病毒疗法的不良作用。虽然胆固醇代谢产生的许多变化(例如LDL提高(El-Mdr，Mulli等人2005)以及通过⑶36表达诱导胆固醇摄入增加(Allred，Smart等人2006))可能是由抗逆转录病毒疗法引起的 (Carpentier, Patterson等人200 ，但是所述疗法和HIV感染本身对胆固醇代谢变化的相对贡献还有待确定。初期研究可说明HIV感染本身可对CAD风险的增加起关键作用。HIV可感染巨噬细胞并且减少这些细胞中的逆向胆固醇输送。减少胆固醇从巨噬细胞中流出可导致细胞内胆固醇积累(Feng and Tabas 2002)并且在动物模型(Aiello，Brees等人2002) 和人体内(Oram 2000)形成动脉粥样硬化。当与血脂异常相关时，该过程可以是特别快速的。这可说明当与抗逆转录病毒疗法引起的血脂异常相关时，HIV感染巨噬细胞可导致胆固醇在巨噬细胞内积累并且快速形成动脉粥样硬化。细胞胆固醇和HCV:HCV感染主要限于肝细胞(Chisari 2005)，肝细胞可能在哺乳动物胆固醇体内平衡方面起到重要作用。已表明CD81(Soldaini，Wack等人2003 ；Cherukuri, Shoham等人 2004)和SR-BI (lihainds，Bourgeois等人2004)定位于富含胆固醇的质膜微结构域(或脂筏)，这两个细胞受体是HCV进入细胞所必需的。SR-BI可与称为小凹(caveolae)的富含胆固醇的质膜微结构域结合(Babitt，Trigatti等人，1997 ；Graf, Connell等人，1999)。已表明⑶81与胆固醇相互作用(Charrin，Mani6等人2003)，该作用为物理作用。虽然目前还不知道HCV感染对细胞胆固醇的依赖，但是HCVpp与脂质体的融合可通过目标膜中胆固醇的存在来提高(Lavillette，Bartosch et al. 2006)。这些数据可有力地说明质膜胆固醇可以是HCV进入所必需的。已表明HCV感染可依赖于⑶81和SR-BI之间的协作相互作用以及细胞胆固醇含量可对HCV进入产生非常大的影响，可能通过调节细胞表面表达和CD81 定位来景i响(Kapadia, Barthet al. 2007)。目前的研究已表明胆固醇和神经鞘脂在HCV感染和病毒粒子成熟方面的重要作用。具体而言，成熟的HCV颗粒可富含胆固醇(Aizaki，Morikawa等人2008)。HCV耗竭或病毒粒子相关SM的水解导致感染性损失(Aizaki，Morikawa等人2008)。而且，加入外源性胆固醇可恢复感染性。此外，部分结构蛋白质可位于细胞内脂筏样膜结构(Aizaki，Lee 等人2004)。
公开的内容本发明的发明人发现诸如脂质体之类的脂质颗粒可通过下调胆固醇的生物合成途径中所涉及的第一批酶中的一个(HMGCQ来抑制胆固醇的生物合成，所述脂质颗粒能够进入细胞和/或细胞内递送包封在该颗粒内部的物质。在一些实施方式中，所述脂质颗粒可包含至少一种PE脂质和/或其衍生物。PE脂质衍生物的例子包括DOPE和结合的PE脂质。所述结合的PE脂质可包括与诸如聚乙二醇之类的亲水性聚合物结合的PE脂质和与诸如荧光标记物之类的标记物结合的PE脂质。所述PE脂质可以是单饱和的或多饱和的。在一些实施方式中，所述脂质颗粒可包括一种或一种以上PI脂质、PS脂质、PC脂质和CHEMS脂质，其中的每一种可以是单饱和的或多饱和的。在一些实施方式中，所述脂质颗粒可包含一种或一种以上与诸如聚乙二醇之类的亲水性聚合物结合的脂质。亲水性聚合物的分子量可不同。结合的亲水性聚合物的使用可增加脂质颗粒的体内稳定性和循环时间。在一些实施方式中，能够抑制胆固醇的脂质颗粒可以是含有PE脂质和/或其衍生物以及CHEMS脂质的脂质颗粒，例如美国专利公开第20080138351号中公开的pH敏感脂质体。例如，这样的脂质颗粒可以是摩尔比为6 4或6 3的D0PE-CHEMS脂质体或摩尔比为 6 3 0. 1 的 DOPE CHEMS PEG—PE。在一些实施方式中，能够抑制胆固醇的脂质颗粒可以是含有PE脂质和/或其衍生物以及PI和/或PS脂质的脂质颗粒。这些脂质颗粒的例子包括2009年3月25日提交的美国专利申请第12/410，750号中公开的靶定ER的脂质体。在一些实施方式中，所述脂质颗粒可以是包括PE脂质、PI脂质、PS脂质和PC脂质的脂质颗粒，PE脂质、PI脂质、PS脂质和PC脂质中的每一种可以是单饱和的或多饱和的。在一些实施方式中，能够抑制胆固醇的脂质颗粒可以是多不饱和脂质颗粒，即，包括至少一种多不饱和脂质的脂质颗粒。本文使用的术语“多不饱和脂质”是指疏水尾端中含有一个以上不饱和化学键的脂质，所述不饱和化学键例如双键或三键。在一些实施方式中，所述多不饱和脂质在其疏水尾端中可具有2个至8个或3个至7个或4个至6个双键。 多不饱和脂质颗粒在美国专利公开第20090252785号中公开。多不饱和脂质的例子在美国专利公开第20090252785号的图2A至图2B以及图22A至图22D中显示。靶定部分在一些实施方式中，含有所述脂质颗粒的组合物可包含至少一种靶定部分，所述靶定部分可与脂质颗粒结合或插入所述颗粒的脂质层或脂质双层。在一些实施方式中，所述靶定部分可以是配体或抗体，所述配体可以是病毒包膜蛋白的配体，所述抗体可以是抗病毒包膜蛋白的抗体。这样的部分可用于将所述颗粒靶定至受病毒感染的细胞。这样的靶定部分也可用于实现抗与病毒相关或由病毒引起的病毒感染的消除性免疫。在一些实施方式中，所述靶定部分可包含gpl20/gp41靶定部分。在这种情况下，含有所述脂质颗粒的组合物可优选地用于治疗和/或预防HIV-I感染。所述gpl20/gp41靶定部分可包含s⑶4分子或单克隆抗体，例如IgG 2F5或IgG bl2抗体。在一些实施方式中，所述靶定部分可包含 El或E2靶定部分，例如来自HCV的El或E2蛋白。在这种情况下，含有所述脂质颗粒的组合物可优选地用于治疗和/或预防HCV感染。在一些情况下，靶定部分也可以是可靶定El和/或E2蛋白的分子(例如这些蛋白质的特异性抗体)以及细胞受体的可溶性部分(例如可溶性CD81或SR-BI分子)。活性剂在一些实施方式中，诸如治疗剂或显像剂之类的至少一种药剂可被包封在所述脂质颗粒的内部。这样的药剂可以是例如水溶性分子、肽或氨基酸。在一些实施方式中，包封在所述脂质颗粒内部的药剂可以是α-葡糖苷酶抑制剂。在一些实施方式中，所述α-葡糖苷酶抑制剂可以是ER α-葡糖苷酶抑制剂，所述ER α-葡糖苷酶抑制剂可以是I型ER α -葡糖苷酶抑制剂或II型ER α-葡糖苷酶抑制剂。 一般来说，依赖于与钙联结蛋白和/或钙网织蛋白的相互作用进行病毒的包膜糖蛋白的正确折叠的任何病毒可被ER α-葡糖苷酶抑制剂靶定。所述α -葡糖苷酶抑制剂可以是抑制宿主α _葡糖苷酶的酶活性的药剂，与不存在所述药剂的条件下的α-葡糖苷酶的酶活性相比，所述α-葡糖苷酶抑制剂抑制至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、 至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或更高的酶活性。术语 “ α -葡糖苷酶抑制剂”包含天然生成的抑制宿主α -葡糖苷酶活性的药剂和合成的抑制宿主α-葡糖苷酶活性的药剂。合适的α -葡糖苷酶抑制剂可包括但不限于脱氧野尻霉素和N-取代脱氧野尻霉素，例如式I的化合物及其药学上可接受的盐其中，R1选自取代或未取代的烷基，所述烷基可以是支链或直链烷基；取代或未取代的环烷基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的氧杂烷基；取代或未取代的芳基烷基，环烷基烷基，并且，其中，W、X、Y、Z分别独立地选自氢、烷酰基、芳酰基和卤代烷酰基。在一些实施方式中，R1可选自C1_C20烷基或C3-C20烷基。在一些实施方式中，R1可选自乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、新戊基、异戊基、η-己基、庚基、η-辛基、η-壬基和η-癸基。在一些实施方式中，R1可以是丁基或壬基。在一些实施方式中，R1可以是烷氧基(oxalkyl)，R1可以是C1-C20烷基或C3-C12 烷基，R1还可包括1至5个或1至3个或1至2个氧原子。烷氧基的例子包括-(CH2)2CKCH 2) 5CH3、- (CH2) 20 (CH2) 6CH3、- (CH2) 60CH2CH3 和 _ (CH2) 20CH2CH2CH3。在一些实施方式中，R1可以是芳基烷基。芳基烷基的例子包括C1-C12-W!基团，例如，C3-Ph、C4-Ph、C5-Ph、C6_Ph 和 C7_Ph。在一些实施方式中，式I的化合物可选自但不限于N-(n-己基_)_1，5_双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(η-庚基-)-1,5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇； N-(η-辛基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(η-辛基_)_1，5-双脱氧-1， 5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N- (η-壬基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(η-癸基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(η-十一烷基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(η-壬基_)_1，5_双脱氧-1， 5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N- (η-癸基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N- (n- i^一烷基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N- (η-十二烷基-)_1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N- (2-乙基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N- (4-乙基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N- (5-甲基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(3-丙基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(1-戊基戊基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N- (1- 丁基丁基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N- (7-甲基辛基_)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N- (8-甲基壬基)-1，5_双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；Ν-(9-甲基癸基)-1，5-双脱氧-1， 5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N- (10-甲基i^一烷基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇； N- (6-环己基己基_) -1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N- (4-环己基丁基)-I，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N- (2-环己基乙基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(l-环己基甲基)-1，5_双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(l-苯基甲基)-1， 5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N- (3-苯基丙基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；Ν-(3-(4-甲基)-苯基丙基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；Ν_(6_苯基己基)-1，5_双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；Ν-(η-壬基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N- (η-癸基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N- (η-十一烷基_) -1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N- (η-十二烷基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N- (2-乙基己基)-1，5-双脱氧-1， 5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N- (4-乙基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；Ν-(5-甲基己基)-1，5_双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；Ν-(3-丙基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(l-戊基戊基己基)-1， 5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N- (1- 丁基丁基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N- (7-甲基辛基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；Ν-(8-甲基壬基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；Ν-(9-甲基癸基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N- (10-甲基十一烷基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N- (6-环己基己基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N- (4-环己基丁基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；Ν-(2-环己基乙基)-1，5_双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(l-环己基甲基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(l-苯基甲基)-1，5_双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N- (3-苯基丙基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N- (3- G-甲基)-苯基丙基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；Ν-(6-苯基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；其药学上可接受的盐；及其任何两个或两个以上的混合物。N-取代的脱氧野尻霉素对其有效的疾病和病症在下列专利文献中公开，美国专利第4，849，430号、第4，876，268号、第5，411，970号、第 5，472，969 号、第 5，643，888 号、第 6，225，325 号、第 6，465，487 号、第 6，465，488 号、 第 6，515，028 号、第 6，689，759 号、第 6，809，083 号、第 6，583，158 号、第 6589，964 号、第 6，599，919号、第6，916，拟9号、第7，141，582号、2010年2月22日提交的美国专利申请第 12/656，993号、2010年2月22日提交的美国专利申请第12/656，992号、2010年2月22日提交的美国临时专利申请第61Λ82，507号、2009年9月4日提交的美国临时专利申请第 61/272，253号、2009年9月4日提交的美国临时专利申请第61/272，252号、2009年6月 12日提交的美国临时专利申请第61/186，614号、2010年2月22日提交的美国临时专利申请第61/^282,508号、2009年9月4日提交的美国临时专利申请第61Λ72，2M号。N-取代的脱氧野尻霉素对其有效的疾病和病症包括但不限于HIV感染、包括丙型肝炎感染和乙型肝炎感染在内的肝炎感染、包括泰-萨氏病、戈谢病、克拉伯病和法布里病在内的溶酶体脂质储存疾病以及囊性纤维化。N-取代的脱氧野尻霉素对其有效的疾病和病症还包括由登革病毒引起的或与登革病毒有关的病毒感染，由属于砂粒病毒科家族的病毒(例如皮钦德病毒或胡宁病毒)引起的或与属于砂粒病毒科家族的病毒(例如皮钦德病毒或胡宁病毒) 有关的病毒感染，由属于痘病毒科家族的病毒(例如牛痘病毒)引起的或与属于痘病毒科家族的病毒(例如牛痘病毒)有关的病毒感染，由属于丝状病毒科家族的病毒(例如埃博拉病毒和马尔堡病毒)引起的或与属于丝状病毒科家族的病毒(例如埃博拉病毒和马尔堡病毒)有关的病毒感染，由属于本扬病毒科家族的病毒(例如裂谷热病毒)引起的或与属于本扬病毒科家族的病毒(例如裂谷热病毒)有关的病毒感染，由属于披膜病毒科家族的病毒(例如基孔肯亚病毒和委内瑞拉马脑膜炎病毒)引起的或与属于披膜病毒科家族的病毒(例如基孔肯亚病毒和委内瑞拉马脑膜炎病毒)有关的病毒感染，由属于正黏液病毒科家族的病毒(例如A型流感病毒)引起的或与属于正黏液病毒科家族的病毒(例如A型流感病毒)有关的病毒感染，所述A型流感病毒包括Hmi和H3N2亚型。在一些实施方式中，所述α -葡糖苷酶抑制剂可以是N-氧杂烷基化的脱氧野尻霉素或N-烷氧基脱氧野尻霉素，例如，美国专利第4，639，436号中描述的N-羟基乙基DNJ(米格列醇(Miglitol)或 Glyset )。在一些实施方式中，所述α -葡糖苷酶抑制剂可以是栗精胺和/或栗精胺衍生物， 例如美国专利申请第2006/0194835号中公开的式(I)的化合物及其药学上可接受的盐，包括6-0- 丁酰基栗精胺(西戈斯韦)和PCT公开W001054692中公开的式II的化合物及其药学上可接受的盐。栗精胺及其衍生物对其有效的疾病和病症在下列专利文献中公开，美国专利第 4，792，558 号、第 4，837，237 号、第 4，925，796 号、第 4，952，585 号、第 5，004，746 号、 第 5，214，050 号、第 5，264，356 号、第 5，385，911 号、第 5，643，888 号、第 5，691，346 号、 第 5，750，648 号、第 5，837，709 号、第 5，908，867 号、第 6，136，820 号、第 6，583，158 号、第 6，589，964号、第6，656，912号以及美国专利公开第20020006909号、第20020188011号、第 20060093577号、第20060194835号、第20080131398号。栗精胺及其衍生物对其有效的疾病和病症包括但不限于包括HIV感染在内的逆转录酶病毒感染；脑型疟疾；包括乙型肝炎感染和丙型肝炎感染在内的肝炎感染；糖尿病以及溶酶体储存疾病。在一些实施方式中，所述α-葡糖苷酶抑制剂可以是阿卡波糖(0-4，6-双脱氧-4-[ [ (1S，4R，5S，6S) -4，5,6-三羟基-3-(羟基甲基)_2_ 环己-1-基]氨基]-α -D-吡喃葡萄糖基-(1 — 4)-0- —-D-吡喃葡萄糖基-(1 — 4)-D-葡萄糖)或I^recose⑧。阿卡波糖在美国专利第4，904，769号中公开。在一些实施方式中，所述α-葡糖苷酶抑制剂可以是阿卡波糖的高度纯化的形式(参见，例如，美国专利第4，904，769号)。在一些实施方式中，包封在脂质体内部的药剂可以是离子通道抑制剂。在一些实施方式中，所述离子通道抑制剂可以是抑制HCVp7蛋白质活性的药剂。离子通道抑制剂及其识别方法在美国专利公开第2004/0110795中详细描述。合适的离子通道抑制剂包括式 I的化合物及其药学上可接受的盐，包括N-(7-氧杂-壬基)-1，5，6_三脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-7-氧杂-壬基6-MeDGJ或UT231B)和N-10-氧杂i^一烷基-6-MeDGJ。 合适的离子通道抑制剂还包括但不限于N-壬基脱氧野尻霉素、N-壬基脱氧半乳糖野尻霉素和N-氧杂壬基脱氧半乳糖野尻霉素。在一些实施方式中，包封在脂质体内部的药剂可以是亚氨基糖。合适的亚氨基糖包括天然生成的亚氨基糖和合成的亚氨基糖。在一些实施方式中，所述亚氨基糖可以是脱氧野尻霉素或N-取代的脱氧野尻霉素的衍生物。合适的N-取代的脱氧野尻霉素的衍生物的例子包括但不限于本申请式II的化合物，美国专利第6，545，021号中的式I的化合物以及N-氧杂烷基化的脱氧野尻霉素，例如美国专利第4，639，436号中描述的N-羟基乙基 DNJ (米格列醇或Glyset )。在一些实施方式中，所述亚氨基糖可以是栗精胺或栗精胺的衍生物。合适的栗精胺衍生物包括但不限于美国专利申请第2006/0194835号中公开的式(I)的化合物及其药学上可接受的盐以及PCT公开W001054692中公开的式II的化合物及其药学上可接受的
Τττ . ο在一些实施方式中，所述亚氨基糖可以是脱氧半乳糖野尻霉素或其N-取代的衍生物，例如在PCT公开W099/24401和W001/10^9中所公开的那些。合适的N-取代脱氧半乳糖野尻霉素衍生物的例子包括但不限于N-烷基化的脱氧半乳糖野尻霉素(N-烷基-1， 5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇)(例如N-壬基脱氧半乳糖野尻霉素)和N-氧杂-烷基化的脱氧半乳糖野尻霉素(N-氧杂-烷基-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇)(例如，N-7-氧杂壬基脱氧半乳糖野尻霉素)。在一些实施方式中，所述亚氨基糖可以是N-取代的1，5，6_三脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-取代的MeDGJ)，包括但不限于式II的化合物 其中，R选自取代或未取代的烷基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的杂环基，或者取代或未取代的氧杂烷基。在一些实施方式中，取代或未取代的烷基和/或取代或未取代的氧杂烷基包含1至16个碳原子或4至12个碳原子或8至10个碳原子。在一些实施方式中，取代或未取代的烷基和/或取代或未取代的氧杂烷基包含1至4个氧原子，以及在其他实施方式中，取代或未取代的烷基和/或取代或未取代的氧杂烷基包含1至2 个氧原子。在其他实施方式中，取代或未取代的烷基和/或取代或未取代的氧杂烷基包含 1至16个碳原子和1至4个氧原子。因此，在一些实施方式中，R选自但不限于_ (CH2) 60CH 3、_ (CH2) 60CH2CH3、_ (CH2) 60 (CH2) 2CH3、_ (CH2) 60 (CH2) 3CH3、_ (CH2) 20 (CH2) 5CH3、_ (CH2) 20 (CH2) 6CH3 和-(CH2)2O (CH2) 7CH3。N-取代 MeDGJ 在例如 PCT 公开 WOO 1/104 中公开。在一些实施方式中，包封在脂质体内部的药剂可包括具有式III的含氮化合物或其药学上可接受的盐
权利要求
1.一种降低细胞胆固醇水平的方法，所述方法包括将含有能够进入细胞的脂质颗粒的组合物给药于有此需要的受治者。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述脂质颗粒含有至少一种磷脂酰乙醇胺脂质或其衍生物。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述脂质颗粒还包括琥珀酸胆固醇单酯脂质。
4.如权利要求2所述的方法，其中，所述脂质颗粒还包括磷脂酰胆碱脂质、磷脂酰肌醇脂质或磷脂酰丝氨酸脂质中的至少一种。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述脂质颗粒包括磷脂酰胆碱脂质、磷脂酰肌醇脂质和磷脂酰丝氨酸脂质。
6.如权利要求2所述的方法，其中，所述脂质颗粒包括二油酰基磷脂酰乙醇胺脂质。
7.如权利要求2所述的方法，其中，所述脂质颗粒包括PEG-PE脂质。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述脂质颗粒包括至少一种多不饱和脂质。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述脂质颗粒包括至少一种多不饱和PE脂质。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述多不饱和PE脂质是22:6PE脂质。
11.如权利要求8所述的方法，其中，所述脂质颗粒包括至少一种多不饱和PC脂质。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述多不饱和PC脂质是22:6PC脂质。
13.如权利要求1所述的方法，其中，所述脂质颗粒包括22:6PE脂质、22:6PC脂质、PI 脂质和PS脂质。
14.如权利要求1所述的方法，其中，所述脂质颗粒包括18:IPE脂质、18: IPC脂质、PI 脂质和PS脂质。
15.如权利要求1所述的方法，其中，所述受治者包括至少一种细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其中，在所述给药之前，所述至少一种细胞包括至少一种受病毒感染的细胞，并且，其中，所述给药降低了受感染的细胞的感染能力。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述病毒是HCV病毒。
18.如权利要求1所述的方法，其中，所述受治者是温血动物。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述受治者是人类。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述给药导致治疗疾病或病症或者预防疾病或病症中的至少一种，所述疾病或病症由细胞胆固醇水平增加引起或与细胞胆固醇水平增加有关。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述疾病或病症是动脉粥样硬化或冠状动脉疾病。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述受治者是受到免疫缺陷病毒感染的受治者， 并且，其中，所述动脉粥样硬化或冠状动脉疾病由免疫缺陷病毒引起或与免疫缺陷病毒有关。
23.如权利要求18所述的方法，其中，所述给药导致治疗或预防由病毒引起的或与病毒有关的疾病或病症，所述病毒依赖细胞内胆固醇进行复制。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述病毒选自单纯疱疹病毒、流感病毒、鼠白血病病毒、牛痘病毒、多瘤病毒、艾伯斯坦-巴尔病毒、西门利克森林病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、登革病毒、麻疹病毒、HIV、丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒。
25.如权利要求23所述的方法，其中，所述组合物还包括包封在所述脂质颗粒内部的抗病毒剂。
26.如权利要求18所述的方法，其中，所述给药皮下进行。
27.如权利要求1所述的方法，其中，所述脂质颗粒为脂质体。
全文摘要
本发明提供使用能够进入细胞的脂质颗粒降低细胞胆固醇水平的方法。所述脂质颗粒可用于治疗或预防由细胞胆固醇水平增加引起的或与细胞胆固醇水平增加有关的疾病或病症，并且，所述脂质颗粒可用于治疗或预防由病毒引起的或与病毒有关的疾病或病症，所述病毒依赖细胞胆固醇进行复制。
文档编号A61K31/683GK102427804SQ201080021813
公开日2012年4月25日 申请日期2010年3月26日 优先权日2009年3月27日
发明者妮科尔·齐兹曼, 斯蒂芬妮·波洛克, 雷蒙德·德韦克 申请人:牛津大学之校长及学者