羟基酪醇的新用途的制作方法

专利名称：：羟基酪醇的新用途的制作方法羟基酪醇的新用途本发明涉及羟基酪醇用于诱导或增强软骨修复或软骨再生的用途。另外，本发明涉及包含羟基酪醇的营养药物组合物和药物组合物，其用于再生和修复关节中的软骨损伤，尤其是外伤性软骨损伤。关节是动物(包括人)中两块或多块骨(例如膝、踝、足、髋、腕、肘、肩、脊椎关节、手和手指)之间的连接点。软骨是特殊类型的致密结缔组织，并存在于体内若干个位点处，例如耳、呼吸道、椎间盘，和关节中骨末端表面的衬里中。软骨是由细胞(成软骨细胞、软骨细胞)组成的无血管组织，其包埋在广泛的细胞外基质(ECM)中，所述细胞外基质主要由胶原(例如II、IX和XI类胶原)、蛋白聚糖(例如硫酸软骨素、硫酸角质素、透明质酸和硫酸皮肤素蛋白聚糖)和其他蛋白质组成。存在三种主要的软骨类型(i)透明软骨或关节软骨，(ii)纤维软骨，(iii)弹性软骨。这三种类型在结构和功能上有所区别。成熟关节软骨中唯一的细胞类型——软骨细胞是终末分化的细胞，其维持软骨特异的基质表型。在正常条件下它们具有低代谢，形成关节组织特有的n、ix和xi型胶原，并且与特异的蛋白聚糖反应，形成水合的透明软骨的ECM。由于下文提到的原因，不同的因素引起软骨生理学的不平衡。这可能影响生产ECM的细胞种群；或者，内稳态在ECM水平上被破坏，并且由于ECM组件(例如聚集蛋白聚糖、胶原或透明质酸)合成的不足或更经常由于提高的ECM降解，而导致增强的ECM腐蚀。在发育的早期阶段(胎儿期或幼年期)，软骨发生最终导致骨骼发育、软骨细胞分化和成熟，所述软骨细胞的成熟在软骨内骨化(endochondralossification)期间导致软骨和骨的形成。该过程由细胞与周围基质以及多量的生长和分化因子之间的相互作用控制，所述生长和分化因子以受到紧密调节的时间和空间方式形成。最早的软骨分化形成间质祖细胞。这些逐渐转化为增殖的软骨细胞，变得肥大并分泌ECM组件(聚集蛋白聚糖、透明质垸、胶原)。在骨形成期间，软骨细胞在软骨膜处被转化为成骨细胞。在软骨发生和随后的骨形成期间，包括例如FGFs、IGF-1、TGF-/3、BMPs的生长因子以及信号转导和转录因子(SMADs、SOXs、STAT)先后被活化。尽管这些是细胞株系特异分化事件的前提条件，但是它们也是ECM蛋白质表达所需要的。例如，SOX调节胶原II和聚集蛋白聚糖的表达，GADD45调节细胞凋亡和软骨细胞的终末分化，并可能抗衡MMP-9的作用。(i)在骨生长停止时，透明软骨或关节软骨覆盖骺(即关节中的骨关节面(articularsurfacesofbone))。这通过使骨相互之间平滑移动，而在哺乳动物关节运动中起关键作用。透明软骨由位于大量ECM中的软骨细胞组成，所述ECM主要由水、II型胶原和带负电的蛋白聚糖组成，形成以胶原纤维的方向为基础的有组织的结构。因此，透明软骨作为一类吸收冲击的结构(shock-absorbingstructure)发挥作用，其能够经受压迫、拉伸和剪力，分散负荷，还提供几乎无摩擦的关节表面。(ii)纤维软骨包括关节间纤维软骨(interarticularfibrocartilage)、纤维软骨盘(例如关节盘(meniscus))、连接纤维软骨(connectingfibrocartilage)和环形纤维软骨(circumferentialfibrocartilage)。在纤维软骨中，微-多糖网络与突起的胶原束交织，并且软骨细胞比透明软骨或关节软骨中更广泛地分散。关节间纤维软骨存在于暴露于振荡并且进行频繁运动的关节中，例如膝关节盘中。关节盘在膝关节稳定性、润滑性和力传递中发挥关键作用。与衝密切结合的纤维软骨盘由纤维组织的同心环组成，其间插入软骨板(例如脊柱的椎间盘)。(iii)弹性软骨含有组织学上与弹性蛋白纤维类似的胶原纤维。其主要存在于会厌、外耳和听管(auditorytube)中。软骨维护需要组织组件的健康代谢，这需要合成代谢(建成)和分解代谢(分解)事件之间的精细平衡，从而分别防止细胞外基质(ECM)的肥大或过量降解。ECM由胶原和蛋白聚糖组成，其为合成代谢事件期间有活性的胶原基因或聚集蛋白聚糖基因的产物。另外，包括SOX-5、SOX-6和SOX-9的SOX转录因子的表达能够有助于软骨细胞的增殖和更新。5基质金属蛋白酶(MMPs)是器官和组织重塑的工具。不同MMP家族成员的组织特异性表达赋予它们大量不同的功能。尽管ECM的降解与MMP3或MMP13的表达相关，但是其他MMP活化潜在的信号转导分子(如VEGF、GF)并引发组织构造的改变或促迸细胞迁移。平衡的ECM代谢是维持软骨健康的前提条件。过量MMP活性造成的净ECM降解能够导致组织破坏、退化和丧失功能。软骨损伤主要归因于创伤，并可以在任何关节中发生。它们可以由急性外伤性损伤(通常是剪力造成的)造成，特别是由高度撞击和/或转动的运动中的外伤性损伤造成，并且通常伴随着韧带断裂、损伤或报废。软骨损伤也是对关节的重复过度机械应力的结果，如在运动员和军队成员的强烈体育锻炼活动期间就是这样。进行具有转动、快速方向改变并负荷应力的运动的受试者(例如跑步运动员，足球运动员，举重运动员，网球运动员，篮球、手球、滑雪运动员和射击运动员)处于提高的软骨损伤的风险下。在运动员中膝关节和踝关节非常频繁地受伤，主要在急性创伤后发生，并且如果不治疗的话会导致运动员的慢性残疾。更年轻的、骨骼未成熟的运动员甚至处于提高的软骨损伤的风险下。另外，更年轻的成人也更可能参与激烈的体育运动，因此更可能受伤。因此，软骨损伤是长期实践高度撞击运动的受试者中残疾的常见原因。软骨损伤严重性依赖于组织压迫的峰值应力、劳损和劳损率，有害机械负荷的持续时间，和软骨组织的生物化学特性和成熟状态。推测这进一步取决于个体的遗传构成。机械性软骨损伤导致关节表面的裂隙或原纤维形成(fibrillation)，并且破坏胶原网络。因此，蛋白聚糖更加水合；这导致软骨增厚和变软。这导致降低的吸收撞击和支持重量负荷的能力，所述降低进一步破坏胶原框架并加重软骨缺陷。这些显示为软骨组织结构完整性中的裂隙、空腔、洞或其他重大破裂。其也可以是软骨脱离其与骨或韧带的连接点。机械性软骨损伤还导致软骨细胞死亡；因此其损害软骨细胞合成修复软骨组织必需的大分子的能力。软骨水平上所有机械性引起的改变引发下述生物化学过程，所述生物化学过程最终会重建伤害前的内稳态。小片段的ECM能够产生导致MMP活化的胶原或蛋白聚糖的降解产物，所述MMP自身会扩大降解过程。事实上，MMP可能在损伤后数小时内可观地增加滑液。ECM构成的改变可诱导引发下述细胞增殖和分化的过程，所述细胞重新合成被降解的ECM组分。根据机械论，先前被描述为软骨细胞增殖和分化的重要元件的分子必然涉及这些过程。因此，可以预期调控它们表达的物质在软骨重建或更新和修复的水平上具有有益影响。诱导或增强软骨修复或软骨再生在本发明的范围内被定义为通过软骨细胞的增殖和/或提高软骨中的ECM生产而形成新的软骨组织，并促进软骨损害的愈合，尤其是在运动员、具有活跃生活方式的其他人和肥胖受试者的关节中。在本发明中，通过参与细胞更新或参与ECM重建的关键分子的表达来测量软骨修复或软骨再生的诱导或增强。因此，从现存的活细胞中再生受伤或受损组织重建所需的某些类型的软骨组织。新软骨形成足以至少部分地填充缺损位点处的空隙或结构中断，但是，修复不表示或者不必是完全愈合的过程。关于潜在的细胞和分子作用模式，上述所有参数被认为是重要的，其反映了重建创伤导致的软骨缺损的过程。软骨损伤难以治疗，并且受伤的软骨不像其他身体组织一样快速或有效地恢复，因为软骨细胞具有有限的增殖能力和新ECM合成能力。事实上，软骨细胞在软骨下生长期间经历了强烈增殖期，但是它们在较晚的阶段具有有限的增殖能力。因此，软骨缺损可保持未修复或被功能不足的细胞外基质填充。因此，对诱导和/或增强软骨损伤或软骨再生，尤其是用于治疗或辅助治疗外伤性软骨损伤的药剂，尤其是来自天然来源的药剂存在很大需要。令人惊讶地发现，羟基酪醇能有效诱导或增强软骨细胞的增殖，刺激软骨细胞增殖和提高它们生产细胞外基质组分的能力，进而促进软骨修复和再生。因此，羟基酪醇适用于在动物关节中维持软骨健康，诱导或增强软骨修复或软骨再生，以及治疗软骨损害，所述动物包括人，尤其是具有活跃生活方式的人、运动人群和肥胖受试者。因此，本发明的一个目的是羟基酪醇用于诱导或增强软骨修复或软骨再生的用途。本发明的另一个目的是羟基酪醇的以下用途(i)增强软骨细胞增殖，(ii)刺激软骨细胞增殖和/或(iii)提高细胞外基质的合成，尤其是用于治疗例如外伤性软骨损伤导致的软骨损害。本发明的另一目的是羟基酪醇用于维护和支持软骨健康，提供软骨护理，愈合软骨损害和提供软骨完整性即用于软骨护理的用途。具体地，本发明涉及如上所述的羟基酪醇用于以下的用途维护和/或促进关节健康，预防关节僵直，提高关节可动性，提供柔软和/或灵活的关节，润滑关节和减少关节问题。另外，本发明涉及羟基酪醇作为有效的微量营养素用于软骨维护、软骨修复和/或软骨再生的用途。在本发明的所有实施方式中，术语软骨优选地涉及关节软骨。用于人(通常针对70kg的人测定)的羟基酪醇每日剂量至少为0.1mg。优选地，每日剂量应当在从约1mg/天到约2000mg/天、更优选地从约5mg/天到约500mg/天、最优选地从10到100mg/天的范围内。在另一实施方式中，本发明涉及羟基酪醇用于治疗或辅助治疗关节中软骨损伤、尤其是外伤性软骨损伤、特别是在具有活跃生活方式的人群、运动人群和肥胖受试者中的用途。本文中使用的术语羟基酪醇[4-(2-羟乙基)-l，2-苯二酚，CAS:10597-60-1]是指合成的羟基酪醇以及可得自天然来源的羟基酪醇，例如通过提取和/或纯化衍生自橄榄树的产物和副产物而获得。另外，术语羟基酪醇包括含有羟基酪醇的提取物以及橄榄汁制剂。另外，术语羟基酪醇还包括其生理学/药学可接受的盐，例如钠盐或钾盐。合成的羟基酪醇可以以>90%的纯度在包括下述步骤的方法中制备在贵金属氢化催化剂存在下，在Cwo-链烷醇中氢化3,4-二羟基杏仁酸或3，4-二羟基杏仁酸Cmo-院基酷，并且任选地还原形成的(3，4-二羟基苯基)-乙酸Cn烷基酯，形成2-(3，4-二羟苯基)-乙醇(=羟基酪醇)，其特定的例子在下文中描述。可以通过本领域技术人员已知的方法，例如通过HPLC或LC-MS测定羟基酪醇的纯度。氢化可以在贵金属催化剂例如Pd和/或Rh的存在下，以本身已知的方式进行。为了提高催化剂的活性和稳定性，优选地在载体例如活性炭、氧化铝或硅藻土上使用它们。本发明情况下优选的氢化催化剂是Pd/C。氢化在低级链烷醇即Cwo-链烷醇的存在下(例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇，优选地在甲醇或乙醇中)，优选地在强酸(优选盐酸)的存在下，优选地在从室温到IO(TC或更高(优选地从40-65°C)的温度下，优选地在至少高于溶剂在氢化温度下的蒸汽压的氢化压强下进行。压强可以从常压(即大气压)到100bar或更高。需要时，优选地作为贯通过程(throughprocess)进行的反应可以在两个独立步骤中完成，即其中通过酸的酯化建立3，4-二羟基杏仁酸酯的第一步骤，和其中氢化3,4-二羟基杏仁酸低级垸基酯的第二步骤。可以以已知的方式实现(3，4-二羟基苯基)-乙酸Cn垸基酯的还原，得到羟基酪醇。优选的还原剂是铝和硼的络合杂合物，例如LiAlH4和NaBH4。起始材料3，4-二羟基杏仁酸是公知的，并且可以根据文献中所述方法制备，例如通过儿茶酚与乙醛酸的缩合制备。也可以对羟基酪醇的一个或若干个羟基醚化或酯化，形成例如乙酸酯。羟基酪醇也可以从天然来源获得，例如通过提取和/或纯化来自衍生自橄榄树的产物或副产物而获得。衍生自橄榄树的产物和副产物包括橄榄、橄榄树叶、橄榄果肉、橄榄油、衍生自橄榄的植被水和橄榄油渣，但不限于此。可通过本领域技术人员公知的方法制备提取物。例如，可压榨橄榄和/或橄榄叶，获得包含橄榄油、植被水和固体副产物的混合物。羟基酪醇可以混合物直接使用，或将混合物进一步分级分离和/或纯化获得富集的羟基酪醇。分级分离方法的例子包括用有机溶剂、色谱如高压液相色谱(HPLC)或使用超临界流体进行分离。涉及从橄榄叶提取羟基酪醇的参考文献的例子为WO02/18310Al、US2002/0198415Al、WO2004/005228Al、US6,416,808和US2002/0058078Al，其公开了对橄榄植被水进行2到12个月的酸水解，直到至少90%存在的橄榄苦苷被转化为止。从橄榄、橄榄果肉、橄榄油和榨油废水(oilmillwastewater)中提取羟基酪醇的方法在UsanaInc.的专利US6,361,803和WOOl/45514Al和US2002/0004077Al中有描述。EP1582512Al描述了从橄榄叶提取羟基酪醇。从去核(de-pitted)橄榄的植被水中获得羟基酪醇的方法在US2004/0039066Al中的第-段被公开。本发明可使用的可商业获得的含羟基酪醇的橄榄提取物例如包括来自橄榄果实的提取物，如来自LifeExtension的Polyphen-Oil，来自Indena的OleaSelect，来自Genosa的Hytolive，来自Seppic的Prolivols,来自Lalilab的OLIVELEAF或OLIVEWaterExtractofOleaeuropea，来自Ebiser的Hitofulvic,如EP1582512中所述的水解橄榄叶提取物，如可得自Furfoml和来自CreAgri的HIDROX⑧的富含橄榄苦苷的橄榄叶提取物。优选地使用来自CreAgri的HIDROX,如HIDROX2%喷雾干燥粉末、HIDROXGold冻干粉末(9n/。)和HIDROX6%冻干粉末有机橄榄汁提取物。优选地，使用的羟基酪醇得自天然来源，例如是含羟基酪醇的橄榄衍生的提取物或橄榄汁制剂形式。剂量以羟基酪醇含量为基础调节，并可由本领域技术人员容易地确定。在另一实施方式中，本发明涉及羟基酪醇用于制备组合物的用途，所述组合物用于(a)诱导或增强动物(包括人)关节中的软骨修复或软骨再生，(b)增强动物(包括人)关节中的软骨细胞增殖，(c)刺激动物(包括人)关节中的软骨细胞增殖，(d)提高动物(包括人)关节中细胞外基质的合成，和/或(e)维护并支持软骨健康，提供软骨护理，愈合软骨损害和提供软骨完整性，尤其是用于维护和/或促进关节健康，预防关节僵直，提高关节可动性，提供柔软和/或灵活的关节，润滑关节和减少关节问题。在又一实施方式中，本发明涉及羟基酪醇用于制造组合物的用途，所述组合物用于治疗或辅助治疗关节中的软骨损伤，尤其是外伤性软骨损伤。另外，本发明涉及包含下述用量羟基酪醇的组合物，所述用量能有效10治疗或辅助治疗关节中的软骨损伤，尤其是动物(包括人)关节中的外伤性软骨损伤。根据本发明的组合物是特别吸引人的，因为患者对被认为是"天然的"疗法具有特殊的兴趣，所述疗法具有温和的作用并且不具有大的副作用，所述疗法可以被用于疾病预防和作为辅佐疗法。根据本发明的组合物尤其适用于在具有活跃生活方式的人群、运动人群和肥胖受试者中诱导或增强软骨修复或软骨再生，以促进软骨的愈合并填补软骨缺损。在本发明的所有实施方式中，优选地组合物是营养药物或药物，尤其是营养药物组合物。在本发明的范围中，动物表示所有动物，包括哺乳动物，其例子包括人。除人以外优选的哺乳动物的例子是非反刍动物或反刍动物，包括猫、狗、单峰骆驼、骆驼、大象和马。根据本发明尤其优选的是人，特别是具有活跃生活方式的人、运动人群和肥胖受试者。本文使用的术语营养药物组合物包括食物制品、食品、膳食补剂、营养补剂或用于食物制品或食品的补剂组合物，优选地为饮料(例如但不限于运动饮料、功能性水、果汁、思慕雪；即食饮品)、汤、乳制品(例如但不限于单次酸乳饮品(singleshotyogurtdrink))、营养棒和涂抹物(spreads),尤其是饮料和营养棒。本文使用的术语"食物制品"是指适用于被人或动物消耗的任何食物或词料。食物制品可以是经制备和包装的食物(例如蛋黄酱、色拉酱、面包或乳酪食物)或动物饲料(例如挤压和成粒的动物饲料、粗混合词料或宠物食物组合物)。本文使用的术语"食品"是指适合人或动物消耗的任何物质。术语"食品补剂"是指用于补充人或动物膳食的少量化合物，其被包装在单个或多个剂量单位中。膳食补剂通常不提供大量的卡路里，但是可含有其它微量营养物(例如维生素或矿物)。术语"营养补剂"是指包含与卡路里来源组合的膳食补剂的组合物。在一些实施方式中，营养补剂是肉替代物或补剂(例如营养或能量棒或营养饮料或浓縮物)。食物制品或食品为例如饮料(如非酒精饮品和酒精饮品)以及要被添加进饮用水和液体食物中的液体制剂，非酒精饮品为例如软饮、运动饮品、果汁(例如橙汁、苹果汁和葡萄汁)；柠檬水、茶、接近水的饮品和乳和其它乳制品饮品(例如酸乳饮品)和减肥饮品。在另一实施方式中，食物制品或食品是指包含本发明的组合物的固体或半固体的食物。这些形式可包括但不限于烘焙的商品如蛋糕和曲奇、布丁、乳制品、糖膏(confection)、点心食物或冷冻糖膏或花式新品(novelties)(例如冰激凌、奶昔)，制备的冷冻肉、糖果、点心制品(例如薯片)，液体食物如汤、涂抹物、酱、沙拉酱、制备的肉制品、乳酪、酸乳和任何其它含脂肪或油脂的食物，和食物成分(例如小麦粉)。术语食物制品或食品还包括功能性食物和制备的食物制品，后者是指适合人消耗的任何预先包装的食物。包括宠物食物组合物的动物饲料有利地包括旨在补充必需膳食需要的食物，以及调剂物(treats)(例如狗饼千)或其它食物补剂。包含本发明的组合物的动物词料可以是干燥组合物(例如粗粒)、半潮湿组合物、潮湿组合物，或其任何混合物的形式。或者或另外，动物词料是补剂，例如肉汤、引用水、酸乳、粉末、悬浮液、咀嚼物(chew)、调剂物(例如饼干)或任何其它递送形式。本发明的膳食补剂可以以任何合适的方式被递送。在一些优选的实施方式中，膳食补剂被配制为用于口递送。本发明的膳食补剂的成分包含在可接受的用于口消耗的赋形剂和/或载体中。载体和由此产生的膳食补剂自身的实际形式不是关键的。载体可以是液体、凝胶、软胶囊、胶囊、粉末、固体片剂(包衣或非包衣的)、茶等等。膳食补剂优选地以片剂或胶囊的形式，最优选以硬(壳)明胶胶囊的形式。合适的赋形剂和/或载体包括麦芽糖糊精、碳酸钙、磷酸二钙、磷酸三钙、微晶纤维素、葡萄糖、米粉、硬脂酸镁、硬脂酸、交联羧甲基纤维素钠、淀粉羟乙酸钠、交聚维酮、蔗糖、植物胶、乳糖、甲基纤维素、聚维酮、羧甲基纤维素、玉米淀粉等等(包括其混合物)。优选的载体包括碳酸钙、硬脂酸镁、麦芽糖糊精及其混合物。使用传统的技术将多种成分和赋形剂和/或载体混合并形成想要的形式。本发明的片剂或胶囊可以用肠包衣包裹，所述肠包衣在约溶解而不在胃中溶解的合适肠包衣是醋酸邻苯二甲酸纤维素(celluloseacetatephthalate)。配制和施用技术的更多细节可见于最新版的Remington'sPharmaceuticalSciences(MaackPublishingCo"Easton，PA)。在其它一些实施方式中，膳食补剂作为适合被消费者添加进食物或饮料中的粉末或液体提供。例如，在一些实施方式中，膳食补剂可以以粉末的形式被施用给个体，所述粉末例如要通过混合进饮料中使用，或通过搅拌进半固体的食物(如布丁、点心(topping)、酱、浓汤(puree)、烹调的谷物或沙拉酱)中使用，或以其它方式通过添加进食物(例如封装在食物或饮料容器的盖中，用于在消耗前立即释放)使用。膳食补剂可含有一种或多种惰性成分，特别是如果期望限制由膳食补剂添加进食谱中的卡路里数时。例如，本发明的膳食补剂也可以含有任选的成分，包括例如草药、维生素、矿物、强化剂、着色剂、甜味剂、调味剂、惰性成分等等。在一些实施方式中，膳食补剂还含有维生素和矿物，包括但不限于三碱基的(tribasic)磷酸钙或醋酸钙；二碱基的磷酸钾；硫酸镁或氧化镁；盐(氯化钠)；氯化钾或醋酸钾；抗坏血酸；正磷酸铁；烟酰胺；硫酸锌或氧化锌；泛酸钙；葡萄糖酸铜；核黄素；]8-胡萝卜素；盐酸吡哆醇；硫胺单硝酸酯；叶酸；生物素；氯化铬或甲基吡啶酸铬(chromiumpiC0l0nate);碘化钾；硒酸钾；钼酸钠；叶绿醌；维生素D3;氰钴铵素；亚硒酸钠；硫酸铜；维生素A;维生素C;肌醇；碘化钾。维生素和矿物的合适剂量可以通过参考U.S.RDA指南获得。在其它一些实施方式中，本发明提供了包含本发明的组合物的营养补剂(例如能量棒或肉代替品棒或饮料)。营养补剂可以作为进餐或点心替换物使用，并通常提供养分卡路里。优选地，营养补剂以平衡的量提供碳水化合物、蛋白质和脂肪。营养补剂还可包含碳水化合物，单糖、中链长度糖或多糖或其组合。单糖可以针对想要的感觉特性选择。未烹饪的淀粉是复杂碳水化合物的一个例子。如果期望其维持其高分子量结构，则食物配制物或其部分中仅应该包含未经烹饪或加热加工的碳水化合物，因为加热会将复杂的碳水化合物分解为简单碳水化合物，其中简单碳水化合物是单糖或二糖。在一个实施方式中，营养补剂包含三种链长度水平的碳水化合物(简单、适中和复杂；例如蔗糖、麦芽糖糊精和未烹饪的玉米淀粉)来源的组合。要掺入本发明的营养补剂中的蛋白质来源可以是用于营养配制物中的任何合适的蛋白质，其可包括乳清蛋白、乳清蛋白浓縮物、乳清粉末、卵、大豆粉、大豆乳、大豆蛋白、大豆蛋白分离物、酪蛋白酸盐(例如酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钙钠、酪蛋白酸钙、酪蛋白酸钾)、动物和植物蛋白质和水解产物及其混合物。选择蛋白质来源时，首先应当考虑蛋白质的生物学价值，最高的生物学价值在酪蛋白酸盐、乳清、乳清蛋白、卵清蛋白和全卵蛋白中发现。在一个优选的实施方式中，蛋白质是乳清蛋白浓縮物和酪蛋白酸钙的组合。这些蛋白质具有高生物学价值；即它们具有高比例的必需氨基酸。参阅ModemNutritioninHealthandDisease,eighthedition,Lea&Febiger,publishers,1986，especiallyVolume1，pages30-32。营养补齐U可还含有其它成分，如其它维生素、矿物、抗氧化剂、纤维和其它膳食补剂(例如蛋白质、氨基酸、胆碱、卵磷脂、脂肪酸)的一种或组合。一种或若干种这些成分的选择是配制、设计、消费者偏好和最终用户的一个问题。添加进本发明的膳食补剂中的这些成分的用量是技术人员容易知道的。对这些用量的指南可以由针对儿童和成人的U.S.RDA提供。可以被添加的其它维生素和矿物包括，但不限于三碱基的磷酸钙或醋酸钙；二碱基的磷酸钾；硫酸镁或氧化镁；盐(氯化钠)；氯化钾或醋酸钾；抗坏血酸；正磷酸铁；烟酰胺；硫酸锌或氧化锌；泛酸钙；葡萄糖酸铜；核黄素；/3-胡萝卜素；盐酸吡哆醇；硫胺单硝酸酯；叶酸；生物素；氯化铬或甲基吡啶酸铬；碘化钾；硒酸钾；钼酸钠；叶绿醌；维生素D3;氰钴铵素；亚硒酸钠；硫酸铜；维生素A;维生素C;维生素E、肌醇；碘化钾。营养补剂可以以多种形式和通过多种生产方法提供。在一个优选的实施方式中，为了制造食物棒，液体成分被烹饪；干燥成分与液体成分被添加进混合机中并混合，直到获得生面团相；将生面团放进挤压机中并挤压；将经挤压的生面团切成合适的长度；使产物冷却。除了本文明确列出14的成分外，棒还可含有其它养分和填充剂以加强口味。本领域技术人员理解其它成分(例如填充剂、乳化剂、防腐剂等)可以被添加进本文所述的这些中，用于加工或制造营养补剂。另外，调味剂、着色剂、香料、坚果等等可以被掺入营养药物组合物中。调味剂可以是有味的提取物、挥发油、巧克力调味剂、花生酱调味剂、曲奇碎屑、松脆米(crisprice)、香草或任何可商业获得的调味剂的形式。有用的调味剂的例子包括，但不限于纯净的茴香提取物、仿造的香蕉提取物、仿造的樱桃提取物、巧克力提取物、纯净的柠檬提取物、纯净的橙提取物、纯净的薄荷提取物、仿造的菠萝提取物、仿造的朗姆提取物、仿造的草莓提取物或纯净的香草提取物；或挥发油，如香蜂叶油(balmoil)、月桂叶油、佛手柑油、柏木油(cedarwoodoi)、胡桃油、樱桃油、桂皮油、丁香油或薄荷油；花生酱、巧克力调味剂、香草曲奇碎屑、奶油糖(butterscotch)或太妃糖(toffee)。在一个实施方式中，膳食补剂含有可可或巧克力。乳化剂可以被添加用于营养药物组合物的稳定性。合适的乳化剂的例子包括，但不限于卵磷脂(例如来自卵或大豆)，和/或甘油单酯和甘油二酯。其它乳化剂对技术人员是显而易见的，对合适的乳化剂的选择将部分取决于配制物和最终产物。也可以向营养补剂中添加防腐剂以延长产物的货架寿命。优选地，使用如山梨酸钾、山梨酸钠、苯甲酸钾、苯甲酸钠、或EDTA躬二钠(calciumdisodiumEDTA)。除了上述碳水化合物外，营养药物组合物可含有天然或人工的(优选低卡路里的)甜味剂，例如糖类、环己垸氨基磺酸盐(cyclamate)、天冬胺(aspartamine)、天冬甜素(aspartame)、安赛蜜K(acesulfameK)和/或山梨糖醇。如果营养补剂旨在被超重或肥胖的个体或患有II型糖尿病的个体(其易于患高血糖症)消耗，则这类人工甜味剂是期望的。另外，可以向本发明的营养药物性组合物中添加多种维生素和矿物补剂，以获得一些膳食中缺乏的足够量的必需养分。多种维生素和矿物补剂也可以适用于疾病预防和防止生活方式引起的营养丧失和缺乏。当然，通过营养药物组合物施用的羟基酪醇的剂量和比例可根据己知的因素改变，所述因素例如具体组合物的生理特征及其使用模式和途径；接收者的年龄、健康和体重；症状的性质和程度；共存的治疗种类；治疗的频率；和想要的作用，所述因素可以由本领域的专家使用常规试验确定，或使用关于营养药物组合物配制的常见考虑决定。食物或饮料适当地每份含有约0.5mg到约1000mg的羟基酪醇。如果组合物是药物组合物，则这类药物组合物可以以从约1mg到约2000mg每剂量单位(例如每胶囊或片剂)，或从约1mg每日剂量到约3000mg每日剂量的液体制剂，的量含有羟基酪醇。根据本发明的药物组合物优选地还包含可药用载体。合适的药物载体例如在本领域的标准参考文献--上文Remington'sPharmaceuticalSciences中有所描述。这类可药用载体的例子为适用于口/肠胃外/可注射施用的无机和有机载体材料，其包括水、明胶、阿拉伯胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物油等等。药物组合物可还含有常规的药物添加剂和佐剂、赋形剂或稀释剂，其包括但不限于水、任何来源的明胶、植物胶、木质素磺酸盐、滑石、糖、淀粉、阿拉伯胶、植物油、聚亚烷基二醇、调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲液、润滑剂、着色剂、湿润剂、填充剂等等。药物组合物中各个组分的剂量和比例可以由本领域技术人员使用常见的临床前和临床试验确定，或使用关于营养药物组合物配制的常见考虑决定。在一个优选的实施方式中，羟基酪醇通过药物组合物以单个剂量或多个剂量的方式被施用，其用量为至少0.3mg/kg体重/天，优选地用量为l-450mg/kg体重/天，最优选地用量为4-140mg/kg体重/天。根据本发明的组合物可以是适用于施用给动物体(包括人体)的任何盖伦形式(galenicform)，更具体地是常规用于口施用的任何形式例如固体形式，例如作为食物或饲料(用的添加剂/补充剂)、食物或饲料预混物、强化的食物或饲料、片剂、丸剂、颗粒剂、锭剂、胶囊和泡腾配制剂(如粉末和片剂)，或液体形式，例如溶液、乳剂或悬浮液的形式，例如作为饮料、糊剂和油悬浮液。糊剂可以被填充进硬或软壳胶囊中，其中胶囊具16有例如(鱼、猪、家禽、牛)明胶、植物蛋白或木质素磺酸盐的基质。其他应用形式的例子是用于经皮、肠胃外、局部或可注射施用的形式。营养药物和药物组合物可以是受控(延迟)释放的配制剂的形式。药物组合物的例子也包括适用于酚类化合物局部应用和经皮吸收的组合物，例如霜剂、凝胶、喷雾、干棒、粉末等形式。在一个优选的实施方式中，根据本发明的组合物是片剂、丸剂、颗粒、锭剂、胶囊或泡腾配制剂的形式。根据本发明的组合物也可含有适用于关节护理的其他活性成分，例如选自抗氧化剂(包括维生素C和E)、硫酸软骨素、水解胶原(水解产物)、姜(根茎)提取物、葡糖胺、甲基磺酰甲烷(methylsulfonylmethane,MSM)、S-腺苷基甲硫氨酸、硒、维生素B9(叶酸)、多不饱和脂肪酸(PUFA)、B12(钴铵)和维生素D3，优选地选自维生素E、PUFA、硫酸软骨素和葡糖胺。在一个具体的实施方式中，本发明还涉及组合物，尤其是营养药物组合物，最尤其是膳食补剂，其包含葡糖胺、硫酸软骨素、PUFA(尤其是EPA和DHA)、羟基酪醇和维生素E。优选地，组合物是片剂或胶囊的形式，最优选地是硬(壳)明胶胶囊的形式。这类组合物优选地在每日剂量的基础上包含800-1200mg葡糖胺，优选1000mg，600-1000mg硫酸软骨素，优选800mg，200-600mgPUFA，尤其是EPA和DHA，优选400mg，5到20mg羟基酪醇，尤其是10mg，和15-50IU维生素E，优选30IU。如上所述优选的主题组合物每日剂量可以以一个或多个剂量单位例如片剂的形式被施用。最优选地，主题组合物的每日剂量以每天两次摄取一个剂量单位、总计每天两个剂量单位的形式提供，或者以每天两次摄取两个剂量单位、总计每天四个剂量单位的形式提供。与每天一次摄取总体每日剂量相比，每天两次、在每次给药的一个或多个剂量单位中给予总每日剂量的一半提供了改进的吸收和主要成分血水平的更好维持。因此，如果每天要消化两个剂量单位，例如主题组合物的优选配制剂的两个片剂，则将每个剂量单位配制为优选地提供不少于约500mg葡糖胺、400mg硫酸软骨素、300mgPUFA(例如可从DSMNutritionalProducts,瑞士获得的ROPUFA㊣'75，n-3EE油)和5mg羟基酪醇(例如以200mgHIDROX6M的形式；最少含2.5%羟基酪醇)。如果每天要消化四个剂量单位，例如主题组合物的优选配制剂的四个片剂，则将每个剂量单位配制为在口施用后优选地提供不少于约250mg葡糖胺、200mg硫酸软骨素、150mgPUFA和2.5mg羟基酪醇。另外，本发明涉及上述组合物用于以下的用途用于维护并支持软骨健康，提供软骨护理，愈合软骨损害和提供软骨完整性，即用于软骨护理，尤其是用于维护和/或促进关节健康，预防关节僵直，提高关节可动性，提供柔软和/或灵活的关节，润滑关节和减少关节问题。根据本发明合适的多不饱合脂肪酸是单不饱和羧酸或多不饱和羧酸，其优选地具有16到24个碳原子，尤其是1到6个双键，尤其优选地具有4或5或6个双键。不饱和脂肪酸可属于n-6系列和n-3系列二者。优选n-3系列的多不饱和脂肪酸。n-3多不饱和酸的优选例子是二十碳-5,8,ll,14,17-五烯酸(EPA)和二十二碳-4,7，10，13，16,19-六烯酸(DHA)，以及花生四烯酸(ARA)。优选的多不饱和脂肪酸衍生物是其酯，例如甘油酯，尤其是甘油三酯；尤其优选乙酯。特别优选n-3多不饱合脂肪酸的甘油三酯。甘油三酯可含有3个一致的不饱和脂肪酸或2或3个不同的不饱和脂肪酸。它们也可以含有饱和的脂肪酸。衍生物是甘油三酯时，通常用甘油酯化三个不同的n-3多不饱和脂肪酸。在本发明的一个优选的实施方式中使用甘油三酯，其中30%的脂肪酸部分是n-3脂肪酸，所述n-3脂肪酸中25%是长链多不饱和脂肪酸。在又一个优选的实施方式中，使用可商业获得的ROPUFA'30，n-3FoodOil(DSMNutritionalProductsLtd,Kaiseraugst，瑞士)。在本发明的另一个优选的实施方式中，PUFA酯是ROPUFA'75'n-3EE。ROPUFA'75'n-3EE是乙酯形式的精制海产油(marineoil)，其具有72%-3脂肪酸乙酯的最小含量。其被混合的生育酚、抗坏血酸棕榈酸酯、柠檬酸稳定，并含有迷迭香提取物。根据本发明，使用含有多不饱合脂肪酸甘油酸酯的天然存在的油例如植物油(的一种或多种组分)。包含多不饱合脂肪酸甘油三酯的优选的油是橄榄油、向日葵籽油、月见草籽油、琉璃苣油、葡萄籽油、大豆油、花生油、小麦胚芽油、南瓜子油、胡桃油、芝麻籽油、菜籽油(芸苔)、黑穗醋栗籽油(blackcurrantseedoil)、猕猴桃籽油、来自特定真菌的油和鱼油。或者可使用其他多不饱和脂肪酸(例如co-3脂肪酸；o;-6脂肪酸)和/或其衍生物。术语维生素E包括生育酚、生育酚衍生物(例如维生素-E-乙酸酯)以及天然维生素E的混合物。本发明的其他目的是以下方法用于在动物(包括人)中治疗或辅助治疗软骨损伤、尤其是外伤性软骨损伤的方法，所述方法包括对有需要的动物(包括人)施用有效量羟基酪醇的步骤。在动物(包括人)中软骨修复或再生的方法，所述方法包括对有需要的动物(包括人)施用有效量羟基酪醇的步骤。用于(a)诱导或增强动物(包括人)关节中软骨修复或软骨再生，(b)增强软骨细胞的增殖，(c)刺激动物(包括人)关节中软骨细胞增殖，(d)提高动物(包括人)关节中细胞外基质的合成，和/或(e)维护并支持软骨健康，提供软骨护理，愈合软骨损害和提供软骨完整性，尤其是维护和/或促进关节健康，预防关节僵直，提高关节可动性，提供柔软和/或灵活的关节，润滑关节和减少关节问题，所述方法包括对有需要的动物(包括人)施用有效量羟基酪醇的步骤。这些方法中有效量的羟基酪醇是指获得生理学效果必需的量。生理学效果可以通过单一剂量或重复剂量达成。施用的剂量当然会根据已知的因素改变，如具体组合物的生理特征及其施用模式和途径；接收者的年龄、健康和体重；症状的性质和程度；共存的治疗种类；治疗的频率；和想要的作用，所述因素可以由本领域技术人员调节。优选地，上述方法中有效量的羟基酪醇使得施用后血浆中羟基酪醇的浓度范围在10和15^M之间。在这些方法的一个优选的实施方式中，羟基酪醇与至少一种选自以下的化合物组合抗氧化剂(包括维生素C和E)、硫酸软骨素、PUFA、水解胶原(水解产物)、姜(根茎)提取物、葡糖胺、甲基磺酰甲垸(methylsulfonylmethane，MSM)、S-腺苷基甲硫氨酸、硒、维生素B9(叶酸)、B12(钴铵)和维生素D3，尤其是选自维生素E、葡糖胺、硫酸软骨素和PUFA。本发明接着通过以下实施例阐述，但不限于此。实施例实施例1软明胶胶囊通过常规工序来制备提供下述剂量的软明胶胶囊，所述剂量为每粒胶囊100mg羟基酪醇。合适的每日剂量为l到5粒胶囊。其它成分甘油、水、明胶、植物油。实施例2硬明胶胶囊通过常规工序来制备提供下述剂量的硬明胶胶囊，所述剂量为每粒胶囊75mg羟基酪醇。合适的每日剂量为l到5粒胶囊。其它成分填料适量的乳糖或纤维素或纤维素衍生物润滑剂如果需要的话，硬脂酸镁(0.5%)实施例3片剂通过常规工序来制备片剂，每片提供100mg羟基酪醇作为活性成分，和微晶纤维素、二氧化硅(Si02)、硬脂酸镁、交羧甲基纤维素钠总计500mg作为赋形剂。20实施例4软饮可如下制备含有酚类化合物的软饮:由以下成分制备软饮<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>混合果汁浓縮物和水溶性香料而不掺入空气。将色素溶于去离子水中。将抗坏血酸和柠檬酸溶于水中。将苯甲酸钠溶于水中。果胶在搅拌下被添加并在煮沸时溶解。冷却溶液。预混合橙油和油溶性香料。将F下提到的活性成分搅拌进A的果汁浓縮物混合物中。为了制备软饮，将所有的组分A-F混合在一起后使用Turmx和随后使用高压匀化器(p！=200bar,p2=50bar)匀化。实施例5在该实施例中，在得自健康人供体(HNAC-kn,Cambrex)的正常人软骨细胞中测量羟基酪醇(25nM)或HIDROX6%(25mg/L)对合成代谢和分解代谢基因表达的影响(见下表)。在用于实验之前将这些原发的软骨细胞体外传代不超过4次。将细胞在不含或含有物质的软骨细胞分化培养基(Cambrex,弁CC-3225)中培养4小时。如Richard"a/.Mol.Nutr.FoodRes.#，W/-^0，2005所述从培养的细胞中提取总RNA并反转录。如RichardWa/.Mol.Nutr.FoodRes.#，^^-^/么2005中所详述的通过定量实时PCR测定不同基因的表达水平。该实验的结果显示于表l中表1.羟基酪醇和HIDROX6%对正常人原发软骨细胞中合成代谢基因表达的影响数字指出基因表达的水平(对照处理的细胞的％)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*含约2/zMOH-酪醇包括聚集蛋白聚糖和胶原II的合成代谢基因表达(即有助于软骨重建)被OH-酪醇和HIDROX6%显著提高。另外，有助于重建ECM的软骨细胞增殖的转录因子的表达和胶原表达被增强。显著并与物质的软骨重建特性一致，软骨降解信号转导途径的拮抗剂(即IL1-Ra)被提高。因此，在通过刺激软骨细胞的增殖来诱导或增强软骨修复或软骨再生，以及提高其对细胞外基质组件的生产从而再生软骨和填补软骨缺损方面，羟基酪醇惊人地有效。实施例6羟基酪醇的制备实施例6.1(3,4-二羟基苯基V乙酸甲酯在50ml反应器中，将2.5g(12.5mmol)3,4-二羟基杏仁酸(纯度89.5%，2.24g有效)溶于25ml的甲醇中的O.lNHC1中。向该溶液中添加250mg位于碳上的钯(Pd/CE101N/D;Degussa)，并施加10bar的氢压强。将混合物在4(TC下搅拌24.5小时。过滤冷却的溶液并用甲醇洗涤固体。添加200mg乙酸钠后蒸发溶剂。残余物为2.5g，通过HPLC分析其为纯度72.9%的(3，4-二羟基苯基)乙酸甲酯，对应于82.7%的产率。实施例6.2纯度>90%的羟基酪醇将6.4g(33.4mmol)(3，4-二羟基苯基)-乙酸甲酯溶于60ml干燥的THF中。在冰浴中冷却时，在搅拌下于20分钟内小份添加1.95g(50.6mmol)氢化铝锂。因为猛烈的发泡，额外添加40mlTHF。然后将充分搅拌的混合物加热回流3小时，通过TLC监测反应进程。冷却至约0'C后小心地添加2NHC1水溶液，在剧烈产生气体和热下反应20分钟。将产物用每次100ml、总计400ml乙酸乙酯萃取4次。将萃取物用50ml饱和的氯化铵溶液洗涤，并在硫酸钠上干燥。在约1mbar下蒸馏溶剂后获得(产率100%)6.4g粗制羟基酪醇(纯度81%)。在200-225。C和1.8mbar下蒸馏得到纯度为93.8%的5.3g羟基酪醇(产率96.7%)。实施例7一个39岁的前业余足球运动员不经训练再次开始踢球。在业余比赛中，在防守队员周围运球时他被另一运动员推搡并扭伤膝部。他经历了膝肿胀和疼痛。医学检查和x-光揭示了严重的外伤性半月板撕裂和对膝部其他部分的损伤。磁共振成像证实了该诊断并且还显示关节软骨损伤。手术修复和标准疗法后，他每天摄取200mg羟基酪醇来支持受损软骨的修复和愈合。实施例8一个35岁的休闲滑雪者在一跳后摔倒并扭伤腿。当晚膝部肿胀并且疼痛。医师检查了膝部并且通过x-光和磁共振成像排除了与所述伤害无关的其他可能的膝伤原因。磁共振成像还揭示了软骨损害。用标准疗法(休息、冰、压迫和抬高)治疗膝伤。另外，他每天摄取100mg羟基酪醇来支持软骨修复和痊愈的高速率。2权利要求1.羟基酪醇用于诱导或增强软骨修复或软骨再生的用途。2.羟基酪醇用于诱导或增强软骨细胞增殖的用途。3.羟基酪醇用于刺激软骨细胞增殖的用途。4.羟基酪醇用于提高细胞外基质合成的用途。5.羟基酪醇用于维护和支持软骨健康，提供软骨护理，愈合软骨损害和提供软骨完整性的用途。6.根据权利要求1到5中任一项的羟基酪醇的用途，用于维护和/或促进关节健康，预防关节僵直，提高关节可动性，提供柔软和/或灵活的关节，润滑关节和减少关节问题。7.羟基酪醇作为有效的微量营养物用于软骨维护、软骨修复和/或软骨再生的用途。8.羟基酪醇用于治疗或辅助治疗关节中软骨损伤、尤其是外伤性软骨损伤、特别是用于治疗或辅助治疗具有活跃生活方式的人群、运动人群和肥胖受试者中的关节中软骨损伤的用途。9.羟基酪醇用于制造组合物的用途，所述组合物用于(a)诱导或增强软骨修复或软骨再生，(b)增强软骨细胞的增殖，(c)刺激软骨细胞增殖，(d)提高细胞外基质的合成，(e)维护并支持软骨健康，提供软骨护理，愈合软骨损害和提供软骨完整性，尤其是用于维护和/或促进关节健康，预防关节僵直，提高关节可动性，提供柔软和/或灵活的关节，润滑关节和减少关节问题的用途。10.羟基酪醇用于制造用于治疗或辅助治疗关节中软骨损伤的组合物的用途。11.根据权利要求10的用途，其中所述软骨损伤是外伤性软骨损伤。12.根据权利要求9到11中任一项的用途，其中所述组合物是营养药物组合物。13.根据权利要求9-12中任一项的用途，其中所述组合物是饮料、汤、乳制品、营养棒或涂抹物，尤其是饮料或营养棒。14.根据权利要求9-12中任一项的用途，其中所述组合物是片剂、丸剂、颗粒剂、锭剂、胶囊或泡腾配制剂的形式。15.用于治疗或辅助治疗包括人在内的动物中的软骨损伤、尤其是外伤性软骨损伤的方法，所述方法包括对有需要的包括人在内的动物施用有效量羟基酪醇的步骤。16.包括人在内的动物中的软骨修复或再生的方法，所述方法包括对有需要的包括人在内的动物施用有效量羟基酪醇的步骤。17.用于(a)诱导或增强动物关节中软骨修复或软骨再生，(b)增强软骨细胞的增殖，(c)刺激软骨细胞增殖，(d)提高关节中细胞外基质的合成，和/或(e)维护并支持软骨健康，提供软骨护理，愈合软骨损害和提供软骨完整性的方法，尤其是用于维护和/或促进关节健康，预防关节僵直，提高关节可动性，提供柔软和/或灵活的关节，润滑关节和减少关节问题的方法，所述方法包括对有需要的动物施用有效量羟基酪醇的步骤，所述动物包括人。18.—种组合物，所述组合物在每日剂量的基础上包含约800-1200mg葡糖胺，优选1000mg，约600-1000mg硫酸软骨素，优选800mg，约200-600mgPUFA，尤其是EPA和DHA，优选400mg，约5到20mg羟基酪醇，优选10mg，禾口15-50IU维生素E，优选30IU。19.根据权利要求18的组合物用于以下的用途维护并支持软骨健康，提供软骨护理，愈合软骨损害和提供软骨完整性，尤其是维护和/或促进关节健康，预防关节僵直，提高关节可动性，提供柔软和/或灵活的关节，润滑关节和减少关节问题。全文摘要本发明涉及羟基酪醇用于诱导或增强软骨修复或软骨再生的用途。另外，本发明涉及用包含羟基酪醇的营养药物或药物组合物，其用于关节中软骨损伤、尤其是外伤性软骨损伤的再生和修复。文档编号A61K31/05GK101674817SQ200880012682公开日2010年3月17日申请日期2008年4月3日优先权日2007年4月18日发明者丹尼尔·雷德尔斯多夫,卡林·威兹,约瑟夫·斯楚瓦格尔申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司