羟基酪醇用于改进线粒体功能的用途的制作方法

专利名称：羟基酪醇用于改进线粒体功能的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及羟基酪醇和包含羟基酪醇的组合物 改进线粒体功能、尤其是作为抗衰老剂的用途。本发明还涉及抗衰老方法。“抗衰老”在本发明的上下文中表示延迟动物中衰老的过程，改善动物中年龄相关的生理缺陷，和/或促进动物中健康的衰老。
背景技术：
线粒体是细胞中负责能量产生的细胞器。线粒体内膜中埋有包含复合体I、II、III、IV和V的呼吸链，所述呼吸链通过一系列氧化还原反应传递电子并产生ATP，这是被称作氧化磷酸化的过程。除了对细胞提供能量的公知功能以外,线粒体及其组件参与大量其他细胞活动。例如，线粒体还控制产热和凋亡过程，并因此涉及衰老过程。线粒体含有高水平的氧化剂，因为呼吸链以降低的效率工作时或者在能量解偶联期间产生活性物质，例如超氧阴离子。超氧阴离子作为电子传递链若干步骤中的副产物产生，所述步骤例如复合体III中辅酶Q的还原，其中形成作为中间体的高度活性的自由基(Q ·_)。该不稳定的中间体会导致电子“泄漏”，其中电子直接跳跃至氧并形成超氧阴离子，而不是沿着正常的电子传递链的一系列受到良好控制的反应移动。抗氧化剂是能够减缓或阻止其他分子氧化的分子。抗氧化剂通过去除自由基中间体来终止氧化链反应，并且通过氧化其自身抑制其他氧化反应。还原剂例如硫醇或多酚通常具有抗氧化特性。公知的抗氧化剂例如维生素A、C和E清除自由基并保护DNA、蛋白质和脂质免受损伤。抗氧化剂还保护线粒体远离ATP生产期间产生的活性氧物质和自由基。尽管过去普遍接受施用抗氧化剂对于促进线粒体生物发生(biogenesis)是有益的，但是情况显不并非如此。Gomez-Carbera et al. 2008 Am. J Clin. Nutr. 87 (I) 142-149在双盲的随机化临床研究中证明，每天口服施用Ig维生素C降低骨骼肌中线粒体的生物发生。过去轻基酪醇被描述为具有积极的心血管作用(见例如Gonzalez-Santiagoet al 2006 Atherosclerosis 188 :35-42 ；或 Mitro et al 2003 NMCD. NutritionalMetabolism and Cardiovascular Diseases 13(5) :306),但是这些涉及轻基酪醇的抗动脉粥样硬化作用和/或其作为抗氧化剂的状态。本发明涉及羟基酪醇的抗衰老特性，这与其作为抗氧化剂起作用的能力不同。发明详述本发明涉及包含羟基酪醇的组合物作为抗衰老剂的用途，其中所述组合物基本不含白藜芦醇且其中所述组合物被经口施用给动物。衰老的特征是生理功能的逐渐损失，这可能是由多种细胞组件中积累的损伤引起的。线粒体是通过转化三磷酸腺苷(ATP)分子中的营养物而在细胞中产生能量的普遍存在的细胞器，所述能量被用于正常的细胞功能和维持。线粒体还涉及调节细胞存活。最近有人提出，线粒体功能的损失不仅促成疾病，而且在衰老过程中起重要作用。某些器官中线粒体数量的降低和线粒体呼吸链的损伤常常伴随着衰老过程，并且被认为是衰老的一个主要原因。年龄在65-75岁的健康受试者显示改变的线粒体特性的征兆，其特征是氧化酶活性和组织线粒体含量的损失。另外，得自衰老动物的组织显示线粒体结构的改变，伴随着降低的能量产生。衰老的人和动物器官在组织中具有提高的线粒体DNA (mtDNA)突变水平，并且mtDNA损伤与最大生命期成反比。无营养不良的热量限制(这是提高生命期的公认的最好方法)还增加编码下述蛋白质的基因并减少指示细胞衰老的DNA损伤，所述蛋白质涉及人骨骼肌中的线粒体功能。因此，衰老伴随着降低的线粒体生物发生和线粒体损伤的累积。“线粒体生物发生”是指线粒体生长、扩增和健康维持的过程。线粒体生物发生是涉及核参与者和线粒体参与者二者的复杂过程。线粒体DNA编码小量蛋白质,所述蛋白质在线粒体核糖体上被翻译。这些蛋白质中的大部分是位于线粒体内膜上的呼吸链的高度疏水的亚基。核编码的蛋白质在胞质核糖体上被翻译，并被输入线粒体中。这些蛋白质包括结构蛋白质，酶或酶亚基，输入机制、复制机制、转录机制和翻译机制的组件，和陪伴分子。
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过氧化物酶体增殖子活化的受体-Y共同活化子-I (PGC-I)是细胞能量代谢的共同转录调节因子，其涉及线粒体功能的控制并诱导线粒体生物发生。衰老组织中PGC-I的减少是线粒体功能障碍的一个关键因素，所述线粒体功能障碍可以通过PGCl的增加来预防，所述PGCl的增加导致提高的线粒体生物发生。羟基酪醇通过线粒体呼吸链复合物的活化和线粒体生物发生的提高改进线粒体功能。由此，线粒体功能的改进能够预防细胞衰老，并因此预防身体的衰老。因此，羟基酪醇可以被认为是预防衰老和年龄相关疾病的一种有用的药剂。附图
简述图I显示PGC-I α的表达。A)PGC_1 α脂肪细胞中的Western印迹分析。B)用光密度法针对PGC-Ia :α-微管蛋白比例计算的定量值。数值为五个试验的均值土SE。*与对照相比P < O. 05 ;林与对照相比P < 0.01ο图2显示线粒体蛋白质的表达。用羟基酪醇将3T3-L1脂肪细胞处理48小时。随后将细胞溶于SDS样品缓冲液中，并通过Western印迹用针对α -微管蛋白、线粒体电子传递复合物I、复合物II、复合物III和复合物V的抗体进行分析。稳态水平蛋白质的代表性免疫印迹在顶部(A)显示。通过光密度法对条带的定量分析在B、C、D和E中分别针对线粒体复合物I、复合物II、复合物III和复合物V显示。所示结果是来自4个独立实验的对照与对照细胞相比的提高倍数。*与对照相比P < O. 05。**与对照相比P <0.01。图3显示线粒体DNA的表达。用羟基酪醇将3T3-L1脂肪细胞处理48小时。使用SYBR绿，用荧光对PCR产物定量。针对D-环18sRNA比例计算定量值。结果被表述为对照的提高倍数。数据是均值土 SE (η = 5)。*与对照相比P < O. 05 ;林与对照相比ρ < O. 01。图4显示3T3-L1脂肪细胞中的氧消耗。将等体积的细胞在96-孔BDOxygenBiosensor平板的孔中分成等分试样。覆盖平板，用荧光微板分光光度计随时间记录每孔中的荧光。A)代表性氧消耗曲线。B)通过测定动力学测量结果计算每种条件下脂肪细胞呼吸速率的定量改变。数值为均值土SE ;显示的结果是来自3个独立实验的对照与对照细胞相比。*与对照相比P <0.05。
图5显示用羟基酪醇处理对脂肪细胞中复合物活性的影响。(A)复合物I，(B)复合物II，和(C)复合物III。用不同浓度的羟基酪醇将脂肪细胞处理48小时。数值对于复合物I而言是来自三个独立实验的数据的均值土SE，对复合物II和III而言是来自六个独立实验的数据的均值土SE，并且每个实验一式两份进行。*与对照相比ρ < O. 05，**与对照相比P <0.01。PGCl α，过氧化物酶体活化子受体(PPAR) Y -共同活化子I α，是一种转录共同活化子，其作为大范围代谢和生理学过程的主要调节子发挥作用，并且是线粒体生物发生过程中的关键因素。PGC-I α过表达刺激3Τ3细胞中线粒体的生物发生，如提高的线粒体量和活性所示。优选地，羟基酪醇是组合物中唯一的活性抗衰老成分。由此，根据本发明的组合物和羟基酪醇自身使人年轻和/或健康，带来了抗衰老的解决方案，并且预防衰老过程和/或使人在衰老时快乐或更满足。
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本发明的另一方面是包含羟基酪醇的组合物用于制造下述组合物的用途，所述组合物用于降低动物中给定年龄处年龄相关疾病的发病率，进而提高生存更久的可能性；用于推迟动物中衰老过程的视觉征兆，例如但不限于头发泛灰、皱纹、听觉功能损失、肌肉量损失、骨密度损失和固有心脏功能的损失；和/或用于降低动物中加速衰老过程的生活方式疾病的风险；其中所述组合物基本不含白藜芦醇。本发明的一个目的是包含羟基酪醇的组合物作为抗衰老剂的用途，其中所述组合物基本不含白藜芦醇且其中所述组合物经口施用给动物。羟基酪醇(3，4_ 二羟基苯乙醇)可以是合成来源或其可以从橄榄叶、橄榄果实的提取物和橄榄油生产的植被水(vegetation water)中被分离。因此，术语“羟基酪醇”还包括含有羟基酪醇的植物的任何材料或提取物或植物部分的任何材料或提取物或植物(例如橄榄)果实的任何提取物/浓缩物/果汁，特别是以植物材料或提取物的总重为基础，以至少30重量％的量，优选地以至少40重量％的量，更优选地以至少50、55、60、65、70、75、80、85、90重量％的量，最优选地以至少50重量％的量含有羟基酪醇。本发明上下文中使用的术语“植物材料”表示植物的任何部分，还表示果实。在本发明的其他实施方案中，除了羟基酪醇外还可以使用羟基酪醇衍生物例如酯和生理学/药学可接受的盐，或者使用它们代替羟基酪醇。合适的衍生物是本领域技术人员已知的。优选的羟基酪醇酯为例如乙酸酯或葡糖苷酸缀合物；最优选的是橄榄苦苷。“基本不含白藜芦醇”是指组合物中白藜芦醇的量以组合物的总重为基础< I重量％，优选地< O. 5重量％,更优选地< O. I重量％。其还表示不有意地向组合物中添加白藜芦醇。白藜芦醇仅可作为从植物或植物果实(例如橄榄)中获得的羟基酪醇提取物/浓缩物的副产物存在于组合物中。如果存在，则其处于生物活性不显著的浓度下。“组合物被经口施用给动物”，这表示组合物是可以被动物食用或饮用或通过口 /颌(jaw)放入动物胃中的任何形式。因此，组合物优选地选自饮食补剂、食物添加剂、功能性食物、饲料添加剂、功能性饲料、食物预混物、饲料预混物和饮料。饮食补剂形式的例子是片剂、丸剂、颗粒剂、锭剂、胶囊、即食饮品和泡腾配制物。食物/饲料添加剂的例子是为用于消耗在食物/饲料的制造期间或其制备期间添加进食物/饲料中的任何组合物/配制物。功能性食物的例子是乳制品(酸乳)、谷物棒和烘焙物品例如蛋糕、曲奇和面包。也包括临床营养品。功能性饲料(包括宠物食品组合物)的例子包括旨在提供必需饮食需求的饲料，以及所有的零食(例如狗饼干)或其他饲料补剂。包含根据本发明的组合物的动物饲料可以是干燥组合物(例如粗粉(kibble))、半湿润组合物、湿润组合物或其任何组合的形式。替代地或额外地，动物饲料是补剂例如肉汁(gravy)、饮用水、酸乳、粉末、悬浮液、咀嚼物、调剂物(例如饼干)或任何其他递送形式。食物预混物的例子是用于制造乳制品、谷物棒和烘焙物(例如蛋糕和曲奇)和汤的预混物。 本发明的另一方面涉及饲料添加剂或添加剂组合物，例如要被添加进一种或多种可食用饲料物质或成分中，例如用于制备饲料组合物或用于补充现存的饲料以形成饲料组合物。所谓的预混物是本发明的动物饲料添加剂的例子。预混物表示一种或多种微量成分(micro-ingredient)与稀释剂和/或载体的优选地均一的混合物。预混物被用于促进微量成分在更大混合物中的均一分散。预混物可以是颗粒或团粒的形式。在一个具体的实施方案中，羟基酪醇在被添加进饲料中的形式下或被包含在饲料添加剂中时，是充分确定的。术语“充分确定的”表示羟基酪醇制剂至少为40%纯净。在另一具体的实施方案中，充分确定的羟基酪醇制剂为至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、88%、90%、92%、94%或至少 95%纯净。通常，脂溶性和水溶性维生素，以及痕量矿物质形成用于添加进饲料中的所谓预混物的部分，而主要矿物质则通常被独立地添加进饲料中。另外，任选的饲料添加剂成分是着色剂，例如类胡萝卜素如β_胡萝卜素、虾青素和叶黄素；芳香化合物；稳定剂；抗微生物肽；产活性氧的物类；和/或至少一种选自以下的酶植酸酶(EC 3. I. 3. 8或3. I. 3. 26);木聚糖酶(EC 3. 2. I. 8);半乳聚糖酶(EC3. 2. I. 89) ； α -半乳糖苷酶(EC 3. 2. I. 22);蛋白酶(EC 3. 4.)、磷脂酶 Al (EC 3. I. I. 32)；磷脂酶 A2(EC 3. I. 1.4);溶血磷脂酶(EC 3. I. 1.5);磷脂酶 C (EC 3. I. 4. 3);磷脂酶 D (EC3. I. 4. 4);淀粉酶，例如α -淀粉酶(EC 3. 2. I. I);和/或β -葡聚糖酶(EC 3. 2. I. 4或EC3. 2. I. 6)。饮料包括无醇饮品和含酒精的饮品，以及要添加进饮用水和液体食品中的液体制齐U。无醇饮品为例如方便饮品、软饮、运动饮品或一般性运动饮料、果汁(如例如橙汁、苹果汁和葡萄汁)；蔬菜汁(如番茄汁)；思慕雪、柠檬水、功能性水、接近水的饮品(即具有低卡路里含量的基于水的饮品)、茶和基于乳的饮品。含酒精的饮品特别是啤酒。液体食品为例如汤和乳制品(例如麦芯饮品)。根据本发明的饮食组合物可还含有保护性水胶体、粘合剂、成膜剂、包封剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、包衣、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等等)、吸附剂、载体、填充剂、辅助化合物、分散剂、湿润剂、加工助剂(溶剂)、流动剂、遮味齐[|、增重剂、啫喱化剂(jellyfying agents)、凝胶形成剂、抗氧化剂和抗微生物剂。也可以替代饮食补剂使用并被本发明涵盖的是药物组合物。
除了可药用的载体和具有上文给出的优选的纯度(和其他优选级)的羟基酪醇(衍生物)以外，根据本发明的药物组合物可还含有常规的药物添加剂和佐剂、赋形剂或稀释剂，包括但不限于水、任何来源的明胶、植物胶、硫酸木质素、滑石、糖、淀粉、阿拉伯胶、植物油、聚亚烷基二醇、调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、润滑剂、着色剂、湿润剂、填充剂等等。载体材料可以是适用于口施用的有机或无机惰性载体。根据本发明的饮食补剂和药物组合物可以是适用于对动物体(优选地对人体)口施用的任何盖仑形式(galenic form),例如固体形式如片剂、丸剂、颗粒剂、锭剂、胶囊和泡腾配制物如粉末和片剂，或液体形式如溶液、乳液或悬浮液，如例如饮料、糊剂和油悬浮液。糊剂可以被填充进硬壳或软壳胶囊中。饮食和药物组合物可以是受控(延迟)释放配制物的形式。根据本发明，这类组合物被用于延迟动物(优选人)中的衰老过程，用于改善动物(优选人)中年龄相关的生理缺陷，和/或用于促进动物(优选人)中的健康衰老。因此，本发明还涉及(具有上文给出的形式和优选级的)被经口施用给动物(优·选人)的包含羟基酪醇组合物，所述组合物用于延迟动物(优选人)中的衰老过程，用于改善动物(优选人)中年龄相关的生理缺陷，和/或用于促进动物(优选人)中的健康衰老，其中所述组合物基本不包含白藜芦醇。另外，本发明涉及通过对动物施用有效量羟基酪醇或有效量包含羟基酪醇的组合物而延迟动物中的衰老过程，改善动物中年龄相关的生理缺陷，和/或促进动物中健康衰老的方法，其中所述组合物基本不含白藜芦醇。动物在本发明的上下文中包括人并包括哺乳动物、鱼和鸟。优选的“动物”是人、宠物动物和农业动物。特别优选的动物是人。宠物动物的例子是狗、猫、鸟、观赏鱼(aquarium fish)、荷兰猪、(jack)兔子、野兔和雪貂。农业动物的例子是观赏鱼、猪、马、反刍动物(牛、绵羊和山羊)和家禽。“延迟动物中的衰老过程”在本发明的上下文中表示以下任何一种降低动物中给定年龄处年龄相关疾病的发病率，进而提高生存更久的可能性；推迟动物中衰老过程的视觉征兆，例如但不限于头发泛灰、皱纹、听觉功能损失、肌肉量损失、骨密度损失和固有心脏功能的损失；和/或降低动物中加速衰老过程的生活方式疾病的风险。“改善动物中年龄相关的生理缺陷”在本发明的上下文中表示降低(在给定年龄下)发生年龄相关疾病的(平均)风险。“促进动物中健康的衰老”在本发明的上下文中表示提高健康的生命预期，即提高保持健康更久的概率。这类效果最好在介入试验中研究，将经处理的个体与未经处理的对照组中平均衰老状态/疾病发病率进行比较。用于人(70kg人)的轻基酪醇每日剂量可以为至少O. lmg。其可从5到500mg变化，优选地从10到IOOmg变化。对哺乳动物而言，羟基酪醇的优选的剂量从O. 28到I. 9mg/kg代谢体重变化，其中对哺乳动物而言“代谢体重”[以kg计]=(体重[以kg计])°_75
这表示例如对70kg的人而言，优选的每日剂量应在6. 77和45. 98mg之间变化，对20kg的狗而言，优选的每日剂量应在2. 23和15. Img之间变化。本发明接着通过以下的非限制性实施例进一步阐述。
实施例实施例I软明胶胶囊通过常规工序来制备提供下述剂量的软明胶胶囊，所述剂 量为每粒胶囊50mg羟基酪醇。合适的每日剂量为I到5粒胶囊。其它成分甘油。水、明胶、植物油实施例2硬明胶胶囊通过常规工序来制备提供下述剂量的硬明胶胶囊，所述剂量为每粒胶囊75mg羟基酪醇。合适的每日剂量为I到5粒胶囊。其它成分填料适量的乳糖或纤维素或纤维素衍生物润滑剂如果需要的话，硬脂酸镁(O. 5% )实施例3丑迦通过常规工序来制备片剂，每片提供IOOmg羟基酪醇作为活性成分，和微晶纤维素、二氧化硅(SiO2)、硬脂酸镁、交羧甲基纤维素钠总计500mg作为赋形剂。实施例4软饮可如下制备含有羟基酪醇的软饮
权利要求
1.羟基酪醇用于制造改进线粒体功能的组合物的用途，其中所述组合物基本不含白藜芦醇,并且其中所述组合物经口施用给动物。
2.根据权利要求I所述的用途，其特征是所述线粒体功能改进通过线粒体呼吸链复合物的活化和线粒体生物发生的提高来获得。
3.根据权利要求I到2中任一项的用途，其特征是羟基酪醇是所述组合物中唯一的活性抗衰老成分。
4.根据权利要求I到3中任一项的用途，其中所述组合物选自膳食补剂、食物添加剂、功能性食物、食物预混物、饲料添加剂、功能性饲料、饲料预混物和饮料。
5.根据权利要求1-4中任一项的用途，其特征是所述动物是人。
6.根据权利要求1-5中任一项的用途，其特征是所述改进导致推迟动物中的衰老过程。
7.根据权利要求1-6中任一项的用途，其特征是所述改进导致推迟衰老过程的视觉征兆。
8.根据权利要求1-7中任一项的用途，其特征是所述改进导致预防细胞衰老。
9.根据权利要求1-8中任一项的用途，其特征是所述改进导致预防身体衰老。
全文摘要
本发明涉及羟基酪醇用于改进线粒体功能的用途。特别地，本发明涉及羟基酪醇(或包含羟基酪醇的组合物)作为抗衰老剂的用途。本发明还另外涉及的组合物基本上不包含白藜芦醇，并且经口施用给动物。本发明还涉及抗衰老方法。“抗衰老”在本发明的上下文中表示延迟所述动物中衰老的过程，改善所述动物中年龄相关的生理缺陷，和/或促进所述动物中健康的衰老。
文档编号A61K31/05GK102784130SQ20121020346
公开日2012年11月21日 申请日期2008年4月17日 优先权日2007年4月18日
发明者丹尼尔·雷德尔斯多夫, 卡林·威兹, 迎·王-史密特 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司