专利名称：钓樟酮在制备治疗肝炎药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及钓樟酮的一种新医药用途，尤其涉及钓樟酮在制备治疗肝炎药物中的用途，本发明属于钓樟酮的医药用途领域。
背景技术：
肝脏是人体最重要的器官之一，其负责许多重要的生理机能，如药物代谢、胺基酸代谢、脂质代谢和糖解作用。虽然急性和慢性肝脏疾病普遍地受到重视，目前针对肝脏疾病的治疗方法仍有待进一步的掌握以提高效果。以酒精性肝脏疾病(alcoholic liver disease, ALD)为例，已有充分的研究指出血基质氧化酵素(heme oxygenase)、肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor, TNF)禾口活性氧化物(reactive oxygen species, R0S)的表现与酒精性肝脏疾病有着密切的关系，但目前仍缺乏有效针对酒精性肝脏疾病的治疗方法。由于近年来对于化学合成类药物引发患者副作用的风险越来越被重视， 使得以天然化合物为基础的替代药物高度引起学术界以及医疗界的兴趣。钓樟酮 (Iucidone)是一种从樟科植物(Lauraceae)的果实中分离取得的天然环戊二酮化合物 (cyclopentenedione)，一般认为钓樟酮具有高度抗氧化的潜力，然而，尚未有研究证据指出钓樟酮于治疗酒精性肝脏疾病的效果。
发明内容
本发明主要目的是提供钓樟酮用于治疗肝炎(尤其是酒精性肝炎)的新医药用途。本发明另一目的是提供一种治疗肝炎的医药组合物，其以天然化合物作为活性成份，而得以降低药物副作用的风险。为达上述目的，本发明提供一种治疗肝炎的医药组合物，其系包含有效量的钓樟酮，其系作为活性成份；及医药可接受的载体。较佳地，前述肝炎是指酒精性肝炎。较佳地，前述医药组合物包含1 2wt%的钓樟酮，以及98 99wt%的医药可接受的载体。较佳地，前述载体选自淀粉、乳糖、蔗糖、微晶纤维素或羧甲基纤维素。较佳地，前述医药组合物进一步包含医药可接受的添加剂，前述添加剂系为按氨基酸、维生素或矿物质。较佳地，前述医药组合物可按常规的制剂方法制备成临床可接受的适宜制剂，例如，可以为锭剂、胶囊、皮肤贴剂、悬浮剂、粉末、鼻吸剂、喷剂或注射剂。本发明又提供一种降低酒精引发的氧化压力的方法，其包含使样本与前述医药组合物接触。较佳地，前述样本系指哺乳动物。较佳地，前述哺乳动物系指人类。
综上所述，本发明关于一种以钓樟酮作为活性成份的医药组合物，该医药组合物具有治疗肝炎的效果，更明确地，具有治疗酒精性肝炎的效果。并且，由于钓樟酮是一种天然的化合物，因此可大幅降低药物副作用的风险。目前研究已知酒精会引发肝脏发炎，其中伴随着体内多种不同的氧化压力增加和发炎反应发生的现象，如麸胺硫(glutathione)含量降低、脂质过氧化(lipid peroxidation)现象增加、血浆中肿瘤坏死因子-α (TNF-α )、一氧化氮、活性氧化物 (reactive oxygen species)和前列腺素 E2(prostaglandin_E2)的含量增加。此外，细胞中血基质氧化酵素(hemeoxygenase)的表现量和转录因子Nrf_2 (transcription factor NF-E2 relatedfactor-2)的活化也被视为氧化压力增加的观察标的，而天门冬酸转胺酶 (aspartate aminotransferase, AST)禾口丙胺酸转胺酶(Alanineaminotransferase, ALT) 是两种存在于肝脏细胞的酵素，通常只有在肝细胞受损而破裂时，才会被释放到血清中，因此，血清中AST和ALT的含量增加，被视为肝功能异常(肝脏发炎)的重要指标。本发明所述的「治疗」是指对一具有肝炎对象以本发明之医药组合物处理；更明确地，是指对一具有酒精性肝炎的对象，对一具有肝炎的个体以本发明医药组合物处理，目的在于治愈、减缓、减轻、治疗、预防、改善疾病症状；更明确地，本发明所述「治疗肝炎」系以降低该个体血清中AST和ALT含量，或避免该个体血清中AST和ALT含量提高为指标。本发明所述「活性成份」，系指本发明医药组合物中实际产生前述治疗效果的成份。本发明所述「有效量」系指单独或并用其它药物的本发明医药组合物可提供前述治疗之量。本发明所述「药学上可接受的载体」可选用所属领域所习知且不影响本发明医药组合物的活性成份的效果的载体，例如，包括但不限于淀粉、乳糖、蔗糖、微晶纤维素或羧甲基纤维素。本发明医药组合物可进一步添加医药可接受的添加剂，以额外补充使用本发明的个体的营养，包括但不限于氨基酸、维生素或矿物质；其中维生素包括，但不限于维生素B群、维生素C、维生素E或其组合。本发明放入医药组合物可为锭剂、胶囊、皮肤贴剂、 悬浮剂、粉末、鼻吸剂、喷剂或注射剂，而不须加以限制。本发明医药组合物原则上可以任何习知方式投药，较佳放入投药途径为口服投药。本发明医药组合物的剂量取决于待处理放入患者的年龄、健康状况、疗程及/或症状程度而定。
图1显示钓樟酮于HepG2细胞模式之细胞毒性测试结果。图2显示酒精于!fepG2细胞模式之细胞毒性测试结果。图3显示H印G2细胞模式中AST的含量。图4显示H印G2细胞模式中ALT的含量。图5显示H印G2细胞模式中TNF-α的含量。图6显示!fepG2细胞模式中活性氧化物的含量。图7显示!fepG2细胞模式中一氧化氮的含量。图8显示H印G2细胞模式中GSH的含量。图9显示!fepG2细胞模式中脂质过氧化的程度。图10显示H印G2细胞模式中H0_1的蛋白质表现量。图11显示H印G2细胞模式中H0-1的mRNA表现量。
图12显示H印G2细胞模式中Nrf_2位置移转的程度。图13显示!fepG2细胞模式中Nrf_2与ARE之结合活性。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实验材料与方法[化学试剂与抗体]本发明所使用的钓樟酮是以习知方法纯化，其纯度经高效能液态层析法 (high-performance liquid chromatography, HPLC)及核磁共振(1H-NMR)确认达 99% 以上。酒精、姜黄素(curcumin，纯度99% )和格利斯试剂(Griessreagent)是自美商 Sigma-Aldrich(St. Louis,Mo,USA)购买。小鼠抗H0-1单株抗体和兔子抗Nrf_2多株抗体系自美商Abeam (Cambridge，MA, USA)购买。小鼠抗肌动蛋白(actin)单株抗体是自美商 Sigma-Aldrich(St. Louis, Mo, USA)购买。人类 HepG2 肝癌细胞株(human hepatocarcinoma cells,美商 AmericanType Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)购买)系常态培养于 MEM (minimum essential medium)培养液，并添加10%胎牛血清(FBS)、4. 5g/L的葡萄糖、4mM麸酰胺 (glutamine)、盘尼西林(penicillin, 100units/mL)禾口链霉素(streptomycin, 100 μ g/mL) 以补充营养及所需抗生素，并放置于37°C、5% CO2的环境中培养。依据实验设计，经常态培养的H印G2细胞会进一步与不同浓度之钓樟酮(1、5或10 μ g/mL)和姜黄素(10 μ g/mL)共同培养，并视实验设计加入IOOmM的酒精培养12至M小时。[实验小鼠]实验小鼠的选用系于Charles River (台北，台湾)购买四周大的雄性ICR品系老鼠(25士5公克)，在进行实验之前，为了让实验小鼠适应环境，使其于饲料和水无限量供应的恒常实验室条件下饲养至少一个星期的时间。全部动物实验处理依照实验动物饲养管理 (Guide for the Care and Useof Laboratory Animals)及台湾相关动物保护法令，并经当地道德委员会核可。依据下列几种方式将80%的酒精或钓樟酮施予前述实验小鼠(ImL/ Kg)经口施予酒精、经腹腔注射(intra-peritoneal injection)施予酒精、经口施予酒精及钓樟酮、经腹腔注射(intra-peritoneal injection)施予酒精及钓樟酮。[MTT 试验]本试验使用的 MTT (3-[4，5-dimethyl-thiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromide)系自美商Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo, USA)购买。MTT试验是一种生物学上常用以测定细胞存活率或细胞增殖的方法，其原理系依赖活细胞内粒线体中的琥珀酸去氢酶之作用将MTT之tetrazolium代谢为蓝紫色的产物，进一步加入二甲基亚砜(DMSO)将堆积于细胞中的蓝紫色代谢产物溶出后，便可以光谱仪测定蓝紫色代谢产物的量，而间接推算活细胞的数目。MTT试验的步骤系参照所属领域习知的实验步骤，简单的说，依据实验设计将前述HepG2细胞培养M小时后，将培养液移除。接着将混合有MTT的新鲜MEM培养液(10 μ 1的MTT (10 μ g/mL)混合90 μ 1的新鲜MEM培养液)加入培养盘中，再于37°C中培养前述 H印G2 细胞 1 个小时。最后，以光谱仪(ELISA microplate reader, μ Quant,Bio-Tek instruments, Inc.，Winooski, VT, USA)于波长570nm测定蓝紫色代谢产物的量，便得以间接估算细胞的存活率。
[检测ALT和AST的浓度]使用市售的检验套组(Randox Laboratories, Antrim, UK)以测试经H印G2细胞培养后的培养液以及小鼠实验之小鼠血清中ALT和AST的浓度。简单地说，取得依据实验设计培养HepG2细胞后的培养液及实验小鼠之血清，以前述检验套组及其建议的实验步骤处 ，然后以光i普仪(ELISA microplate reader, μ Quant, Bio-Tek instruments, Inc., Winooski, VT, USA)于波长340nm判读吸光值，即可估算ALT和AST的浓度，及结果以酵素活性单位(U/L)表现。[检测脂质过氧化的程度]使用市售脂质过氧化检验套组(OxfordBiomedical Research, Oxford, MI, USA) 来定量细胞内脂质氧化损害的程度。简单地说，使用200 μ 1的细胞裂解液(lysis buffer) 将细胞溶解(Iysed)。将每140μ 1的细胞溶解液(celllysate)与455 μ 1的溶于乙腈 (acetonitrile)的 N-甲基-2-苯基吲哚(N-methyl-2-phenylindole)和 105 μ 1 的盐酸 (HCL,37% )混合，并放置于45°C中60分钟。丙二醛(malondialdehyde,MDA)是聚不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid)经过氧化反应而裂解的主要产物，在本实验中，使用与丙二醛反应生成稳定发色团(chromophore)的N-甲基-2-苯基吲哚，并于最大吸光波长535nm下测量丙二醛的形成，以作为测定脂质过氧化的指标。同上述方法，测定实验小鼠血清中脂质过氧化的程度。[检测麸胺硫含量]使用市售的GSH-96 孔盘色度分析套组(96-well plate colorimetricGSH assay kit,Oxis International,Foster City，CA，USA)来测量麸胺硫(GSH)的含量。简单地说，将 40 μ 1的溶于盐酸的发色剂(chromogenicreagent)加入40 μ 1的不含蛋白质的肝细胞溶解液(non proteinhepatocytelysate)中，再力口入 40 μ 1 的氧氧化纳(Na0H,30% )禾口 40 μ 1 的呈色剂(colordeveloper)及缓冲溶液以混合为一混合液。接着缓和地震荡(vortex)该混合液后，将其置放于室温10分钟。最后使用光谱仪(ELISA microplate reader, μ Quant, Bio-Tek instruments, Inc.，Winooski，VT, USA)于波长 412nm 侦测吸光值，并与一已知浓度的GSH吸光值曲线比较，以判读GSH的含量。同上述方法，测定实验小鼠血清中麸胺硫的含量。[格利斯亚硝酸盐检验及肿瘤坏死因子-α之测定]根据格利斯反应(Griess reaction)原理测量细胞培养之上澄清液和小鼠血清中所累积的亚硝酸盐，以间接测得一氧化氮的产生量。细胞培养的上澄清液和血清中肿瘤坏死因子-α量的测定系使用市售之人类肿瘤坏死因子-α ELISA套组(human TNF- α ELISA kit)。简单地说，将前述!fepG2细胞以1 X lOYells/well的浓度分别培养于96孔盘中，并依据实验设计添加钓樟酮和酒精共同培养M小时。培养后的培养液以前述套组的工作试剂 (work reagent)经1 2的比例稀释。然后每100 μ 1稀释后的培养液则依据前述套组的使用守则进行ELISA反应，再以光谱仪于波长450nm侦测吸光值，以判定肿瘤坏死因子-α的含量；小鼠实验中，小鼠血清也如上述依据前述套组的使用方法，经适当稀释后进行肿瘤坏死因子-α的含量测试。[检测细胞中活性氧化物的累积]使用市售荧光标定分子 DCF-DA (dihydrodichloro-f Iuoresceindiacetate ； Sigma, USA)来监测细胞内活性氧化物(ROS)的累积。简单地说，将细胞(IX IO7)以磷酸缓冲溶液湿润后，加入ΙΟμπι的DCF-DA。于37 °C中培养4个小时后，以荧光光谱仪 (fluorescence spectrophotometer)测定焚光量(488nm/530nm)。[制备细胞质萃取液和细胞核萃取液]制备细胞质萃取液和细胞核萃取液的方法依据所属领域已知的实验步骤并使用市售的实验套组(protocol#78833Nuclear and CytoplasmicExtraction Reagent kit)。 并使用市售蛋白质分析试剂(protein assay reagent, Bio-Rad)来测定蛋白质浓度。[西方墨点法]本发明所述西方墨点法检验是依据所属领域的习知实验步骤进行，其中以前述抗体及增加化学冷光试剂(enhanced chemiluminescene regents, ECL, Pierce)进行免疫墨点法(immunoblotting),再以显相装置(imagingdevice, Viogene Biotek, Sunnyvale, CA, USA)观察结果。[电泳位移分析法](Electrophoretic mobility shift assay, EMSA) Μ0ΜΕ 知的实验方法进行。简言之，所使用的寡核苷酸探针Nrf-2顺股引子5' -CAG CAG GAC ATG GAT TTG ATT GAC-3‘，逆股引子 5' -AGA AAA GGCTCC ATC CTC CCG AAC-3‘由 TRI Biotech (Taipei, Taiwan)合成，接着于TE缓冲液内94°C加热5分钟，慢慢冷却3小时以黏合双股。细胞核萃取物(20 μ g/ml)与20ng双股Nrf-2寡核苷酸(加入5 μ 1结合缓冲液) 于室温作用30分钟，以6%原式聚丙酰酰氨胶(native polyacrylamide gel)分离DNA/蛋白质复合物，接着利用 Light-Siift Chemiluminescent EMSA Kit (Pierce Biotechnology Inc.，Rockford, USA)使复合物呈像，再使用 VLChemi-Smart 3000 (Viogene Biotek)系统获取冷光强度影像。[RNA萃取及同步定量聚合酶连锁反应]使用Trizol 试剂(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)由抽取细胞的全核醣核酸(total RNA) 0以反转录聚合酵素连锁反应将HO-I和i3-actin(i3-肌动蛋白)的讯息核醣核酸(mRNA)反转录为cDNA，再以实时定量聚合酵素连锁反应(real time-PCR, Applied Biosystems)定量 H0—1 禾口 β—actin 的表现量。前述实时定量聚合酵素连锁反应是以DNA结合染剂绿色核酸凝胶染液(STOR Green)来侦测PCR产物。温度循环(thermal cycle)为于96°C 3分钟；40个循环的 960C 1 分钟、50°C 30 秒和 72°C 90 秒。引子序列为:H0_1 顺股 5，-TGC GGT GCA GCT CTT CTG-3，；H0-1 逆股 5，-GCA ACCCGA CAG CAT GC-3，； β-actin 顺股 5，-ACC CAC ACT GTG CCC ATCTA-3，； β-actin 逆股 5，-CGG AAC CGC TCA TTG CC-3，。β-actin 系为一管家基因(houseke印ing gene)，为细胞内稳定且大量表现的基因，于实验中用以标准化H0-1的表现量。实施例2以!fepG2细胞模式探讨钓樟酮对抗酒精性氧化压力和肝炎之功效
本实施例以!fepG2细胞作为模式系统(model system)，检测钓樟酮于酒精引发之氧化压力的功效。[细胞毒性]首先检验钓樟酮和酒精的细胞毒性。在钓樟酮的细胞毒性检测方面，依据前述细胞培养方法培养的ifepG2细胞分为5个组别，分别于培养液中加入0、1、5、10或20μ g/ml 的钓樟酮共同培养M小时；在酒精的细胞毒性检测方面，依据前述细胞培养方法培养的 HepG2细胞分为6个组别，分别于培养液中加入0、10、50、100、200或500mM的酒精共同培养 24小时。前述未添加任何钓樟酮和酒精的组别为本实施例的对照组(即，0μ g/ml的钓樟酮以及OmM的酒精)。再以MTT试验测定细胞的存活率(请参实施例一 [MTT试验])。图1为钓樟酮的细胞毒性检测结果，数据显示20 μ g/ml的实验组相较于对照组降低了约40%的细胞存活，但 ομ g/ml以下浓度的钓樟酮，则没有细胞毒性。图2则显示添加高于IOOmM的酒精的实验组开始产生细胞毒性。[HepG2细胞模式的实验设计]将前述常态培养的H印G2细胞分组，分别与0、1、5、10μ g/ml的钓樟酮(0 μ g/ml 为负对照组)或 ο μ g/ml的姜黄素(curcumin，已知的抗氧化天然化合物，于本发明中作为正对照组使用)共同培养1小时后，再加入酒精(IOOmM)培养M小时以激发氧化压力，其实验组和各对照组的配置如下表一表一 !fepG2细胞模式的实验设计
权利要求
1.钓樟酮在制备治疗肝炎药物中的用途。
2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于所述的肝炎包括酒精性肝炎。
3.一种治疗肝炎的医药组合物，包括治疗上有效量的钓樟酮及医药可接受的载体。
4.按照权利要求3所述的医药组合物，其特征在于，各组分的用量为钓樟酮1 2wt%，医药可接受的载体98 99wt%。
5.按照权利要求3或4所述的医药组合物，其特征在于所述医药可接受的载体包括淀粉、乳糖、蔗糖、微晶纤维素或羧甲基纤维素。
6.按照权利要求3或4所述的医药组合物，其特征在于所述医药组合物进一步包含医药可接受的添加剂。
7.按照权利要求6所述的医药组合物，其特征在于所述添加剂包括氨基酸、维生素或矿物质。
8.按照权利要求3或4所述的医药组合物，其特征在于制备成临床上可接受的适宜制剂。
9.按照权利要求8所述的医药组合物，其特征在于所述制剂包括锭剂、胶囊、皮肤贴剂、悬浮剂、粉末、鼻吸剂、喷剂或注射剂。
全文摘要
本发明公开了钓樟酮在制备治疗肝炎药物中的用途。本发明通过大量的试验发现，钓樟酮对于肝炎(尤其是酒精性肝炎)具有显著的治疗效果，其副作用低，临床应用安全。
文档编号A61P1/16GK102274209SQ201010199339
公开日2011年12月14日 申请日期2010年6月12日 优先权日2010年6月12日
发明者王升阳 申请人:台湾利得生物科技股份有限公司