二羟酸脱水酶基因及其用途的制作方法

专利名称：二羟酸脱水酶基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及二羟酸脱水酶基因及其用途，特别涉及制造香味良好的酒 精饮料的酿造酵母、使用该酵母制造的酒精饮料、以及制造所述饮料的方法等。更具体地说，本发明涉及通过提高酵母中编码二羟酸脱水酶IIv3p的 ILV3基因、特别是啤酒酵母的特征基因nonScILV3的表达量，使导致产品 异味的二酮类、特别是双乙酰的生产量降低的酵母，以及涉及使用该酵母 的酒精饮料的制造方法等。
背景技术：
在酒精饮料的气味成分中，双乙酰(以下称"DA")气味是啤酒、清酒 以及葡萄酒等酿造酒精饮料中的代表性异味之一。DA气味(啤酒中表现为 馊饭味或黄油味，清酒中表现为酸臭味)是由于以DA为主的连二酮类(以 下称"VDK")在产品中超过一定的阈值后而产生的。据报道其在啤酒中的 阈值是0.1ppm (Journal of the Institute of Brewing 、 76、 486 (1970))。酒精饮料中的VDK大致分为DA和2， 3-戊二酮(以下称PD)， DA 和PD分别是以缬氨酸和异亮氨酸生物合成体系中间产物的ot-乙酰乳酸和 a-乙酰羟基丁酸作为前体，通过无酵母参与的非酶促反应而生成的。由上述可知，VDK (DA和PD)及其前躯体a-乙酰羟酸类(a-乙酰乳 酸和a-乙酰羟基丁酸)等被认为是能够使产品产生DA气味的化合物。因 此，使这些化合物稳定降低的酵母的育种，不仅能够使酒精饮料的制造管 理变得容易，而且能够扩大新产品开发的可能性。在清酒制造过程中，例如日本特开2001-204457公报报道了通过使用含 有低浓度丙酮酸的米-麦芽酵母培养物抑制DA生成的方法，其中所述的丙 酮酸为乙酰羟酸类的前体。对于啤酒制造，在Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 94-99 (1973)中也报道了在缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型酵母中VDK生成量降低的现象。但是，营养缺陷型菌 株容易发生增殖、发酵迟缓现象，所以这种酵母还未实现实用化。在曰本特开2002-291465号公报中，公开了取得对于上述支链氨基酸类似物具有敏 感性的突变株，从其中选取DA低蓄积的菌株的方法。在Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 81-84 (1987)中报道了源自实验室 酵母且其ILV5基因的表达量受到调节的基因工程酵母，此外，在European Brewery Convention, Proceedings of the 21st EBC congress, Madrid, 553-560 (1987)中也同样报道了ILV3基因的表达量受到调节的基因工程酵母。此 时ILV5基因编码的乙酰羟酸还原异构酶的酶活性增加5-7倍，VDK生成量 减少到40%左右。此外，ILV3基因编码的二羟酸脱水酶的酶活性增加5-6倍，VDK生成 量没有明显减少。但是上述2个报告中都使用了合成培养基，且都没有对 实际啤酒酿造的影响进行分析。另一方面，Villa等在Journal of American Society of Brewing Chemists,53: 49-53 (1995)中报道，通过使ILV5基因、 ILV3基因以及串连的这两者进行高表达，在使用麦汁的发酵试验中VDK 生成量分别减少70%、 40%和60%。Dulieu等在European Brewery Convention, Proceedings of the 26th EBC congress, Maastricht, 455-460 (1997)中提出如下技术方案,即通过使用a-乙 酰乳酸脱羧酶，将DA的前体即a-乙酰乳酸迅速转化为3-羟基丁酮。但是， 日本税务制度不允许在发酵中的酒醪中添加酶。日本特开平2-265488号公 报和日本特开平7-171号公报中，均报道了使用编码a-乙酰乳酸脱羧酶的 DNA链的基因工程酵母。发明内容鉴于上述状况，期望开发出其中VDK (连二酮类)，特别是DA (双乙 酰)的生成得到减少的酒精饮料的制造方法。本发明者为了解决上述课题进行了精心研究，结果从啤酒酵母中成功 鉴定、分离出编码二羟酸脱水酶的基因。即本发明涉及啤酒酵母中特征 性存在的新型二羟酸脱水酶基因、该基因编码的蛋白质、该基因的表达受到调控的转化酵母、通过使用该基因的表达受到调控的酵母从而控制产品中的VDK浓度、特别是DA浓度的方法等。更具体地，本发明具体提供下 述多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入该载体的转化酵母、使用该转 化酵母的酒精饮料的制造方法等。(1) 选自由下述(a) (f)组成的组中的多核苷酸，(a) 多核苷酸，其含有由序列号1的核苷酸序列组成的多核苷酸；(b) 多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质由序列号 2的氨基酸序列组成；(c) 多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质由在序列 号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨 基酸序列组成，且具有二羟酸脱水酶活性；(d) 多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序 列号2的氨基酸序列有60%以上同一性的氨基酸序列，且具有二羟酸脱水 酶活性；(e) 多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该种多核苷酸在严谨条件下与 由序列号1的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸进行杂交，且 编码具有二羟酸脱水酶活性的蛋白质；以及(f) 多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该种多核苷酸在严谨条件下与 由编码序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列互补 的核苷酸序列组成的多核苷酸进行杂交，且编码具有二羟酸脱水酶活性的 蛋白质。(2) 如上述(1)所述的多核苷酸，其选自由下述(g) (i)组成的组(g) 多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质由序列号 2的氨基酸序列或在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加l 10个氨基酸后的氨基酸序列组成，且具有二羟酸脱水酶活性；(h) 多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序 列号2的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且具有二羟酸脱水 酶活性；以及(i)多核苷酸，其在严谨条件下与序列号1或序列号1的核苷酸序列 的互补核苷酸序列进行杂交，且编码具有二羟酸脱水酶活性的蛋白质。(3) 如上述(1)所述的多核苷酸，其含有由序列号1的碱基序列组 成的多核苷酸。(4) 如上述(1)所述的多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸 序列组成的蛋白质的多核苷酸。(5) 如上述(1) (4)中任一项所述的多核苷酸，其为DNA。(6) 蛋白质，其是由上述(1) (5)中任一项所述的多核苷酸编码 的蛋白质。(7) 载体，其含有上述(1) (5)中任一项所述的多核苷酸。 (7a)上述(7)所述的载体，其包括含有下述(x) (z)的构成要素的表达盒(x)在酵母细胞内可转录的启动子，(y)在该启动子的正义或反义方向上连接的上述(1) (5)中任一 项所述的多核苷酸，以及(z)涉及RNA分子的转录终止及多聚腺苷化作用，在酵母内起作用 的信号。(8) 酵母，其中导入了上述(7)所述的载体。(9) 如上述(8)所述的酵母，其中通过导入上述(7)所述的载体， 总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力降低。(10) 如上述(8)所述的酵母，其中通过增加上述(6)所述的蛋白 质的表达量而使酵母的总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力降低。(11) 酒精饮料的制造方法，其使用上述(8) (10)中任一项所述 的酵母。(12) 如上述(11)所述的酒精饮料的制造方法，其中，酿造的酒精 饮料是麦芽饮料。(13) 如上述(11)所述的酒精饮料的制造方法，其中，酿造的酒精 饮料是葡萄酒。(14) 酒精饮料，其为采用上述(11) (13)中任一项所述的方法制造的酒精饮料。(15) 酵母的评价方法，其为使用根据具有序列号1的核苷酸序列的 二羟酸脱水酶基因的核苷酸序列设计的引物或探针，对被测酵母的总连二 酮生产能力或总双乙酰生产能力进行评价的方法。(15a)酵母的选择方法，其利用上述(15)所述的方法，选择总连二 酮生产能力或总双乙酰生产能力降低的酵母。(15b)使用根据上述(15a)所述的方法选取的酵母来制造酒精饮料 (如啤酒)的方法。(16) 评价被测酵母的总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力的方法， 其包括培养被测酵母；以及测定具有序列号1的核苷酸序列的二羟酸脱 水酶基因的表达量。(16a)选取总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力降低的酵母的方 法，其包括利用上述(16)所述的方法，评价被测酵母；以及选取二羟酸脱水酶基因的表达量高的酵母。(16b)使用根据上述(16a)所述方法选取的酵母来制造酒精饮料(如 啤酒)的方法。(17) 酵母的选择方法，其包括培养被测酵母；对上述(6)所述的 蛋白质进行定量或测定具有序列号1的核苷酸序列的二羟酸脱水酶基因的 表达量；以及选择所述蛋白质的量或所述基因表达量与总连二酮或总双乙 酰的目标生产能力相应的被测酵母。(17a)酵母的选择方法，其包括培养被测酵母；定量分析总连二酮 生产能力或总双乙酰生产能力或二羟酸脱水酶的活性；以及选择总连二酮 或总双乙酰的生产能力为目标能力或二羟酸脱水酶的活性为目标活性的被 测酵母。(18) 如上述(17)所述的酵母的选择方法，其包括培养标准酵母 和被测酵母；测定具有序列号1的核苷酸序列的二羟酸脱水酶基因在各酵 母中的表达量；以及选择其中该基因的表达高于标准酵母的被测酵母。(19) 如上述(17)所述的酵母的选择方法，其包括培养标准酵母 和被测酵母；对各酵母中的上述(6)所述的蛋白质进行定量；以及选择其中该蛋白质的量多于标准酵母的被测酵母。(20)酒精饮料的制造方法，其包括使用上述(8) (10)中任一项所述的酵母或使用根据上述(17) (19)任一项所述的方法选择的 酵母中的任一种酵母，进行制造酒精饮料的发酵；以及使总连二酮生产量 或总双乙酰生产量降低。


图1表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化，横轴表示发酵时间， 纵轴表示0D660值(660nm时的光密度)。图2表示啤酒酿造试验中浸出物消耗量的经时变化，横轴表示发酵时 间，纵轴表示浸出物的表观浓度(w/wy。)。图3表示啤酒酿造试验中的酵母中nonScILV3基因的表达行为，横轴 表示发酵时间，纵轴表示检测出的信号辉度。图4表示使用ILV3破坏株的nonScILV3的互补试验结果。a)表示因 ILV3破坏，形成缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型。将亲株和ILV3 破坏株在SC (-Leu,Ile，Val)平板培养基上30。C培养3天。b)表示通过将 nonScILV3导入ILV3破坏株，形成非营养缺陷型。将亲株和ILV3基因破 坏株X2180-lA(ilv3::natl )在含有300mg/L遗传霉素(Geneticin)和50 mg/L 诺尔丝菌素(nourseothricin)的SC (-Leu，Ile,Val)平板培养基上30。C培养 3天。
具体实施方式
本发明者根据利用日本特开2004-283169公开的方法解读的啤酒酵母 基因组的信息，分离、鉴定出啤酒酵母特有的编码二羟酸脱水酶的基因 nonScILV3。该基因的核苷酸序列用序列号1表示，此外由该基因编码的蛋 白质的氨基酸序列用序列号2表示。 1.本发明的多核苷酸首先，本发明提供(a)多核苷酸，其含有由序列号1的核苷酸序列 组成的多核苷酸；以及(b)多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。作为本发明的对象的多核苷酸，并不限定于上述来自啤酒酵母的编码 二羟酸脱水酶的多核苷酸，而且还包括编码与该蛋白质具有同等功能的蛋 白质的其他多核苷酸。作为具有同等功能的蛋白质，例如可以为(c)蛋白 质，其由在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加l个或多 个氨基酸后的氨基酸序列组成，且具有二羟酸脱水酶活性。此类蛋白质可以为由在序列号2的氨基酸序列中如缺失、取代、插 入及/或添加1 100个、1 90个、1 80个、1 70个、1 60个、1 50 个、1 40个、1 39个、1 38个、卜37个、1 36个、1 35个、l 34个、1 33个、1 32个、1 31个、1 30个、1 29个、1 28个、l 27个、1 26个、1 25个、1 24个、1 23个、1 22个、1 21个、l 20个、卜19个、1 18个、1 17个、1 16个、1 15个、卜14个、l 13个、1 12个、1 11个、1 10个、l 9个、1 8个、1 7个、1 6 个(1 数个)、1 5个、1 4个、1 3个、1 2个、l个氨基酸残基后的 氨基酸序列组成，且具有二羟酸脱水酶活性的蛋白质。上述氨基酸残基缺 失、取代、插入及/或添加的数量， 一般越小越好。并且此类蛋白质还可以 为(d)蛋白质，其具有与序列号2的氨基酸序列有约60%以上、约70%以 上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77% 以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82°/。以上、83%以上、 84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以 上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97% 以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4 % 以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7°/。以上、99.8%以上、99.9%以上同一 性的氨基酸序列，且具有二羟酸脱水酶活性。上述同源性的数值一般越大 越好。此外，二羟酸脱水酶的活性，例如可根据Kiritani等的方法(Methods Enzymol" 17:755-764 (1970))进行测定。本发明还包括(e)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，即该多核苷酸在严谨条件下，与由序列号1的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸进行杂交，且编码具有二羟酸脱水酶活性的蛋白质；以及(f)多核苷 酸，其含有如下多核苷酸，即该多核苷酸在严谨条件下，与由编码序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列的互补核苷酸序列组 成的多核苷酸进行杂交，且编码具有二羟酸脱水酶活性的蛋白质。 这里所述的"在严谨条件下杂交的多核苷酸"，是指将序列号1的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸、或编码序列号2的氨基酸序列的 多核苷酸的全部或一部分作为探针，使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法、或 Southern杂交法等得到的多核苷酸序列(例如DNA)。杂交方法可以利用如 Molecular Cloning 3rd Ed.， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons 1987-1997等记载的方法。本说明书所述的"严谨条件"，可以为低严谨条件、中严谨条件和高严谨 条件中的任一种。"低严谨条件"，如为5xSSC、 5xDenhardt液、0.5%SDS、 50%甲酰胺、32。C的条件；此外，"中严谨条件"，如为5xSSC、 5xDenhardt 液、0.5%SDS、 50%甲酰胺、42°。的条件；"高严谨条件"，如为5xSSC、 5xDenhardt液、0.5%SDS、 50%甲酰胺、50。C的条件。在这些条件中，认为 温度越高越能有效得到同源性高的多核苷酸(例如DNA)。当然， 一般认 为影响杂交严谨度的因素有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、 盐浓度等多种要素，同领域技术人员通过适当选择这些要素可以实现相同 的严谨度。使用市售的试剂盒进行杂交时，如可以使用Alkphos Direct Labelling Reagents(Amersham Pharmacia公司制造)。这种情况下，按照试剂盒中附带 的说明书，与已标记的探针保温过夜后，在55'C的条件下用含有 0.1%(w/v)SDS的1次洗涤缓冲液将膜洗涤后，从而检测杂交的多核苷酸(例 如DNA)。除此之外，作为可杂交的多核苷酸，可以为通过FASTA、 BLAST等同 源性检索软件用默认参数进行计算时，与编码序列号2的氨基酸序列的多 核苷酸有约60%以上、约70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74% 以上、75°/。以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、 81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、 95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1以上％、 99.2 以上％、 99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8% 以上、或99.9%以上同一性的多核苷酸。氨基酸序列、核苷酸序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的 BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268， 1990;Proc.Nat1. Acad.Sci.USA 90:5873,1993)来确定。开发了基于BLAST算法的被称为 BLASTN、 BLASTX的程序(Altschul SF，et al:J. Mol. Biol. 215:403, 1990)。用BLASTN分析核苷酸序列时，使参数为如score=100 、 wordlength=12;此外，用BLASTX分析氨基酸序列时，使参数为如score=50、 wordlength=3;使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各程序的默认 参数。2.本发明的蛋白质本发明还提供由上述(a) (i)中任一种多核苷酸所编码的蛋白质。 本发明的一种优选蛋白质为由在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、 插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列组成，且具有二羟酸脱水 酶活性的蛋白质。此类蛋白质可以为由在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/ 或添加上述数量的氨基酸残基后的氨基酸序列组成，且具有二羟酸脱水酶 活性的蛋白质。此外，此类蛋白质还可以如上所述为具有与序列号2的氨 基酸序列有约60%以上，优选约70°/。以上，更优选约80%以上，进一步优 选约90%以上，或最优选约95%以上的同源性的氨基酸序列，且具有二羟 酸脱水酶活性的蛋白质。此类蛋白质可通过使用《Molecular Cloning 3》、《Current Protocols in Molecular Biology》、"Nuc, Acids. Res" 10, 6487 (1982)"、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)"、 "Gene, 34, 315 (1985)"、 "Nuc. Acids. Res" 13， 4431 (1985)"、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)"等记载的定点诱变 法获得。本发明中，在蛋白质的氨基酸序列中1个以上的氨基酸残基缺失、取代、插入及/或添加，是指在同一序列中的任意1个或多个氨基酸序列的位 置上的1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入及/或添加，并且可同时发 生缺失、取代、插入及添加中的两种以上。下面列举可互相取代的氨基酸残基，同一组中包含的氨基酸残基可互 相取代。A组亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨 酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组天冬酰胺、谷氨酰胺；D组赖氨酸、 精氨酸、鸟氨酸、2， 4-二氨基丁酸、2， 3-二氨基丙酸；E组脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组苯 丙氨酸、酪氨酸。本发明的蛋白质也可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧 羰基法)等化学合成法合成。并且也可以利用Advanced ChemTech公司、铂 金埃尔累犬(Perkin Elmer)、 Pharmacia公司、Protein Technology Installment 公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、岛津制作等所制造的肽合成 仪进行化学合成。3.本发明的载体及用该载体转化的酵母本发明提供含有上述多核苷酸的载体，本发明的载体含有上述(a) (i)中任一项所述的多核苷酸(例如DNA)。并且，本发明的载体通常包 括表达盒，该表达盒含有的结构要素为(x)在酵母细胞内可转录的启动 子；(y)在该启动子的正义或反义方向上连接的上述(a) (O任一项记 载的多核苷酸(例如DNA);以及(z)涉及RNA分子的转录终止及多聚 腺苷化作用，在酵母内起作用的信号。向酵母内导入时使用的载体，可为多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp 型)、或染色体整合型(YIp型)中的任一种。例如作为YEp型载体，已知 有YEp24 (J. R. Broach et al.， Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83， 1983)，作为YCp型载体，已知有YCp50 (M. D.Rose etal.， gene， 60， 237， 1987),作为YIp型载体，已知有YIp5 (K. Struhl etal.， Proc. Natl. Acad, Sci. USP， 76， 1035， 1979)，且容易获得。可以任意组合加入用于调节酵母内基因表达的启动子/终止子，只要其 在酿造用酵母中发挥作用的同时，不影响酒醪中的氨基酸和浸出物等组成物的浓度。例如可使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷 酸甘油酸激酶基因(PGK1 )的启动子等。这些基因均己克隆，如在M. R Tuite etal.， EMBOJ.， 1， 603 (1982)中有详细记载，通过已知的方法能够容易获 得。作为转化时使用的选择性标记，因酿造用酵母不能利用营养缺陷型标 记，可利用遗传霉素抗性基因(G418r)、铜抗性基因(CUP1) (Marinetal.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 81, 337 1984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(分别在猪腰淳嗣等，生物化学，64， 660， 1992; Hussain et al.， gene， 101， 149， 1991。日语原文「猪腰淳嗣、生化学，64, 660, 1992; Hussain et al., gene, 101, 149， 1991」)等。 将上述构建的载体导入宿主酵母内。作为宿主酵母，其可以为可在酿造中使用的任何酵母，如用于酿造啤酒、葡萄 酒、清酒等的酵母等。具体可以为如酵母属(5^"/^ram;^")等酵母，在 本发明中，可使用啤酒酵母，如巴斯德酵母(&cc/^ramyc&s poston'am^) W34〃0等、fecc/zaraw^c^ ca^^ergm^ NCYC453、 NCYC456等、或 Sac血ram戸s ce固'w'"e NBRC 1951 、NBRC 1952、NBRC 1953 、或NBRC 1954 等。还可使用葡萄酒酵母(如日本酿造协会的1号、3号、和4号等的葡萄 酒酵母)、清酒酵母(如日本酿造协会的7号和9号等的清酒酵母)，但并 不限于这些酵母。在本发明中，优选使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母(&cc/zara，ces /70 to"'awi^ )。酵母的转化方法可利用一般使用的公知方法。如可利用电穿孔法"Meth. Enzym.， 194， p182 (1990)"、原生质球法(Spheroplast) "Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 75 p 1929(1978)"、乙酸锂法"J. Bacteriology, 153， pl63(1983)"、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 75 p1929 (1978)、 Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等记载的方法实施， 但并不限于这些方法。更具体地说，将宿主酵母在标准酵母营养培养基(如YEPD培养基"Genetic Engineering. Vol.1 ， Plenum Press, New York, 117(1979)"等)中培 养至OD600nm值为1 6。将该培养酵母离心分离并收集，洗净，用浓度 约为1M 2M的碱金属离子优选锂离子进行前处理。上述细胞在约30。C 下静置约60分钟后，与导入的DNA (约l吗 20吗)同时在约3(TC下静 置约60分钟。添加聚乙二醇，优选约4， 000道尔顿的聚乙二醇，使最终 浓度约为20% 50%。约3(TC下静置约30分钟后，将该细胞在约42"C下 加热处理约5分钟。优选用标准酵母营养培养基将上述细胞悬浮液洗净， 加入到规定量的新鲜标准酵母营养培养基中，然后在约3(TC下静置约60分 钟。然后，将其移植到含有作为选择性标记使用的抗生素等的标准琼脂培 养基上，获得转化体。此外，对于通常的克隆技术，可参照《Molecular Cloning 3》、"Methods in Yeast Genetics 、 A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor, NY)"等。4. 本发明的酒精饮料的制造方法以及根据该方法得到的酒精饮料将上述本发明的载体导入适于酿造目标酒精饮料的酵母中，通过使用 该酵母，能够制造期望的使酒精饮料中VDK、特别是DA的浓度降低，香 味提高的酒精饮料。此外，同样也可以使用根据本发明的酵母的评价方法 选择出的酵母。目标酒精饮料可以为啤酒、诸如啤酒味饮料的发泡酒、葡 萄酒、威士忌、清酒等，但并不限于这些。制造上述酒精饮料时，除使用本发明得到的酿造酵母代替亲株之外， 使用的是公知的方法。因此，原料、制造设备、制造管理等可与以往方法 完全相同，并不会因制造使VDK、特别是DA的浓度降低的酒精饮料而增 加成本。BP,根据本发明，能够使用已有的设备制造香味等良好的酒精饮 料而不会增加成本。5. 本发明的酵母的评价方法本发明涉及评价方法，该评价方法使用根据具有序列号1的核苷酸序 列的二羟酸脱水酶基因的核苷酸序列设计的引物或探针，评价被测酵母的 总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力。上述评价方法的一般方法是公知 的，例如在WO01/040514号公报、日本特开平8-205900号公报等中有记载。下面，对该评价方法进行简单说明。首先，制备被测酵母的基因组。制备方法可采用Hereford法、乙酸钾 法等任何一种公知方法(如Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130(1990))。以得到的基因组为对象，使用根据二羟酸 脱水酶基因的核苷酸序列(优选ORF序列)设计的引物或探针，检测被测 酵母的基因组中是否存在该基因或该基因的特异序列。引物或探针的设计 可采用公知的方法进行。基因或特异序列的检测可采用公知的方法实施。例如，将含有特异序 列的一部分或全部的多核苷酸或者含有该核苷酸序列的互补核苷酸序列的 多核苷酸作为一个引物，另一个引物使用含有该序列的上游或下游序列的 一部分或全部的多核苷酸或者含有该核苷酸序列的互补核苷酸序列的多核 苷酸，通过PCR法扩增酵母的核酸，测定扩增产物的有无、扩增产物分子 量的大小等。用于引物的多核苷酸的碱基数通常为10bp以上，优选15bp 25bp。此外，引物之间的碱基数通常以300bp 2000bp为宜。PCR法的反应条件无特别限定，如可采用变性温度90°C 95°C，退 火温度40°C 60°C,延伸温度60°C 75°C,循环数10次以上等的条 件。得到的反应生成物通过用琼脂糖凝胶等的电泳法等得到分离，以测定 扩增产物的分子量。通过该方法，根据扩增产物的分子量是否是含有特异 部分的DNA分子的大小，预测、评价该酵母的总连二酮生产能力或总双乙 酰生产能力。并且通过分析扩增物的核苷酸序列，可以更准确地预测、评 价上述能力。在本发明中，通过培养被测酵母，测定具有序列号1的核苷酸序列的 二羟酸脱水酶基因的表达量，也能够评价被测酵母的总连二酮生产能力或 总双乙酰生产能力。对此，二羟酸脱水酶基因的表达量的测定，可通过培 养被测酵母，对二羟酸脱水酶基因的产物mRNA或蛋白质进行定量来进行。 mRNA或蛋白质的定量可采用公知的方法进行。mRNA的定量例如可通过 Northern杂交法、定量RT-PCR进行，蛋白质的定量例如可通过Western印 迹法进行 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。培养被测酵母，通过测定具有序列号1的核苷酸序列的本发明基因的 表达量，选择与目标总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力相应的上述基 因表达量的酵母，能够选择出适于酿造所期望酒精饮料的酵母。此外，也 可以培养标准酵母及被测酵母，测定各酵母中上述基因的表达量，比较标 准酵母和被测酵母中上述基因的表达量，从而选择所期望的酵母。具体来 说，例如培养标准酵母及一种或多种被测酵母，测定具有序列号1的核苷 酸序列的二羟酸脱水酶基因在各酵母中的表达量，通过选择与标准酵母相 比该基因为高表达的被测酵母，能够选择出适于酿造所期望酒精饮料的酵 母。或者，培养被测酵母，通过选择总连二酮生产能力或总双乙酰生产能 力较低低、或二羟酸脱水酶活性较高的酵母，能够选择出适于酿造所期望 酒精饮料的被测酵母。这种情况下，作为被测酵母或标准酵母，例如可以使用导入上述本发 明载体的酵母、上述本发明的基因的表达增加的酵母、上述本发明的蛋白 质的表达增加的酵母、实施突变处理的酵母、或发生自然突变的酵母等。总连二酮量的定量可通过Drews et al.， Mon. fUr Brau., 34, 1966记载的方法 进行。总双乙酰的定量例如可通过J Agric Food Chem. 50(13):3647-53, 2002 记载的方法进行。二羟酸脱水酶的活性例如可根据Kiritani等的方法 (Methods Enzymol.， 17: 755-764 (1970))进行测定。对于突变处理，例如 可以使用紫外线照射、放射线照射等物理方法，EMS (甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等试剂处理的化学方法等的任一方法(如参照大嶋泰治编 著、生物化学实验39酵母分子遗传学实验、p67-75、学会出版中心等。日 语原文「大嶋泰治編著、生物化学実験法39酵母分子遺伝学実験法、P 67-75、学会出版七 >夕一」)。能够作为标准酵母或被测酵母使用的酵母，可以为可在酿造中使用的 任何一种酵母，如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体可以为酵 母属 (Sacc/wframyces) 等酵母(例如《S. / ostoW"m^s、 S.cerev^/ae禾口 1S".carZy6e7^em7、)。在本发明中，可以使用啤酒酵母，如5^cc/wraw少ces / oyton'flw W34/70等；Sacc/wfra附j^s cw/Ae，m7i NCYC453或NCYC456es cewv/w'ae NBRC1951、 NBRC1952、 NBRC1953、或 NBRC1954等。并且，也可使用诸如5Wcc/wrawycas cwev/w'ae NCYC90威 士忌酵母、诸如日本酿造协会的l号、3号、和4号等的葡萄酒酵母、诸如 日本酿造协会的7号和9号清酒酵母等，但并不限于这些酵母。在本发明 中，优选使用啤酒酵母如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。标准 酵母、被测酵母也可以从上述酵母中任意组合选择。实施例以下根据实施例对本发明详细描述，但本发明不限于以下实施例。 实施例1: 二羟酸脱水酶基因(nonScILV3)的克隆利用日本特开2004-283169记载的比较数据库进行检索，结果发现了啤 酒酵母特有的新型二羟酸脱水酶基因nonScILV3 (序列号1)。根据获得的 核苷酸序列信息，分别设计用于扩增全长基因的引物nonScILV3—F (序列号 3) / nonScILV3—R (序列号4)，通过以基因组解读株&cc/^raA^ces Weihenstepan 34/70株的染色体DNA为模板的PCR，获得含有 nonScILV3的全长基因的DNA片段。将上述得到的nonScILV3基因片段，通过TA克隆插入pCR2.1-TOPO 载体(Invitrogen公司制造)。用Sanger法(R Sanger, Science, 214， 1215， 1981)分析并确定nonScILV3基因的核苷酸序列。实施例2:啤酒试酿中的nonScILV3基因表达分析使用啤酒酵母^cc/zflra，c&s / oston'(3"M1 Weihenstepan W34/70株进行 试酿，从发酵中的啤酒酵母菌体提取的mRNA通过酵母DNA微阵列进行 检测。麦芽汁浸出物浓度 12.69% 麦芽汁体积 70L 麦芽汁中溶解氧浓度 8.6ppm 发酵温度 15°C 酵母添加量 12.8xl(^细胞/mL对发酵液进行经时采样，观察酵母增殖量(图1)、浸出物表观浓度(图2)的经时变化。与此同时对酵母菌体进行采样，制备的mRNA用生物素进 行标记，使其与日本特开2004-283169中记载的啤酒酵母DNA微阵列进行 杂交。用GeneChip Operating System (GCOS; GeneChip Operating Software 1.0， Affymetrix公司制造)进行信号检测，nonScILV3基因的表达模式如图 3所示。该结果证明在通常的啤酒发酵中nonScILV3基因进行表达。实施例3:使用实验室酵母株的nonScILV3基因的互补试验利用内源性基因ILV3已破坏的实验室株，证明nonScILV3基因产物具 有二羟酸脱水酶的功能。根据文献(Goldstein etal.，yeast. 15 1541 (1999))的方法，通过以含有 耐药性标记的质粒(pAG25(nat1))作为模板的PCR，制作用于破坏ILV3 基因的片段。使用引物的序列用序列号5、 6表示。使用该片段，利用日本 特开平07-303475记载的方法转化& cerev/Wae X2180-1A株，用含有50 mg/L诺尔丝菌素的YPD平板培养基(1%酵母浸膏，2%多聚蛋白胨，2% 葡萄糖，2%琼脂)进行选择。将得到的ILV3破坏株接种于SC平板培养基(0.67%无氨基酸的酵母氮源(yeast nitrogen base without amino acids)、 0.2%氨基酸混合物、2%葡萄糖、2%琼脂)以及不含缬氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸的SC平板培养基(0.67%无氨基酸的酵母氮源、0.2%氨基酸混合物(去 除缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)、2%葡萄糖、2%琼脂)上，在30。C培养3天 分析生长繁殖情况。如图4及表1所示，可以证明ILV3破坏株在不含缬氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸的SC平板培养基上不生长繁殖，是支链氨基酸缺陷 型。接着，用限制酶Sacl和Notl酶解实施例1记载的 nonScILV3/pCR2.1-TOPO，制备包括蛋白质编码区域全长的DNA片段。使 该片段与用限制酶Sacl和Notl处理的pYCGPYNot连接，构建nonScILV3 组成型表达载体nonScILV3/pYCGPYNot。 pYCGPYNot是YCp型的酵母表 达载体，导入的基因通过丙酮酸激酶基因PYK1的启动子进行组成型表达。 酵母内的选择性标记含有Geneticin抗性基因G418、此外，大肠菌内的选择性标记含有氨苄青霉素抗性基因Amp:将制作的表达载体导入ILV3破坏株(X2180-1A ilv3::natl)内，通过 RT-PCR证明nonScILV3进行高表达。作为对照，制作不含插入片段的 pYCGPYNot导入株。将这些菌株用不含缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的SC 平板培养基进行同样评价的结果(图4-b、表l)，发现导入nonScILV3的 菌株在培养基上生长繁殖，证明通过导入nonScILV3后菌株变为非支链氨 基酸缺陷型，即nonScILV3基因产物具有二羟酸脱水酶的功能。表1菌株 Sc(-Leu,Ile,Val)平板培养基上的生长蘩殖亲株(X2180-1"ILV3破坏株0t2180-1A ilv3::nat)ILV3被坏抹(X2180-ilv3::nat)+pTCGPYUotU无插入片段) ILV3被坏株(X2180-1A ilv3: :nat)+加nScILV3/pTCGPYUotl生长蘩殖不生长繁殖不生长繁殖生长1SS实施例4: nonScILV3基因的组成型表达使用实施例3制作的组成型表达载体，利用日本特开平07-303475记载 的方法，转化tSacc/^w附yces / astonVwz^ Weihenstepan 34/70株。用含有 300mg/L遗传霉素的YPD平板培养基(1%酵母浸膏，2%多聚蛋白胨，2% 葡萄糖，2%琼脂)选择转化体。实施例5:啤酒酿造试验试验中VDK生成量的分析使用亲株和实施例4获得的nonScILV3高表达株的发酵试验在以下条 件下进行。麦芽汁浸出物浓度 12%麦芽汁体积 1L麦芽汁中溶解氧浓度 约8ppm发酵温度 15°C，恒定酵母添加量 5g湿酵母菌体/L麦芽汁对发酵酒醪进行经时采样，分析酵母增殖量(OD660)、浸出物消耗量 的经时变化。酒醪的总VDK的定量，通过下述方法进行，g卩使VDK(DA和PD)和羟基胺反应，使生成的乙二肟衍生物和2价铁离子反应，测定生 成的络合物的吸光度(Drews et al.， Mon. for Brau., 34, 1966)。将前体a-乙 酰乳酸和a-乙酰羟基丁酸分别转化为DA、 PD，这样就可以求出含有这些 物质的总VDK量。工业实用性根据本发明的酒精饮料制造方法，能够容易地制造使产品中作为异味 的VDK、特别是DA生产量降低，香味良好的酒精饮料。
权利要求
1. 选自由下述(a)～(f)组成的组中的多核苷酸(a)多核苷酸，其含有由序列号1的核苷酸序列组成的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质由序列号2的氨基酸序列组成；(c)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质由在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列组成，且具有二羟酸脱水酶活性；(d)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且具有二羟酸脱水酶活性；(e)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该种多核苷酸在严谨条件下与由序列号1的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸进行杂交，且编码具有二羟酸脱水酶活性的蛋白质；以及(f)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该种多核苷酸在严谨条件下与由编码序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸进行杂交，且编码具有二羟酸脱水酶活性的蛋白质。
2、 如权利要求1所述的多核苷酸，其选自由下述(g) (i)组成的组(g) 多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质由序列号 2的氨基酸序列或在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加l 10个氨基酸后的氨基酸序列组成，且具有二羟酸脱水酶活性；(h) 多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序 列号2的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且具有二羟酸脱水 酶活性；以及(i) 多核苷酸，其在严谨条件下与序列号1或序列号1的核苷酸序列 的互补核苷酸序列进行杂交，且编码具有二羟酸脱水酶活性的蛋白质。
3、 如权利要求1所述的多核苷酸，其含有由序列号1的碱基序列组成 的多核苷酸。
4、 如权利要求1所述的多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序 列组成的蛋白质的多核苷酸。
5、 如权利要求1 4中任一项所述的多核苷酸，其为DNA。
6、 蛋白质，其是由权利要求1 5中任一项所述的多核苷酸编码的蛋 白质。
7、 载体，其含有权利要求1 5中任一项所述的多核苷酸。
8、 酵母，其中含有权利要求7所述的载体。
9、 如权利要求8所述的酵母，其中通过导入权利要求7所述的载体使 总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力降低。
10、 如权利要求8所述的酵母，其中通过增加权利要求6所述的蛋白 质的表达量而使酵母的总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力降低。
11、 酒精饮料的制造方法，其包括培养权利要求8 10中任一项所述 的酵母。
12、 如权利要求ll所述的酒精饮料的制造方法，其中，酿造的酒精饮 料是麦芽饮料。
13、 如权利要求ll所述的酒精饮料的制造方法，其中，酿造的酒精饮 料是葡萄酒。
14、 酒精饮料，其为采用权利要求11 13中任一项所述的方法制造的 酒精饮料。
15、 酵母的评价方法，其为使用根据具有序列号1的核苷酸序列的二 羟酸脱水酶基因的核苷酸序列设计的引物或探针，对被测酵母的总连二酮 生产能力或总双乙酰生产能力进行评价的方法。
16、 评价被测酵母的总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力的方法， 其包括培养被测酵母；以及测定具有序列号1的核苷酸序列的二羟酸脱 水酶基因的表达量。
17、 酵母的选择方法，其包括培养被测酵母；对权利要求6所述的 蛋白质进行定量或测定具有序列号1的核苷酸序列的二羟酸脱水酶基因的表达量；以及选择所述蛋白质的量或所述基因表达量与总连二酮或总双乙 酰的目标生产能力相应的被测酵母。
18、 如权利要求17所述的酵母的选择方法，其包括培养标准酵母和 被测酵母；测定具有序列号1的核苷酸序列的二羟酸脱水酶基因在各酵母 中的表达量；以及选择其中该基因的表达高于标准酵母的被测酵母。
19、 如权利要求17所述的酵母的选择方法，其包括培养标准酵母和 被测酵母；对各酵母中的权利要求6所述的蛋白质进行定量；以及选择其 中该蛋白质的量多于标准酵母的被测酵母。
20、 酒精饮料的制造方法，其包括使用权利要求8 10中任一项所 述的酵母或使用根据权利要求17 19任一项所述的方法选择的酵母中的任 一种酵母，进行制造酒精饮料的发酵；以及使总连二酮生产量或总双乙酰 生产量降低。
全文摘要
本发明涉及二羟酸脱水酶基因及其用途，特别涉及制造香味良好的酒精饮料的酿造酵母、使用该酵母制造的酒精饮料、以及所述饮料的制造方法等。更具体地说，本发明涉及通过提高酵母的编码二羟酸脱水酶IIv3p的ILV3基因、特别是啤酒酵母的特征基因nonScILV3的表达量，使成为产品的异味的二酮类、特别是双乙酰的生产量降低的酵母，以及涉及使用该酵母的酒精饮料的制造方法等。
文档编号C07K14/435GK101238147SQ200680029069
公开日2008年8月6日 申请日期2006年8月11日 优先权日2005年8月12日
发明者下永朋子, 中尾嘉宏, 儿玉由纪子 申请人:三得利株式会社