一株高产l-氨基酸氧化酶菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术、有机合成领域，具体涉及一株高产L-氨基酸氧化酶菌株、 利用该菌株产L-氨基酸氧化酶的方法及该酶在催化合成5-氨基戊酸中的应用。
【背景技术】
[0002] 5-氨基戊酸，英文名称为5"-办?ifloraJericacit/，作为常用的生化试剂，其性能优 异，使用范围广。作为合成尼龙5、戊二酸、5-羟基戊酸、1，5-戊二醇及其衍生物、戊二酸酐 的重要前体，其中戊二酸酐是化工、生物制药中间体，所以其在纺织工业、机械工业、精细化 学品合成以及医药领域有着广阔的前景。传统制备5-氨基戊酸的方法，均采用化学法合 成，一般采用戊内酰胺或戊内酰胺聚合物（尼龙6的熔块、废丝、废弃织物、渔网等）水解后 精制而得。这些方法反应条件苛刻，能耗大，设备腐蚀大，效率低，分离复杂。因此开发条件 温和、转化高效的酶催化过程合成高品质的5-氨基戊酸，对于工业产业来说具有重要的现 实意义。随着生物技术的发展，特别是合成生物学与蛋白质工程研究的迅猛发展，各种酶能 够大量低价地获得，使得酶催化作为新兴的绿色合成技术越来越倍受重视。
[0003] L-氨基酸氧化酶，存在于肾脏、肝脏、蛇毒、真菌、放线菌、细菌等中，作为一种广泛 使用直接氧化L-氨基酸的需氧性脱氢酶之一，可用于催化水解、酯化、转酯化等多种类型 的反应，在日用化学品，医药合成，食品加工等领域广泛使用。用L-氨基酸氧化酶催化合成 6-氨基己酸，能够使氧化过程在相对温和的条件下高效地合成，避免了高温、高压、强酸催 化过程，同时还能在不使用或很少使用诱导剂的情况下，实现高效的表达。整个合成过程安 全高效，产品质量稳定。更为重要的是，酶法所生产的氨基己酸产品，不含有毒有害的强酸、 重金属等成分，产生生物安全性好，可以用于化妆品、医药等高附加值的领域。1944年首先 由ZeWer和to描述L-氨基酸氧化酶主要是二聚体黄素蛋白与一些单体类型，为L-氨 基酸氧化酶的研究奠定了基础。2003年首先由和及报告了红球菌L-氨基酸 氧化酶的异源表达，L-氨基酸氧化酶的基因通过基因工程途径修饰，并导入了大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌和变青链霉菌表达，获得了 一种具有氧化2, 6二氨基己酸(赖氨酸)生产的菌株。 目前，L-氨基酸氧化酶可以运用到工业、农业、医药、食品、生活等各个方面。
【发明内容】
[0004] 本发明第一目的是提供了一种能够简单、安全生产L-氨基酸氧化酶的菌株。
[0005] 为了实现本发明的第一目的，本发明采用的技术方案如下： 一株产L-氨基酸氧化酶的菌株，其特征在于，其分类命名为大肠杆菌MZ505(fccAericAiacoBMZ505)，已于2015年1月18号保藏于中国典型培养物保藏中心，其保 藏编号为：CCTCCNO:M2015042。上述的产L-氨基酸氧化酶的菌株筛选方法，具体包括如 下步骤： (1)菌悬液制备 大肠杆菌BL21 (pET/P-aspC)与添加氯化锂的无菌水混合制成菌悬液，细菌浓度约为 lOY/mL; (2) 紫外-氯化锂复合诱变 将步骤（1)的菌悬液转入含有磁力转子的无菌空平板中，在100-150rpm搅拌速度下， 进行紫外照射诱变，后取菌悬液涂布于添加氯化锂的完全培养基中，37°C下避光倒置培养 Id得到的菌株分别点印于基本培养基、筛选培养基中，培养Id后，挑选仅筛选培养基中生 长良好而在基本培养基中不生长的菌株，其菌落形态为圆形边缘整齐，表面光滑，半透明， 小凸起； (3) 低能离子注入诱变 将步骤（2)中培养后的菌株用无菌水洗涤，菌悬液涂布于无菌空平皿上，制成单层菌 液，吹干后，注入氮离子，后洗脱、涂布到完全培养基上。37 °C下避光倒置培养Id得到的 菌株分别点印于筛选培养基中，培养Id后，挑选生长良好的菌株，其菌落形态为圆形边缘 整齐，表面光滑，半透明，小凸起； (4) 初筛 将步骤（3)培养得到的单菌落在LB斜面培养基上培养16h，活化的菌株在种子培养基 搅拌培养8-12h后按一定接种量转入发酵培养基中，发酵48h后通过细胞破碎检测发酵 液中L-氨基酸氧化酶的含量，初筛出L-苯丙氨酸含量大的菌落； (5) 复筛 将步骤（4)初筛得到的单菌落接种经斜面活化、种子培养后，按一定接种量分别接种至 5L发酵罐中，初始发酵液体积为1.5L，搅拌发酵72h;通过细胞破碎检测发酵液中L-氨 基酸氧化酶的含量，筛选出L-氨基酸氧化酶产量高的菌落； (6 )对步骤5所得的菌株进行扩培，并进行保藏，命名为大肠杆菌MZ505。
[0006] 本发明的第二目的是提供一种利用本发明的菌株产L-氨基酸氧化酶的方法，其 包括如下步骤： (1) 斜面培养 将大肠杆菌MZ505接种到LB斜面培养基中，在37 °C下培养12h; (2) 活化种子培养 按步骤（1)所得的菌株接种量体积比0. 1%_〇. 4%，Kana抗性按体积比0. 2%接种于种子 培养基中，37 °C、200rpm培养12h; (3 )摇瓶培养 将步骤（2)培养后的活化种子液接入摇瓶培养基，培养条件如下：温度37 °C、搅拌速 度200rpm、接种量是体积比1%、Kana抗性按体积比0. 2% ;菌株细胞量生长至0. 246g/L 时，加入IPTG进行诱导表达。
[0007] (4)超声破碎 将步骤（3)培养好的菌液，离心、洗脱、重悬、超声，得到L-氨基酸氧化酶粗酶液。
[0008] 优选得，所述的步骤（3)中的诱导条件优化为，最适温度为20 °C。
[0009] 优选得，所述的步骤（3)中的诱导条件优化为，最适诱导时间为9h。
[0010] 优选得，所述的步骤（3)中的诱导条件优化为，最适诱导剂量为0.6mM。
[0011] 优选得，所述的步骤（3)中的诱导条件优化为，最适诱导细胞量为0. 246g/L。
[0012] 本发明的第三个目的是提供本发明所得的粗酶液在制备5-氨基戊酸中的应用。
[0013] 优选得，所述的应用以2, 6-二氨基己酸(赖氨酸）为底物，加入一定量的粗酶液在 温度37°C、搅拌速度200rpm条件下反应24h，反应完毕得到5-氨基戊酸。 本发明公开了一种利用L-氨基酸氧化酶采用分子发酵酶催化法相结合催化合成5-氨 基戊酸的制备方法。该方法利用L-氨基酸氧化酶替代了传统化学法合成的过程，克服了 传统化学催化过程中所存在的反应温度高，大量添加催化剂，产品色值高，质量波动大的缺 点，过程节能，环保，产品质量稳定，转化率高，生物安全性好，有利于工业实施。
【附图说明】
[0014] 图1为大肠杆菌MZ505筛选流程。
[0015] 本发明所述的生物材料，其特征在于，其分类命名为大肠杆菌MZ505(i&cAe>ricAia cohMZ505)，已于2015年1月18号保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址： 中国?武汉?武汉大学)，其保藏编号为=CCTCCNO:M2015042。
【具体实施方式】
[0016] 下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
[0017] 本实施例采用菌株为大肠杆菌BL21(pET/P-aspC)，（宫长斌等，过程工程学报， 2007年第7卷第3期，254-258)。该出发菌株系申请人拥有的在先公开文献公开的菌株，由 申请人自行保藏，申请人在此声明从本专利申请日起二十年内免费发送该出发菌株。
[0018] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所 述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。
[0019] 实施例1 本实施例中： 1) 完全培养基组成为葡萄糖2g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl5g/L，pH7.0， 固体培养基加琼脂15g/L; 2) 基本培养基组成为葡萄糖20g/L、柠檬酸钠5g/L、K2HP04 7g/L、KH2P04 7g/L、 MgSO4 0.Ig/L、（NH4)2SO4 2g/L，pH7. 0,固体培养基加琼脂 15g/L; 3) 筛选培养基为在基本培养基中添加40yg/mL赖氨酸； 4)LB斜面培养基/种子培养基为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl5g/L，pH7.0,固 体培养基加琼脂15g/L; 5) 发酵培养基为蛋白胨 50g/L、（NH4)2SO4 5 ? 5g/L、NaH2PO4 ? 2H20 4. 2g/L、 K2HPO4 ? 3H20 8. 7g/L、（NH4)2SO4 5. 5g/L、MgSO4 ? 7H20