甲羟戊酸的生产菌以及生产甲羟戊酸的方法
【技术领域】
[0001] 本文涉及甲羟戊酸的生产菌以及利用甲羟戊酸生产菌生产甲羟戊酸的方法。
【背景技术】
[0002]甲轻戊酸（Mevalonaic Acid)，全称3, 5-二羟基-3-甲基戊酸，分子式为C6H1204, 常温下呈油状，易溶于水和极性有机溶剂，在溶液中易内酯化形成甲羟戊酸内酯（参见图 1)。甲羟戊酸的3位碳具有手性，生物体只能利用甲羟戊酸的3R异构体。
[0003] 甲羟戊酸在生物体内普遍存在，它是细胞生物化学中的关键中间体，是许多生物 活性脂的前体，如胆固醇、留类激素、胆酸、泛醌和长醇等。它还是合成萜类的重要前体物 质，萜类参与形成酯类、防御毒剂、生长激素等，在生物体内起着极其重要的调节作用。其中 很多单萜化合物都是重要的药物或香料。有研究表明，在植物培养过程中，在营养液中添加 适量的甲羟戊酸，可以极大地提高一些天然产物的产量。
[0004] 甲羟戊酸主要以甲羟戊酸内酯的形式供应出售。甲羟戊酸内酯被广泛应用于化妆 品、食品等领域。它能够帮助恢复受损角质层，具有非常好的抗衰老、抗皱功能，其特有的亲 水结构能形成网状交联，锁住水分，保持肤感滑爽，保湿效果明显，因此是各种高级化妆品、 润肤剂、精华液中重要的添加成分。
[0005] 甲羟戊酸作为中间产物，还能继续合成很多重要的产品：合成异戊二烯，用 于制作异戊橡胶；合成青蒿素，用于治疗疟疾，以改善人类健康水平；合成胡萝卜素和 番茄红素，用于制作抗癌、抗心血管疾病的高级保健品；近期有研究表明，甲羟戊酸还 可合成没药烧，作为很有前景的生物柴油替代品（http://www. sciencedaily. com/ releases/2011/09/110927134254. htm?utm_source=feedburner&utm_medium=email&utm_ campaign=Feed°/〇3A+sciencedaily%2Fpl ants_animals+°/〇28ScienceDaily%3A+Plants+%26 +Animals+News%29)〇
[0006] 由于甲羟戊酸具有很高的价值，因此国内外一直有机构在研究成本更经济的甲羟 戊酸生产方法。传统的生产方法主要是化学合成法。化学合成法以4-氯-2-丁酮为原料， 需要经过酯化、Reformatsky反应、水解和环化等步骤，最终得到甲羟戊酸内酯产品。但是 化学法存在如下问题：化学法中使用的原料难以获得，化学合成难度大、过程复杂、能耗高、 得率低，并且最终得到的产物为消旋体（等比例R构型和S构型的混合物），因此要得到纯 净的R构型产品还需要经过复杂的分离过程。
[0007]有机构研究开发出酶法合成（Mizuguchi Eisaku，e. a.，Enzyme-catalyzed synthesis of (S)-chromanethanol and(R)-mevalonolactone. Synlett, 1996. 8:p. 743 ~ 744)，还有生物催化和化学催化相结合的方法（Orru Romano VA，e. a.，An efficient large-scale synthesis of R-mevalonolactone using simple biological and chemical catalysis. Synthesis，1998. 9:p. 1259~1263.)，但是因为流程复杂，产品收率低等原因 未被大规模运用。
[0008] 近年来，日本Adeka株式会社新开发出的生物法合成甲羟戊酸内酯的技术（糖基 生物合成法），生产得到均一的R构型产品，现已经投产销售，投产之后显示出了良好的经 济效益。2009年Adeka株式会社生产的R型甲羟戊酸内酯产品开始投向市场的时候，每公 斤的价格为14. 3万元，而当时市场上出售的外消旋混合物的价格还维持在每公斤28. 7万 元，由此可见利用微生物生产天然型甲羟戊酸内酯巨大的优势。
[0009] 日本Adeka株式会社研发出来的生物法是以生物质为原料，由经过改造的酵母菌 发酵生产，得到R型甲羟戊酸内酯。相比于传统的化学法，生物法具有反应条件温和、原料 利用率高、产品构型均一（R构型）等优点。通过高密度培养，糖基生物法的产量可达50g/ L(http://tec. k8008. com/html/2011/05/98731. html)。
[0010] 虽然以生物质为原料的生物合成法相比于传统的化学法有很大的优势，但如果进 行大规模生产，原料的获得会存在问题。在当前全球粮食紧缺的大环境下，将生物质用于工 业生产，会不可避免地与人争粮，很可能因为政策因素的限制，无法保证原料的持续供应； 同时，如果甲羟戊酸需求增加带动生物质价格的上涨，对于长期生产开发利用甲羟戊酸也 是不利的。
[0011] 因此，在本领域中非常期望可以开发出不以生物质为原料的生产甲羟戊酸的方 法。
[0012] 针对以上问题，本发明人开发了以甲醇作为原料生产甲羟戊酸的甲醇基生物合成 法。
[0013] 首先，我国甲醇产业产能过剩，甲醇便宜易得。近年来，我国甲醇产能保持快速增 长，目前应达到 4654 万吨（http://www. askci. com/news/201202/28/161652_53. shtml)， 2012年有550万吨以上的新建的甲醇项目投产运行，总产能将达到5200多万吨，但是甲 醇的年消耗量仅为 2200 万吨左右（http://www. coalstudy. com/cn/Article/zxpd/dlzx/ hghf/201204/17162. html)。由于严重的供大于求，以及进口甲醇的低价冲击，导致甲醇的 价格持续下降，目前价格为2800元/吨，装置开工率仅为56%。因此，甲醇产业亟待寻求下 游产品的开发。其次，甲醇基生物合成法可以有效避免糖基生物合成法在原料来源上存在 的诸多问题。生物质原料的供应和价格会因为季节、气候的变化呈现较大的波动，而甲醇作 为有机化工的基础原料，能够实现一年四季连续稳定供应。同时，生物质原料在工业领域 的应用会受到国家政策的限制，而运用甲醇为原料进行工业生产则会得到扶持和保护，甲 羟戊酸这一高附加值的产品可以很好地延伸煤制甲醇这一产业链。再次，甲醇基生物合成 法在生产工艺上也有诸多优势。由于原料甲醇具有生物毒性，在发酵生产的前期，可降低 除菌操作的成本，在运行过程中，也能大大地降低了培养基染菌的风险，保证产品质量，减 少倒罐、停产的发生（郝常明，赵建锋，黄雪菊.生物发酵染菌问题的探讨.医药工程设 计.02 (2007) : 11-15.)，这对于工业发酵生产来说具有极大的经济价值。在后期的分离环节 中，由于培养细菌所使用的培养基是加入甲醇的无机盐溶液，相比于成分复杂的糖基培养 基，分离成本可以大大降低。
[0014] 甲基生物合成法生产甲羟戊酸很好地将生物化工过程依托于传统有机化工产业 之上，对于该生物方法的应用和发展具有重要意义。
【发明内容】
[0015] 鉴于上述问题，本发明的发明人在属于甲基杆菌属（Methylobacterium)的细菌 中外源引入甲羟戊酸上游途径并进行重构，构建了由甲醇生产甲羟戊酸的细菌，并开发了 利用该细菌生产甲羟戊酸的方法。从而实现利用价格低廉、供应充足的原料甲醇，通过微生 物代谢，直接合成纯净的R型甲羟戊酸产品。
[0016] 本发明提供了一种以甲醇为原料生产甲羟戊酸的细菌及方法。具体地本文提供 了：
[0017] 1.一种用于以甲醇为原料生产甲羟戊酸的细菌，其中所述细菌属于甲基杆菌属 (Methylobacterium)，并且所述细菌经过修饰表达HMG-CoA合成酶（HMGS)和HMG-CoA还原 酶（HMGR)。
[0018] 2.根据项1所述的细菌，其中所述细菌经进一步修饰该细菌的乙酰乙酰CoA硫解 酶（phaA酶）的活性得到增强。
[0019] 3.根据项1或2所述的细菌，其中所述细菌中的phaC基因被敲除。
[0020] 4.根据项1~3中任一项所述的细菌，其中所述细菌具有丝氨酸循环途径。
[0021] 5.根据项1~4中任一项所述的细菌，其中所述细菌选自扭脱甲基杆 菌（Methylobacterium extorquens)或罗得西亚甲基杆菌（Methylobacterium rhodesianum)〇
[0022] 6.根据项1~5中任一项所述的细菌，其中所述HMG-CoA合成酶的氨基酸序列是 选自下述（a)~（c)中的任一种：
[0023] (a)具有SEQ ID NO: 1所示的序列，
[0024] 或者由在SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代 和/或添加而得到的氨基酸序列组成，并且具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基 戊二酸单酰辅酶A的活性的序列；
[0025] (b)具有SEQIDN0:2所示的序列，
[0026] 或者由在SEQIDN0:2所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代 和/或添加而得到的氨基酸序列组成，并且具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基 戊二酸单酰辅酶A的活性的序列；
[0027] (c)具有SEQIDN0:3所示的序列，
[0028] 或者由在SEQIDN0:3所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代 和/或添加而得到的氨基酸序列组成，并且具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基 戊二酸单酰辅酶A的活性的序列。
[0029] 7.根据项1~6中任一项所述的细菌，其中所述HMG-CoA还原酶的氨基酸序列是 选自下述⑷~（f)中的任一种：
[0030] (d)具有SEQ ID N0:4所示的序列，
[0031] 或者由在SEQIDN0:4所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代 和/或添加而得到的氨基酸序列组成，并且具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化 为甲羟戊酸的活性的序列；
[0032] (e)具有SEQIDN0:5所示的序列，
[0033] 或者由在SEQIDN0:5所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代 和/或添加而得到的氨基酸序列组成，并且具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化 为甲羟戊酸的活性的序列；
[0034] (f)具有SEQIDNO:6所示的序列，
[0035] 或者由在SEQIDN0:6所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代 和/或添加而得到的氨基酸序列组成，并且具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化 为甲羟戊酸的活性的序列。
[0036] 8.根据项2~7中任一项所述的细菌，其中所述乙酰乙酰CoA硫解酶的氨基酸序 列为SEQ ID N0:7所示的序列；
[0037] 或者为由在SEQ ID N0:7所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取 代和/或添加而得到的氨基酸序列组成，并且具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的 活性的序列；
[0038] 或者由与SEQ ID N0:7所示的序列具有75%-致性的氨基酸序列组成，并且具有 将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的序列。
[0039] 9.根据项3~7中任一项所述的细菌，其中，所述phaC基因的DNA序列为SEQ ID No:8所示的序列；
[0040] 或者为由在SEQ ID N0:8所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取 代和/或添加而得到的氨基酸序列组成，并且敲出该序列阻断了 PHB途径。
[0041] 10.根据项1~9中任一项所述的细菌，其中编码所述HMG-CoA合成酶的DNA序列 选自下述（a)~（f)中的任一种：
[0042] (a) SEQ ID No: 9 所示的 DNA 序列，
[0043] 或者在SEQIDN0:9所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或 添加而得到的DNA序列，且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基 戊二酸单酰辅酶A的活性的蛋白质，
[0044] (b) SEQ ID No: 177 所示的 DNA 序列，
[0045] 或者在SEQ ID NO: 17所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或 添加而得到的DNA序列，且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基 戊二酸单酰辅酶A的活性的蛋白质，
[0046] (c)SEQ ID No: 10 所示的 DNA 序列，
[0047] 或者在SEQ ID NO: 10所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代