一种重组菌株与制备碱性β-甘露聚糖酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体地，涉及一种重组菌株以及利用该重组菌株制备 碱性甘露聚糖酶的方法。
【背景技术】
[0002] 0 -甘露聚糖酶（0 -mannanase，EC3. 2. 1. 78)是一种半纤维素酶，可以水解甘露 聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖等植物多糖(参见Tipdon，R. S. et al. :Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry，32:299-316,Academic Press，New York，1976.)。甘露聚糖是自然界中存在的一种较为丰富的半纤维素资源，数量 仅次于纤维素。豆科植物种子、针叶树木材、绿色咖啡豆等都含有大量的甘露聚糖，一些植 物胶，如田青胶、角豆胶、魔芋精粉等几乎完全是由半乳糖或葡萄糖与甘露糖组成的甘露聚 糖。利用甘露聚糖酶对上述植物材料进行深加工和综合利用具有很大的应用潜力。国 内外现主要用于造纸工业纸浆的漂白、油井的破胶、降解植物胶生产低聚糖用作双歧杆菌 促生长因子，防病抗衰老的保健食品以及饲料工业中作为抗营养因子。
[0003] P_甘露聚糖酶按其最适pH值的不同有酸性、中性、碱性之分，其中碱性0-甘露 聚糖酶的研究相对较晚，发现主要由嗜碱芽孢杆菌（alkaliphilieBacillus)产生，某些地 衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis)也产生碱性甘露聚糖酶，如杨文博等报道了一 株地衣芽孢杆菌NK-27,其最适pH值为9. 0。一般情况下枯草芽孢杆菌，放线菌等产生中性 3 -甘露聚糖酶，而霉菌产生酸性0 -甘露聚糖酶。第一个碱性0 -甘露聚糖酶由Akino等 发现。马延和等于1991报道了嗜碱芽孢杆菌N16-5的三个胞外碱性0 -甘露聚糖酶的纯化 及酶学性质，并于2004年报道了其中一种嗜碱甘露聚糖酶的基因序列。Takeda等于2004 年发现了芽孢杆菌属的一个菌株JAMB-602产碱性0 -甘露聚糖酶，此酶属于GH家族5,最 适pH为9。目前所发现的嗜碱甘露聚糖酶的最适pH值最高为10,由Takeda等于2004年 报道。
[0004] 碱性甘露聚糖酶不仅可以生产用作双歧杆菌促生长因子的低聚糖，而且在需 碱性环境的纸浆漂白等工业方面具有广泛的应用前景。但到目前为止，碱性甘露聚糖 酶的制备仍旧是限制其工业应用的瓶颈，前人的报道中无论是使用碱性0 -甘露聚糖酶的 原产菌株还是使用重组菌株生产，其产量都比较低，或者需要发酵较长的时间。如马延和报 道了由嗜碱芽孢杆菌N16-5菌株经培养优化后，产量达到500U/ml (参见CN1266096A)。朱 泰承等用毕赤酵母表达来自嗜碱芽孢杆菌N16-5基因，发酵120小时左右碱性0 -甘露聚 糖酶的酶含量达6000U/ml (参见CN102433267A)。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能够较高水平的表达碱性P-甘 露聚糖酶的重组菌株以及利用该菌株制备碱性3 _甘露聚糖酶的方法。
[0006] 为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种重组菌株，该重组菌株为含有编 码碱性甘露聚糖酶的基因的重组大肠杆菌，且所述基因的碱基序列如SEQ ID N0:1所 /_J、i〇
[0007] 第二方面，本发明提供了一种制备碱性甘露聚糖酶的方法，该方法包括将第 一方面所述的重组菌株接种至液体发酵培养基中进行发酵，获得含有碱性3 -甘露聚糖酶 的发酵液。
[0008] 通过上述技术方案，本发明的重组菌株能够高水平地表达碱性3 -甘露聚糖酶， 所需发酵的时间较短。采用本发明的方法制备碱性甘露聚糖酶，最终得到的发酵液中 的酶含量可达6000U/ml。
[0009] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0010] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0011] 图1是发酵液中酶含量和蛋白浓度随发酵时间的变化曲线。
【具体实施方式】
[0012] 以下结合附图对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0013] 在本发明中，在未作相反说明的情况下，"酶含量"用每ml发酵液中含有的酶活力 单位（U)数来表示，单位为U/ml，且在37°C、pH值为9. 0的条件下，每分钟降解甘露聚糖释 放1 U mol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U ;"溶氧量"用溶氧电极测得的结果表 示，且定义发酵开始时的溶氧量为100%。
[0014] 本发明提供了一种重组菌株，该重组菌株为含有编码碱性甘露聚糖酶的基因 的重组大肠杆菌，且所述基因的碱基序列如SEQ ID N0:1所示。本发明的重组菌株可以采 用常规的基因工程技术获得，例如，获取碱基序列如SEQ ID NO: 1所示的基因，构建含有碱 基序列如SEQ ID NO: 1所示的基因的表达载体，再将该表达载体转入大肠杆菌中即可获得。 可以从嗜碱芽孢杆菌N16-5的总DNA中扩增获得碱基序列如SEQ ID NO: 1所示的基因，且 可以采用"上游引物序列如SEQ ID N0:2所示且下游引物序列如SEQ ID N0:3所示"的引 物进行扩增。
[0015] agttcaggcttttatgttgatggcaatacgttatatgacgcaaacgggcaaccatttgtcatgaaaggc attaaccatggacatgcttggtataaagacaccgcttcaacagctattcctgccattgcagagcaaggcgcgaacac gatacgtattgttttatcagatggcggtcaatgggaaaaagacgacattgacaccgttcgtgaagttattgagcttg cggagcaaaataaaatggtggctgtcgttgaagtteatgatgccacgggccgtgattcacgcagtgatttagategg gcagtcgattattggatagagatgaaagatgcacttatcggcaaagaggatactgtcattattaacattgcaaacga atggtatggcagttgggatggcgccgcttgggctgatggctacattgatgtcattccgaagcttcgcgatgccggct taacacacaccttaatggttgatgcagcaggatgggggcaatatccgcaatctatteatgattacggacaagatgtg tttaatgcagatccgttaaaaaatacgatattctccatccatatgtatgagtatgctggtggtgatgctaacactgt tagatcaaatattgatagagtcatagatcaagaccttgctctcgtaataggtgagttcggtcatagacacactgatg gcgatgttgatgaagatacaatccttagttattctgaagaaactggcacaggatggctcgcttggtcttggaaaggc aacagtgccgaatgggattatttagacctttcagaagattgggctggtaaccatttaactgattggggaaataggat tgtccacggggcaaatggcttgcaggaaacctccaaaccatccaccgtatttacagatgataacggtggtgcccctg aaccgccaactactactaccttgtatgactttgaaggaagcacacaagggtggcatggaagcaacgtgatgggtggc ccttggtccgtaacagaatggggtgcgtcaggcaactactctttaaagggcgatgtcaatttaagctcaaattcttc acatgaactgtatagtgaacaaagtcgtaatctacacggatactctcagctaaatgcaaccgttcgccatgccaatt ggggaaatcccggtaatggcatgaatgcaagactttacgtgaaaacgggctctgattatacatggtatagcggtcct tttacacgtatcaatagctccaactcaggtacaacgttatcttttgatttaaacaacatcgaaaatagtcatcatgt tagggaaataggtgtgcaattttcagctgcagataatagcagcggtcaaactgctctatacgttgataatgttactt taaga (SEQ ID N0:1)
[0016] 根据本发明，所述重组菌株可以为各种常规的用于构建基因工程菌的大肠杆菌， 优选地，所述重组菌株的出发菌株为大肠杆菌BW25113 (即阿拉伯糖合成缺陷菌株，可以通 过商购获得)。
[0017] 根据本发明，优选地，所述重组菌株含有表达载体，所述表达载体为在pBAD载体 (如pBAD-HisB载体）的Ncol酶切位点和Xhol酶切位点之间插入碱基序列如SEQ ID NO: 1 所示的基因而得到的表达载体。即，编码碱性甘露聚糖酶的基因存在于表达载体上，能 够自主复制和表达。所述表达载体中的启动子优选为阿拉伯糖诱导型启动子。
[0018] 本发明提供的制备碱性甘露聚糖酶的方法包括将上述重组菌株接种至液体 发酵培养基中进行发酵，获得含有碱性3 _甘露聚糖酶的发酵液。
[0019] 根据本发明，可以采用常规方式进行发酵，优选情况下，所述发酵的方式为：在 35-38 °C下，将所述重组菌株培养至发酵液的0D_值达45-55,然后，在28-32 °C下，往发酵 液中添加阿拉伯糖，继续发酵8-35h (优选10-30h)。发酵过程(包括继续发酵）中，可以控 制通气量为1.5-2. 5vvm。其中，0D_值是指发酵液在600nm波长处的吸光值，能够反应菌 株在发酵液中的浓度（即菌浓)。
[0020] 其中，所述液体发酵培养基可以为液体LB培养基，优选情况下，所述液体发酵培 养基的配方为：8_10g/L的KH 2P04,3-5g/L的（NH4)2HP04,4-6g/L的酵母提取物。液体发酵 培养基的pH值可以为6. 6-6. 7。
[0021] 本发明中，在发酵液的〇D_值达45-55之前，如果发酵液总的葡萄糖耗尽，可以适 当地流加葡萄糖，以促使发酵液的〇D_值达到45-55。对葡萄糖的流加方式没有特别的要 求，例如，可以每分钟流加0. 6-1. 2g/L发酵液的葡萄糖。
[0022] 根据本发明，为了更好地维持重组菌株的生长以使其更佳地表达碱性0 -甘露聚