糖酶，优选地，在继续发酵过程中，控制发酵体系中的溶氧量为30-50%。可以通过调节通气 量或搅拌速度控制溶氧量。
[0023] 本发明中，对所述阿拉伯糖的添加量没有特别的要求，优选情况下，所述阿拉伯糖 的添加量为1. 5-2. 5g/L发酵液。在添加阿拉伯糖后，可以限制地补加葡萄糖以维持菌株的 生长，例如每分钟补加〇. 1-0. 3g/L发酵液的葡萄糖。
[0024] 本发明中，在发酵之前，还可以对重组菌株进行种子培养，对种子培养的方式没有 特别的限制，例如，可以将重组菌株接种至LB培养基中，于36-38°C下培养12-16h，从而获 得〇D_值为1. 5-2的种子液。
[0025] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，溶氧量采用溶氧 量电极（Mettler)进行测定；嗜碱芽孢杆菌N16-5总DNA采用细菌DNA提取试剂盒(0MEGA-D3350)提取得到；0D_值采用722N可见光分光光度计测得；葡萄糖的含量采用 HPLC法测得。
[0026] 实施例1
[0027] 本实施例用来说明本发明重组菌株的制备。
[0028] ( 1)碱性3 _甘露聚糖酶基因的克隆
[0029]引物1(上游）：5,-ACCATGGTTCAGGCTTTTATG-3'（SEQIDN0:2)
[0030]引物 2 (下游）：5'-CGAGCTCTTAACGCAGCGTAACGTT-3'（SEQIDN0:3)。
[0031] 以嗜碱芽孢杆菌N16-5(保藏号为CGMCC N0.0 369,已在CN1266096A中公布)总DNA 为模板，加入引物1、引物2、HiFi Taq DNA聚合酶及dNTP混合物，进行降落PCR(touchdown PCR)，反应条件如下：94°C 5min ;94°C 30s，60-50°C 30s，72°C 90s，每个循环降 1°C，共 10 个 循环；94°C 30s，55°C 30s，72°C 90s，共 25 个循环。
[0032] PCR扩增得到1400bp的片段，命名为manA，用Omega纯化试剂盒（型号为D6493) 进行纯化。
[0033] (2)碱性甘露聚糖酶表达载体和重组菌株的构建
[0034]将pBAD-HisB载体(购自Invitrogen公司）用Ncol/Xhol双酶切，得到小片段， 将小片段与同样用Ncol/Xhol消化过的manA连接，即得到基于pBAD-HisB的表达载体 pBAD-manA。将表达载体pBAD-manA委托给北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，测序 结果表明PCR扩增得到的片段具有SEQIDN0:1所示的碱基序列。
[0035] 用表达载体pBAD-manA电击转化大肠杆菌BW25113 (购自CGSC，CGSC#: 7636)后涂 布于含有50 y g/mL氨苄青霉素的LB平板上，37 °C培养15h，即得含有manA的表达载体的重 组菌株 BW25113-pBAD-manA。
[0036] 实施例2
[0037] 本实施例用来说明利用本发明的重组菌株高水平表达碱性P-甘露聚糖酶的方 法。
[0038] 种子培养：将重组菌株BW25113-pBAD-manA接种于25毫升LB培养基中，37°C下培 养15h，获得0D 6(KI值为2. 0的种子液。
[0039] 发酵：发酵罐中培养基按50% (v/v)的装液量(培养基组成：9g/L的KH2P04,4g/L 的（NH 4)2HP04, 5g/L的酵母提取物，121°C灭菌，灭菌前先进行pH值、溶氧量电极的标定，然 后灭菌30分钟，冷却至37°C)，210rpm (通气量2vvm)，用50% (v/v)的氨水调pH值至6. 7。 接种量为2% (v/v)，在接种前调节溶氧量至100%。当菌体开始生长，耗氧量增加，导致溶氧 量降低，调节搅拌转速，以维持溶氧量在30%以上。
[0040] 当葡萄糖耗尽(溶氧量迅速上升）时，开始流加葡萄糖，葡萄糖的流加量为每分钟 1. 0g/L发酵液。
[0041] 当〇D6QQ值达50 (发酵了 24h)时，停止流加葡萄糖，待温度降至30°C后，加入阿拉 伯糖(添加量为2g/L发酵液)。同时限制地补加葡萄糖(每分钟0. 3g/L发酵液)以维持菌株 的生长，调整通气量或搅拌速度使整个过程的溶氧量控制在30-50%。继续发酵1 lh，酶含量 可达到4000U/ml，继续发酵30h，酶含量可达到6000U/ml，发酵液中的酶含量随发酵时间的 变化参见图1。从图1可以看出，采用本发明的方法制备碱性甘露聚糖酶时，发酵液中 的酶含量较高，特别是在发酵了 55小时左右时，发酵液中的酶含量可高达6500U/ml。
[0042] 实施例3
[0043] 本实施例用来说明利用本发明的重组菌株高水平表达碱性P -甘露聚糖酶的方 法。
[0044] 种子培养：将重组菌株BW25113-pBAD-manA接种于25毫升LB培养基中，37°C下培 养15h，获得0D6(KI值为2. 0的种子液。
[0045] 发酵：发酵罐中培养基按50% (v/v)的装液量(培养基组成：9g/L的KH2P04,4g/L 的（NH 4)2HP04, 5g/L的酵母提取物，121°C灭菌，灭菌前先进行pH值、溶氧量电极的标定，然 后灭菌30分钟，冷却至36°C )，210rpm (通气量2vvm)，用50重量％的氨水调pH值至6. 7。 接种量为2% (v/v)，在接种前调节溶氧量至100%。当菌体开始生长，耗氧量增加，导致溶氧 量降低，调节搅拌转速，以维持溶氧量在30%以上。
[0046] 当葡萄糖耗尽(溶氧量迅速上升）时，开始流加葡萄糖，葡萄糖的流加量为每分钟 〇.6g/L发酵液。
[0047] 当0D6QQ值达45 (发酵了 20h)时，停止流加葡萄糖，待温度降至28°C后，加入阿拉 伯糖(添加量为2. Og/L发酵液)。同时限制地补加葡萄糖(每分钟0. 3g/L发酵液)以维持菌 株的生长，调整通气量或搅拌速度使整个过程的溶氧量控制在30-50%。继续发酵15h，酶含 量可达到4015U/ml。
[0048] 实施例4
[0049] 本实施例用来说明利用本发明的重组菌株高水平表达碱性P -甘露聚糖酶的方 法。
[0050] 种子培养：将重组菌株BW25113-pBAD-manA接种于25毫升LB培养基中，37°C下培 养15h，获得0D6(KI值为2. 0的种子液。
[0051] 发酵：发酵罐中培养基按50% (v/v)的装液量(培养基组成：9g/L的KH2P04,4g/L 的（NH 4)2HP04, 5g/L的酵母提取物，121°C灭菌，灭菌前先进行pH值、溶氧量电极的标定，然 后灭菌30分钟，冷却至38°C )，210rpm (通气量2vvm)，用50重量％的氨水调pH值至6. 7。 接种量为2% (v/v)，在接种前调节溶氧量至100%。当菌体开始生长，耗氧量增加，导致溶氧 量降低，调节搅拌转速，以维持溶氧量在30%以上。
[0052] 当葡萄糖耗尽(溶氧量迅速上升）时，开始流加葡萄糖，葡萄糖的流加量为每分钟 1. 2g/L发酵液。
[0053] 当0D6QQ值达55 (发酵了 22h)时，停止流加葡萄糖，待温度降至32°C后，加入阿拉 伯糖(添加量为2. Og/L发酵液)。同时限制地补加葡萄糖(每分钟0. 3g/L发酵液)以维持菌 株的生长，调整通气量或搅拌速度使整个过程的溶氧量控制在30-50%。继续发酵14h，酶含 量可达到4280U/ml。
[0054] 从以上实施例可以看出，本发明的重组菌株能够较高水平地表达碱性0 -甘露聚 糖酶，且所需发酵时间较短。
[0055] 以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简 单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0056] 另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0057] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1. 一种重组菌株，其特征在于，该重组菌株为含有编码碱性3 -甘露聚糖酶的基因的 重组大肠杆菌，且所述基因的碱基序列如SEQIDNO: 1所示。
2. 根据权利要求1所述的重组菌株，其中，所述重组菌株的出发菌株为大肠杆菌 BW25113。
3. 根据权利要求1或2所述的重组菌株，其中，所述重组菌株含有表达载体，所述表达 载体为在PBAD载体的NcoI酶切位点和XhoI酶切位点之间插入碱基序列如SEQIDNO: 1 所示的基因而得到的表达载体。
4. 根据权利要求3所述的重组菌株，其中，所述表达载体中的启动子为阿拉伯糖诱导 型启动子。
5. -种制备碱性3 _甘露聚糖酶的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求1-4中任 意一项所述的重组菌株接种至液体发酵培养基中进行发酵，获得含有碱性3 -甘露聚糖酶 的发酵液。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中，所述发酵的方式为：在35-38°C下，将所述重组菌 株培养至发酵液的〇D_值达45-55,然后，在28-32°C下，往发酵液中添加阿拉伯糖，继续发 酵8-35h。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中，在继续发酵过程中，控制发酵体系中的溶氧量为 30-50%〇
8. 根据权利要求6所述的方法，其中，所述阿拉伯糖的添加量为I. 5-2. 5g/L发酵液。
【专利摘要】本发明公开了一种重组菌株，该重组菌株为含有编码碱性β-甘露聚糖酶的基因的重组大肠杆菌，且所述基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还公开了一种制备碱性β-甘露聚糖酶的方法，该方法包括将本发明的重组菌株接种至液体发酵培养基中进行发酵，获得含有碱性β-甘露聚糖酶的发酵液。通过上述技术方案，本发明的重组菌株能够高水平地表达碱性β-甘露聚糖酶，所需发酵的时间较短。采用本发明的方法制备碱性β-甘露聚糖酶，最终得到的发酵液中的酶含量可达6000U/ml。
【IPC分类】C12N15-70, C12R1-19, C12N9-42, C12N1-21
【公开号】CN104762243
【申请号】CN201410008696
【发明人】薛燕芬, 陶勇, 马延和
【申请人】中国科学院微生物研究所
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2014年1月8日