的代谢途径如图3所示，甲醇被扭脱甲基杆菌摄取 吸收后，经过q同化作用形成L-丝氨酸，然后进入到丝氨酸循环途径中，代谢合成乙酰 CoA。进一步分析M. extorquens AMI中的代谢流量，在其中心碳代谢中，有22%的碳会 用于合成乙醜 CoA(Peyraud R，Kiefer P, Christen P，Massou S，Portais JC，Vorholt JA.Demonstration of the ethylmalonyl-CoA pathway by using C~13 metabolomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America; 106(12) :4846-51 (2009))，如图 4 所示。
[0108] 在一个实施方式中，本文使用的甲基杆菌属的细菌是罗得西亚甲基杆菌 (Methylobacterium rhodesianum)。罗得西亚甲基杆菌通常在15~30°C条件下生长， 但在10°C下不生长。大部分罗得西亚甲基杆菌在37°C下也可以生长，生长过程不需要生 长因子。罗得西亚甲基杆菌的甲基红和博赫斯-普测试（Voges-Proskauer test)呈阴 性。一些菌种可以降解硝酸盐为亚硝酸盐。该菌对庆大霉素、卡那霉素、四环素类、链霉 素、新霉素敏感，但对萘啶酸、竹桃霉素、螺旋霉素、硫酸粘菌素、青霉素G、多粘菌素B、杆菌 肽具有耐受性。该细菌可以利用甲醇作为碳源（P. N. GREEN, I. J. B0USFIELD，AND D. H00D. Three New Methylobacterium Species:M. rhodesianum sp. nov. M. zatmanii sp. nov. , and M. fujisawaense sp. nov. INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, Jan. 198 8, p. 124-127)。
[0109] 在一个实施方式中，本文使用的甲基杆菌属的细菌是Methylobacterium rhodesianum sp.nov〇
[0110] 本文使用的扭脱甲基杆菌AMI从德国微生物和菌种保藏中心（DSMZ) (http:// www. dsmz. de/)购买，货号为 DSM No. : 1338。罗得西亚甲基杆菌（Methylobacterium rhodesianum sp. nov)从德国微生物和菌种保藏中心（DSMZ) (http://www.dsmz.de/)购 买，货号为 DSM No. :5687。
[0111] 〈生产甲羟戊酸的细菌〉
[0112] 生产甲羟戊酸的代谢途径
[0113] 在本文的生物法生产甲羟戊酸依赖于甲羟戊酸途径。甲羟戊酸途径是生物体内广 泛存在的代谢途径，其代谢产物是生物体内类固醇、萜类等生物分子的重要前体物质。该途 径以乙酰辅酶A为原料，最终合成异戊二烯焦磷酸（IPP)和二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP)，其 中关键的中间代谢产物就是甲羟戊酸，代谢途径如图2所示。
[0114] 由于这个代谢途径较长，因此通常以甲羟戊酸为分界产物，由乙酰CoA代谢合成 甲羟戊酸的代谢流路被称为上游途径，由甲羟戊酸合成IPP和DMAPP的代谢流路被称为下 游途径。
[0115] 在本文涉及的细菌组入了甲羟戊酸的上游途径，从而首次获得能够直接以甲醇 为原料生产甲羟戊酸的细菌。上述上游途径涉及到三个主要的酶：乙酰乙酰CoA硫解酶 (phaA)、HMG-CoA 合成酶（HMGS)和 HMG-CoA 还原酶（HMGR)。
[0116] 乙酰乙酰CoA硫解酶（phaA)是将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的酶（参见 图2)，是上述上游途径三个主要的酶中的第一个酶。在某些属于甲基杆菌属的细菌中能够 通过自身基因的表达，合成phaA酶。有些甲基杆菌属的细菌合成phaA酶的量较少，可以对 这样的细菌进一步进行修饰以使该细菌的PhaA酶的活性增强。
[0117] 在本文的一个实施方式中，通过外源引入表达乙酰乙酰CoA硫解酶的基因，增加 从乙酰辅酶A向乙酰乙酰辅酶A转化的代谢流量。对于phaA酶的来源没有限定，只要是在 弓丨入到甲基杆菌属细菌后可以将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A的酶即可，可以列举来 自Ralstonia eutropha的phaA酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。在本文的一个实 施方式中表达1^181:〇1113 6111：1'(^1^的。1^4酶的0嫩序列如3￡(>)10勵：15所示。
[0118] 在NCBI中对Ralstonia eutropha的phaA酶进行BLAST分析，从结果可以看出，各 物种中phaA基因的相似度很高，均大于75%，具有同源性。在本文的一个实施方式中，phaA 酶由与SEQ ID NO: 7所示的序列具有75% -致性的氨基酸序列组成，并且具有将乙酰辅酶 A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的序列。例如来自Cupriavidus necator、Cupriavidus taiwanensis 的 phaA 酶，来自 Ralstonia pickettii 的 phaA 酶，来自 Burkholderia cenocepacia> Burkholderia kururiensis 的 phaA 酶， 来自 Pseudomonas putida、 Thiomonas intermedia、Limnobacter sp.、Herbaspirillum lusitanum、Methylibium petroleiphilum、Polaromonas naphthalenivorans、Herbaspirillum frisingense、 Massilia niastensis、 Oxalobacteraceae bacterium、 Leptothrix cholodnii、 Janthinobacterium sp. Marseille、Rubrivivax benzoatilyticus 的 phaA 酶。
[0119] 对甲基杆菌属细菌而言，可以优化上述列举的phaA酶的密码子使其更适合在甲 基杆菌属细菌中表达，例如在本文的一个实施方案中，经密码子优化后的表达Ralstonia eutropha 的 phaA 酶的 DNA 序列如 SEQ ID NO: 16 所不。
[0120] 在本文中使用的密码子优化方法例如可以从Kazusa Codon Usage Database数 据库查得扭脱甲基杆菌M. extorquens AMI的密码子使用频率表（http://www. kazusa. or.jp/codon/cgi-bin/showcodon. cgi?species=408&aa=l&style=GCG)〇 然后利用 GeneDesigner软件进行密码子优化。将扭脱甲基杆菌M. extorquens AMI的密码子使 用频率表输入GeneDesigner软件，设临界密码子使用频率为0. 12(Lindberg P，Park S,Melis A,Engineering a platform for photosynthetic isoprene production in cyanobacteria, using Synechocystis as the model organism, Metabolic Engineering, 12, 70-79(2010))。将基因中使用频率低于0. 12的密码子换成高于0. 12的 密码子。尽量保证基因中同义密码子的数量比和M. extorquens AM1中相应密码子使用频 率比相同。优化后，检查是否有构建质粒时需要用到的酶切位点，若有则依据以上原则进 行更换。此外也可以委托公司按照扭脱甲基杆菌M. extorquens AM1的密码子使用频率对 Ralstonia eutropha的phaA酶的DNA序列进行优化，在本文的实施例中委托了 DNA2. 0生 物技术公司对Ralstonia eutropha的phaA酶的DNA进行了优化。针对其他属于甲基杆菌 属的菌株也可以参考扭脱甲基杆菌的密码子使用频率来进行上述优化。
[0121] HMG-CoA合成酶（HMGS)是将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰 辅酶A(HMG-CoA)的酶（参见图2)，是上述上游途径三个主要的酶中的第二个酶。为获得表 达HMGS活性的酶基因，可以在BRENDA蛋白质数据库中查找所有关于HMGS酶的信息，并从 BRENDA蛋白质数据中选取HMGS酶。
[0122] 在本文的一个实施方式中，使用来自德国小蠊（Blattella Germanica)的 HMG-CoA合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示、其DNA序列如SEQ ID NO:9所示。在 另一个实施方式中，针对德国小蠊的HMG-CoA合成酶，为了使其更好在甲基杆菌属细菌中 表达，对其DNA密码子进行了优化，优化可以参考上述方法，经密码子优化后的表达来自德 国小蠊的HMG-CoA合成酶的DNA序列如SEQ ID N0:17所示。
[0123] 在本文的一个实施方式中，使用来自酿酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae)的 腫6-(：(^合成酶，其氨基酸序列如3￡〇10勵:2所示、其0嫩序列如3￡〇10勵 ：10所示。在 另一个实施方式中，针对酿酒酵母的HMG-CoA合成酶，为了使其更好在甲基杆菌属细菌中 表达，对其DNA密码子进行了优化，优化可以参考上述方法，经密码子优化后的表达来自酿 酒酵母的HMG-CoA合成酶的DNA序列如SEQ ID N0:18所示。
[0124] 在本文的一个实施方式中，使用来自粪链球菌（Enterococcus Faecalis)的 HMG-CoA合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，其DNA序列如SEQ ID NO: 11所示。在 另一个实施方式中，针对粪链球菌的HMG-CoA合成酶，为了使其更好在甲基杆菌属细菌中 表达，对其DNA密码子进行了优化，优化可以参考上述方法，经密码子优化后的表达来自粪 链球菌的HMG-CoA合成酶的DNA序列如SEQ ID N0:19所示。
[0125] HMG-CoA还原酶（HMGR)是将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A (HMG-CoA)转化为 甲羟戊酸的酶（参见图2)，是上述上游途径三个主要的酶中的第三个酶。为获得表达HMGR 活性的酶基因，可以在BRENDA蛋白质数据库中查找所有关于HMGR酶的信息，并从BRENDA 蛋白质数据中选取HMGR酶。
[0126] 在本文的一个实施方式中，使用来自克氏锥虫（Trypanosoma cruzi)的HMG-CoA 还原酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示、其DNA序列如SEQ ID NO: 12所示。在另一个 实施方式中，针对克氏锥虫的HMG-CoA还原酶，为了使其更好在甲基杆菌属细菌中表达，对 其DNA密码子进行了优化，优化可以参考上述方法，经密码子优化后的表达来自克氏锥虫 的HMG-CoA还原酶的DNA序列如SEQ ID N0:20所示。
[0127] 在本文的一个实施方式中，使用来自酿酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae)的 HMG-CoA还原酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示、其DNA序列如SEQ ID NO: 13所示。在 另一个实施方式中，针对酿酒酵母的HMG-CoA还原酶，为了使其更好在甲基杆菌属细菌中 表达，对其DNA密码子进行了优化，优化可以参考上述方法，经密码子优化后的表达来自酿 酒酵母的HMG-CoA还原酶的DNA序列如SEQ ID N0:21所示。
[0128] 在本文的一个实施方式中，使用来自粪链球菌（Enterococcus faecalis)的 HMG-CoA还原酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示、其DNA序列如SEQ ID NO: 14所示。在 另一个实施方式中，针对粪链球菌的HMG-CoA还原酶，为了使其更好在甲基杆菌属细菌中 表达，对其DNA密码子进行了优化，优化可以参考上述方法，经密码子优化后的表达来自粪 链球菌的HMG-CoA还原酶的DNA序列如SEQ ID N0:22所示。
[0129] 在本文的一个实施方式中，HMG-CoA合成酶使用来自德国小蠊的HMG-CoA合成 酶，HMG-CoA还原酶使用来自克氏锥虫的HMG-CoA还原酶。在本文的另一个实施方式中， HMG-CoA合成酶使用来自酿酒酵母的HMG-CoA合成酶，HMG-CoA还原酶使用来自酿酒酵母 的HMG-CoA还原酶。在本文的另一个实施方式中，HMG-CoA合成酶使用来自粪链球菌的