可用于分离和／或纯化核酸的试剂的制作方法

可用于分离和／或纯化核酸的试剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于样品材料预处理的特定试剂。使用本发明所述试剂的预处理能够通过统一方法从非常不同的样品材料中分离核酸，尤其是不同的生物处理样品，即使所述核酸仅以小量存在于所述样品材料中。用于预处理的试剂包括至少一种含氨基的化合物作为关键组分。本发明还涉及纯化核酸的方法以及合适的试剂盒，在所述方法中所述样品材料进行相应地预处理。
【专利说明】可用于分离和/或纯化核酸的试剂
[0001]本发明涉及适用于分离和/或纯化核酸的一种试剂以及数种方法和试剂盒，尤其是从包含低浓度待分离靶核酸的样品中分离和/或纯化核酸。
[0002]发明背景
[0003]在现有技术中已知用于分离核酸如DNA和RNA的大量方法，这些方法允许从各种来源的样品材料中分离。这些包括天然来源的样品材料，例如能够从人、动物、植物和环境中得到的复杂样品，以及来自实验室培养的样品材料，如微生物和细胞培养材料。
[0004]核酸分离的基本原理一般与样品材料的类型无关并且能分成一些步骤:样品材料的任选消化，例如采用裂解形式，实际的核酸分离以及任选地，经分离核酸的纯化。从污染的样品组分例如细胞片段和不同于核酸的分子中分离靶标核酸，以及所述核酸的纯化能够分为两种类型的方法，其主要的差别在于分离步骤的数量和分离试剂:
[0005]在经典的方法中，通常首先向样品材料加入含有离液剂的水性缓冲液用于各细胞的裂解、样品的消化，所述缓冲液通常含有胍盐。这之后通常是污染蛋白质的变性和通过与有机提取剂混合来提取核酸，该提取剂通常含有苯酚和/或氯仿。在分离含有核酸的水相与有机相之后，进行例如醇沉淀以从水溶性污染物和苯酚/氯仿组分中纯化核酸。
[0006]此提取方法的缺点是小部分的有机提取物可能总是残留在水相中，从而需要多个耗时的核酸相纯化步骤， 这对于靶标核酸的产率具有负面影响。甚至在多个纯化步骤之后，纯化的核酸样品经常不具有后续应用的必要纯度，尤其是提取剂苯酚的残留物。
[0007]替代性的多步骤方法通过使用固体矿物运载体材料避免了毒性有机溶剂的使用，该固体矿物运载体材料是基于例如二氧化硅化合物。由于核酸与运载体材料的一般主要选择性结合，所述核酸以核酸-运载体材料络合物的形式被分离。此方法中的起始步骤通常也是细胞裂解，除非待分离核酸已经以游离形式存在。为了降解细胞组分和/或其他样品组分，例如蛋白质，通常向样品材料加入含有离液剂的水性缓冲液和蛋白降解酶。然后，在合适的结合条件下，通常在醇存在的情况下，从所用样品材料中释放的核酸与所述运载体材料接触。第一个需要的分离步骤通常是基于运载体材料对核酸的选择性吸收，一般随后是从周围液体中分离所得的核酸-运载体络合物。如果运载体材料功能是例如作为过滤器基质，这能够在过滤过程中几乎同时发生，或者在用于从悬浮液分离所述络合物的后续步骤中几乎同时发生。任选地，这之后是通过一个或多个洗涤步骤纯化结合的核酸。通常，洗脱在之后作为分离过程的最终步骤，其中用水性试剂使结合的核酸从运载体材料上释放。这个步骤是任选的，因为在一些后续的应用中，例如聚合酶链式反应，运载体材料与靶标核酸的结合并不干扰这些应用。由于此多步骤分离方法的优点，如与其他经典方法相比改善的核酸产率和纯度，该方法已得到确立。
[0008]一些基于上述多步骤方法的相似分离方法已经在现有技术中描述(参见例如US5, 234, 809.W093 / 1122UW095 / 01359 和 W02006 / 084753)，其特征在于，例如通过使用不同的运载体材料、从样品和/或不同试剂组合物中分离核酸-运载体材料络合物的不同机制。
[0009]另外，W02009 / 144182 (Fabis等)公开了用于核酸分离和纯化的裂解、结合和洗涤试剂的通用组合物，其包括至少一种离液化合物、至少一种缓冲化合物和至少一种非离子型表面活性剂。这种试剂具有多个优点，因为其在储存中比现有技术已知的含有吐温的制剂更稳定，其用于例如细胞裂解，因为其增加了核酸产率和/或在无混浊下生产核酸洗脱液。
[0010]在现有技术中所有已知的人工或自动方法包括前述例子，显示从各种样品材料中分离和纯化核酸的连续进一步发展，用于增加产率、纯度、速度和/或样品通量。在现有技术中使用的样品材料通常有以下共同处:它们含有需要非常大量分离的核酸和/或它们在其性质和/或组成方面相似，样品材料对于核酸纯化的效率影响很小(如果有)。另外，在现有技术中已知的方法也通常对于一个样品材料或相似样品材料(例如血液和血液产品)优化。然而，在现有技术中已知的方法通常并非设计用于和/或不能从非常不同的样品材料中以高纯度和高样品通量定量纯化少量的核酸，这些样品材料例如相对于其pH、其组成、其蛋白含量并且尤其是盐含量明显不同。特别地，已知的方法并不意在从生物处理样品，如具有不同组成的水性缓冲溶液中定量纯化核酸。例如在生物技术产品尤其是生物药物的生产中，这种方法会是令人感兴趣的。
[0011]生物药 物具体包括蛋白和多肽(例如抗体、抗原、生长激素)、核酸(例如DNA、RNA、质粒、siRNA)、病毒和/或疫苗。使用现代生物技术的方式，尤其是通过天然或遗传修饰生物辅助来生产生物药物。生产通常使用真核或原核宿主细胞，其经常通过遗传工程修饰使得它们能够生产需要的生物药物。在现有技术中熟知代表性的遗传工程技术，并且包括但不限于将编码感兴趣产物如蛋白的基因以重组方式引入细胞中。为此可使用载体。然后各修饰细胞能够生产感兴趣产物。具体地，为此可能使用来自哺乳动物和昆虫、细菌或酵母培养物中的重组微生物、病毒以及植物分生组织和遗传修饰植物的细胞系。生物药物应用于预防、诊断和治疗疾病等。另外，也能够通过生物转化生产生物技术产品，包括生物药物。为此，遗传修饰或未修饰的细胞如特定的细菌或酵母细胞，与化学前体接触并且所述细胞通过其酶机器将所述前体转化为需要的产物。
[0012]在疾病的预防中，已经建立了用于预防细菌或病毒疾病的各种免疫技术，从而生物技术学生产的疫苗正变得越发重要。这些疫苗包括病毒、偶联或非偶联形式的病毒包膜的抗原组分、或病毒、细菌或其他生物的纯DNA组分。病毒包膜或重组病毒的部分也能够用于预防性疫苗接种以抵御由病毒感染引起的疾病。例如，这个技术应用于HPV(人乳头瘤病毒)疫苗接种以预防宫颈癌。单克隆抗体主要应用于分子诊断，并且用于例如免疫表型分析、免疫组织学测定或ELISA。疾病的治疗是生物药物的另一个不断增长的应用领域。使用重组蛋白、激素、重组生物、病毒、重组免疫细胞或也使用基因进行治疗。
[0013]生物技术产品通常经过多级纯化过程，具体例如生物药物。为了得到生物技术产品，可例如裂解生产宿主，或能够从培养物上清中分离生物技术产品。一般使用色谱方法进行从培养物上清和/或裂解物中纯化生物技术产品。此纯化的目的通常是从所得生物技术产品去除污染物并且富集该生物技术产品，所述污染物例如细胞片段、细胞分子、培养基和盐。另外，尤其是在生物药物的情况中，特别感兴趣的是实现核酸污染物(尤其是宿主细胞核酸)含量的明显降低，因为这些污染物可能(例如取决于浓度和宿主)赋予最终生物药物潜在致癌风险。
[0014]通常，为了纯化生物技术产品，具体例如生物药物，通过标准色谱技术的方式实施纯化步骤，例如离子交换色谱、蛋白A / G亲和色谱、疏水性相互作用色谱和/或亲水性相互作用色谱，这些一般根据每个情况中需要纯化的生物药物制剂特定选择。从这些纯化方法中得到的洗脱液在此优选由术语生物处理样品涵盖，对应于这些纯化方法，所述洗脱液通常作为水性纯化部分。根据所选的色谱技术，它们通常表征为成分的广泛不同组成，例如涉及使用的纯化缓冲液(例如醋酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐和马来酸盐缓冲液)、盐浓度、PH值、磷酸盐成分和/或蛋白含量。连续纯化步骤的生物处理样品通常呈现出纯度增加的生物技术产品，例如生物药物，其作为纯化过程的最终产物必须达到管理当局的纯度标准，从而其能够被批准例如作为药物产品或诊断产品。
[0015]一些用于人类的医药产品测试和批准的质量指南由国家和国际机构发布。这些包括ICH指导原则(欧盟、美国、日本)、EMEA指导原则(欧盟)和FDA指导原则(美国)和WHO指导原则。这些指导原则就药物产品限定了源自宿主生物的各种分子的最大允许残留量等，包括内毒素的量、蛋白的量和原核或真核DNA的允许量。对于宿主生物的DNA，按照1987年的WHO决定，必须不超过每剂量待给予药物产品IOOpg的量。理想上并且FDA建议，需要达到低得多的宿主DNA残留量，最多仅IOpg /待给予剂量，以保证就患者而言更高的安全性。
[0016]相似的规定也用于其他生物技术产品，对于这些产品，核酸污染物例如带有病毒核酸能够代表一种问题。
[0017]在确定这些核酸污染物中看到的趋势是使用非常敏感的分子检测技术，例如定量聚合酶链式反应(qPCR)。在现有技术中已知相应的方法并且形成了各个专利申请的主题(参见例如US2009 / 325175)。然而，为了实施所述检测，首先必需从生物处理样品中(例如从宿主中)有效分离少量的污染核酸。此应用不仅对于最终纯化的终产品的核酸分析而言是令人感兴趣的，其对于在纯化过程中接连不断出现的纯化部分也是非常重要的，因为这些纯化部分的分析能够监测和评估纯化的成功结果。用这种方式，还能更快地检测纯化过程中的错误。因此，在现有技术中，在纯化过程的各个点并且优选在纯化过程的每个阶段，测定各纯化部分中靶标核`酸的量(例如污染物，尤其是宿主DNA)是常见的。此应用对于待使用的核酸纯化方法产生了特定挑战，因为如之前解释的，各个纯化部分在其化学组成和pH方面通常彼此显著不同。在此，由于样品通量高，尽管有非常不同的样品材料，需要能够使用统一的核酸纯化方法，理想上可以是自动化的，并且甚至极少量的核酸能够通过该方法尽可能定量和一致地分离。迄今为止，市售可得用于此目的的核酸分离方法尚未令人满意地符合这些要求，因为它们具有各种缺点。
[0018]来自WAKO 公司的 DNA 提取剂试剂盒(DNA Extractor Kit) (#295-50201)是一种手动方法，其中通过使用离液盐(NaI)和阴离子去污剂(N-月桂基-肌氨酸钠)使污染蛋白变性。在加入醇和糖原之后，样品中的核酸沉淀，其中所述沉淀也可含有夹带的污染物，其能够在后续的PCR反应中产生干扰。另外，所述方法耗时并且不易于自动化。
[0019]来自ABI公司的Pr印SEQ残留DNA样品制备试剂盒(Pr印SEQ Residual DNASample Preparation Kit)是使用磁性二氧化娃颗粒的方法并且适于自动化。这个方法的缺点是样品材料首先需要费力的制备，其中所述样品必须按以下顺序单独处理:1)调整至最优PH以及2)样品中的NaCl的浓度调节至>0.5M。由于生物处理样品的不同性质和组成，此制备是必需的，否则后续的分离操作，尤其是对样品材料中少量核酸的操作会无法有效发挥作用。所述制备耗时，因为通常其只能手动操作，使得此方法不允许高样品通量。核酸分离后续步骤的自动化不能用于这种情况下，因为仍包括了单独样品制备的步骤。
[0020]其他基于磁性颗粒的自动化使用的方法是，例如使用来自恰根公司(QIAGENGmBH)的相应QIAsymphony试剂盒通过实验室自动化QIAsymphony的核酸分离方法。这些应用能够从一些不同样品类型如组织、全血、血浆、血清、尿、法医学样品材料等中定量地分离和纯化核酸，但是这些应用最初未设计用于满足对样品材料的特定要求，所述样品材料例如生物处理样品和尤其是纯化部分。如之前所解释，这些样品的特殊性质从大量特定色谱技术的使用中产生，其通常造成水性生物处理样品具有非常不同的化学组成和不同的PH值，这还包括已知核酸分离和纯化方法的抑制剂。另外，它们一般仅仅含有少量的靶标核酸(例如宿主DNA)。
[0021]市售可得的核酸分离的方法(包括上述作为例子提供的方法)的缺点突出了药物和生物技术产业中对于合适核酸分离方法的现有需求，其甚至允许少量的核酸如污染核酸(其源自例如宿主生物或宿主细胞)被纯化，其中所述方法应该优选代表能够自动化的定量、恒定解决方法。
[0022]除了药物和生物技术产业以外，还有其他应用领域，其中检测各种样品材料内以极低浓度存在的核酸是非常令人感兴趣的。这些包括分子医药诊断，其中例如令人感兴趣的是从身体材料中检测少量存在的外来核酸如胎儿、病毒和微生物核酸。从母体血液样品中得到游离循环的胎儿核酸通常对于产前诊断是至关重要的，因为其代表了分析胎儿的遗传方法，该方法不需要穿刺并且因此对于未出生的后代没有风险。在感染的诊断中，少量存在的微生物核酸的分离提供了关于感染的早期证据并且能够对患者进行早期治疗。另外，如果存在感染的风险，能够及早理解守则，例如患者的暂时隔离，从而限制或者甚至预防感染的传播。尤其在侵袭性、高感染性病原的情况下，极早期病原检测是非常重要的，甚至极少数目会引起有严重和几乎无法治疗的病程的感染。这应用于例如产生志贺菌毒素的大肠杆菌(Escherichia coli) (STEC)中，由于不能使用经典的抗生素疗法,感染这种菌经常导致患者死亡。该感染的早期识别以及患者的治疗和早期隔离，能够拯救生命。少量出现的内源性核酸在分子诊断中也是`令人感兴趣的。这些包括例如非编码小RNA，尤其是例如微小RNA(miRNA)分子，其在转录后水平上调苄基因表达。在肿瘤诊断的领域中，其用作例如标记分子。
[0023]法医学是该应用的另一个领域，其中核酸诊断起到重要作用，因为经常只有那种方式能够提供澄清法医学问题的决定性证据。法医学样品材料一般表征为特别广泛的变化，原则上其包括所有能够载有或包含人核酸的物质和液体。然而，具体地，它们是通常仅含有极少痕量的待检测核酸的样品材料。因此，分子检测系统需要一种非常高效和有效的分离核酸的方法，其中只有最少或理想地没有核酸损失以完成后续的全部检测，所述核酸仅仅以少量存在。
[0024]在食物和环境诊断中，分子核酸检测也是非常重要的，例如为了在食品生产、食品检查、育种和植物发育监测的领域，和/或也在水、土壤和空气质量的分析中检测由细菌、病毒、真菌和/或原生动物造成的污染。在这种情况下，样品材料也能够具有非常不同的组成并且可仅仅含有极少量的感兴趣核酸。基于微生物核酸的分子检测而不是通过微生物培养方式的检测方法，是令人信服地更节约时间和更具特异性的方法。[0025]在基础研究中，合成产生的核酸例如小干扰RNA (siRNa)用于基因组分析。核酸的化学生成需要纯化过程，所述纯化过程一般通过色谱技术的方式进行。同样在这种情况下，核酸分离和/或纯化的分子方法会是令人感兴趣的，其允许所述核酸的定量分离并且能得到低盐溶液中的产物。也因此，纯化部分的组成必须对于核酸分离和/或纯化的方法没有任何干扰影响。
[0026]因此，本发明是基于提供一种分离和/或纯化在各种组成的样品材料中少量存在的核酸的方法，该方法特定允许经分离核酸的定量检测。另外，具体地，本发明所解决的特定问题是提供一种相应的方法，其优选能够从各种生物处理样品中定量分离核酸，尤其是色谱纯化过程中得到的各纯化部分，即使这些样品仅仅含有少量的待分离核酸。

【发明内容】

[0027]本发明是基于以下令人惊讶的发现，用特定试剂对样品材料进行意外简单预处理能够通过统一方法从非常不同的样品材料分离核酸，即使样品材料中核酸仅仅以极少量存在。优选地，按照本发明的预处理因此能够省去样品材料(例如PH或盐浓度)或后续纯化方法的单独调整或调节，即使正在加工非常不同的样品材料。按照本发明，用特定的试剂预处理样品材料；之后能够发生所含核酸的实际分离。为此，由于按照本发明的预处理，甚至能够使用常规的标准方法。如果用特定的试剂按照本发明预处理样品材料，不同样品材料之间的差异能够令人惊讶地被分别弥补或克服，并且因此能通过统一的分离方法分离样品材料所含的核酸。没有本发明所述预处理的情况下，这是不可能的，并且不会是足够高效或效率较低。因此，本发明对于所述根本问题提供了一种有效而且意外简单的解决方法。按照本发明的解决方法也提供了可自动化的优点，因为能够省去样品材料和/或后续分离方法的单独调整或调节步骤 。
[0028]由于这些重要的优点，本发明特别适于从生物处理样品中分离核酸，具体例如从生物药物的纯化过程得到的纯化部分中分离核酸。这些特定样品材料的组成(例如所包括的缓冲液和蛋白和/或盐含量)和PH通常差异显著，这明显阻碍了通过统一方法分离核酸。有时，在没有特别措施的情况下，从生物处理样品分离核酸甚至是不可能的。然而，令人惊讶的是，单独生物处理样品之间的现有差异能够通过本发明所述预处理来有效弥补。即使所述生物处理样品的组成不同，能使用统一的核酸分离方法并用本发明所述方法高效、有效和可靠地纯化甚至少量的所含核酸。使用本发明所述方法达到的检测下限对于生物处理样品特别重要，因为对于这些样品材料，需要纯化的核酸经常代表污染物(例如宿主DNA或病毒核酸)，其在样品材料中相应地仅仅少量存在。由于样品材料通常性质非常不同，在本领域的应用中，本发明的优势要求严格并且还通过实施例得到明显证明。它们证明了有时仅仅本发明所述预处理能够使得全部核酸分离，并且提供了一种从各种生物处理样品中分离非常少量核酸的高效、有效和可靠方法。另外，本发明所述方法提供了定量分离并且此外其可自动化，这些在此特定应用领域中也是有价值的优点。
[0029]然而，除了在生物处理样品并且尤其是生物药物的领域中的应用，本发明提供了从其他样品材料中纯化核酸的决定性优点，所述样品材料例如仅含有少量的核酸和/或是具有非常不同的性质。应用的相应领域也如下解释。
[0030]因此，本发明还提供了用于从各种样品材料中分离和/或纯化核酸的各种方法、一种用于预处理所述样品材料的特定试剂和一种用于完成本发明所述方法的试剂盒。随后解释本发明这些方面的细节。
[0031]发明详述
[0032]按照本发明的第一方面，提供了一种用于从样品材料中分离和/或纯化核酸的方法，所述方法包括下列步骤:
[0033]a.向所述样品材料加入试剂，其中所述试剂包括至少一种或多种含氨基的化合物，所述化合物选自下组中的一种或多种:
[0034]1.极性-中性蛋白性a -氨基羧酸，优选天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸，
[0035]i1.非极性-疏水性蛋白性a -氨基羧酸，优选丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和缬氨酸，
[0036]ii1.碱性a-氨基羧酸，优选精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸，
[0037]iv.非蛋白性氨基羧酸，选自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高丝氨酸和D-缬氨酸，
[0038]V.氨基羧酸聚合物，包括至少一种在(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸，优选具有0.5kDa-300kDa的尺寸，优选形成自相同、两种或多种不同的氨基羧酸单体，优选与卤化物联合，优选选自聚-L-赖氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚-L-赖氨酸盐酸盐、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-赖氨酸)氢溴酸盐、聚-L-鸟氨酸，优选由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸组成的氨基羧酸聚合物，`
[0039]v1.来自2-4个氨基羧酸的肽，包括(1.)_(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选选自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，优选甘氨酸二聚体、甘氨酸三聚体和甘氨酸四聚体，优选由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸组成的肽，
[0040]vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相独立地选自氢、烷基、羟基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相独立地选自氣、烷基、羟基烷基，其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链的，是饱和或不饱和的并且其中R1、!?2、!?3和R4中的至少一个不是氢。一个、两个、三个、四个或五个羟基能够以羟基烷基的形式存在。二(羟基烷基)基团和三(羟基烷基)基团也是合适的。通式(I)的化合物优选选自N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二(2-羟基乙基)甘氨酸(bicine),
[0041]vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相独立地选自氢和羟基烷基，并且其中R5、R6和R7互相独立地选自氢、烷基和羟基烷基，其中优选R5、R6和R7中的至少一个是羟基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链，饱和或不饱和的。一个、两个、三个、四个或五个羟基能够以羟基烷基的形式存在。二(羟基烷基)基团和三(羟基烷基)基团也是合适的。化合物(II)优选是三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)，
[0042]b.优选混合该试剂与所述样品材料，
[0043]c.从所述样品材料中分离和/或纯化核酸，所述样品材料已经与所述试剂接触和/或与所述试剂混合，
[0044]d.任选定量和/或定性地检测至少一部分的所述经分离核酸，优选通过扩增待检测核酸片段进行定量检测，
[0045]其中，所述方法优选也包括下列特征之一:
[0046]1.按照步骤(a.)加入所述样品材料的试剂不含离液试剂或[0047]I1.如果在步骤(c.)中加入了至少一种含有离液试剂的试剂，含有离液试剂的试剂的加入在具有1-5个碳原子的支链或直链烷醇不存在的情况下第一次发生。
[0048]在上述和后续提及的所有情况中，除非另外说明，进一步定义的“烷基成分”指在纯烷基基团中和在氣基烷基、硫代烷基、羟基烷基、二(羟基烷基)和/或二(羟基烷基)中，其中在每个情况下，这些能够具有互相独立的陈述说明。在“烷基成分”中合适的饱和、支链或直链C1-C5烷基基团示例是甲基、乙基、1-丙基(=正丙基)、1_甲基乙基(=异丙基)、1_ 丁基(=正丁基)、1_甲基丙基(=仲丁基)、1，1_ 二甲基乙基(=叔丁基)、2_甲基丙基(=异丁基)、1_戍基(=正戍基)、2-戍基(=仲戍基)、3_戍基、2-甲基丁基、3-甲基丁基(=异戍基)、3-甲基丁 -2-基、2-甲基丁 -2-基和2, 2- 二甲基丙基(=新戍基)。特别优选甲基、乙基、1-丙基和2-丙基。
[0049]在“烷基成分”中合适的不饱和、支链或直链C3-C5烷基基团示例是2-丙烯基、3- 丁烯基、1-甲基-2-丙烯基、顺_2_ 丁烯基、反-2- 丁烯基、2_甲基-2-丙烯基、正戍烯基、1-甲基-3- 丁烯基、1-乙基-2-丙烯基、反_2_戍烯基、顺_2_戍烯基、1-甲基_反_2_ 丁烯基、1-甲基_顺_2_ 丁烯基、反-3-戍烯基、顺-3-戍烯基、3_甲基-3- 丁烯基、I, 2_ 二甲基_2_丙烯基、2_乙基_2_丙烯基、2_甲基-反-2- 丁烯基、2_甲基-顺-2- 丁烯基、3-甲基-反-2- 丁烯基、3_甲基-顺-2- 丁烯基、2_甲基-3- 丁烯基、I, 1- 二甲基_2_丙烯基和2_甲基_3_ 丁烯基。
[0050]按照实施方式III，在核酸结合到运载体材料之前，在步骤(c.)中将至少一种裂解剂加入按照步骤(a.)预处理的样品材料。所述裂解剂确实能够带来裂解，但是并不必定总是如此,这取决于起始材料的要求。下面描述优选的实施方式。
[0051]按照实施方式I V，用于在步骤(a.)中预处理的试剂没有任何裂解性质。
[0052]在按照本发明的方法中，实施方式1-1V的特征也能够互相组合。
[0053]按照实施方式1-1V，以及由组合这些实施方式的特征所得的实施方式，包括待分离和/或纯化核酸的样品材料在步骤(a.)中与按照本发明的试剂接触，所述材料选自下组之一:
[0054]A.水性组合物，优选来自纯化过程中的纯化部分，所述组合物包括生物分子和/或生物体，其中所述生物分子和/或生物体具有至少一种下列特征:
[0055]1.所述生物分子和/或生物体选自下组:蛋白、核酸(优选DNA、RNA、质粒、小干扰RNA(siRNA))、病毒和/或疫苗，
[0056]i1.所述生物分子和/或生物体是药学上活性物质，
[0057]ii1.所述生物分子是合成或生物技术学产生的，和/或
[0058]iv.所述生物分子是生物技术学产生的分子，其通过遗传修饰或未修饰的生物产生，
[0059]B.人或动物体组分选自体液、体细胞和/或体组织，优选血液、血液组分、血清、脑脊液、液体粘膜涂片(liquor mucosal smear)、痰液、尿、粪便、精液和组织样品,其中所述身体组分包括下列分子和/或生物体中的一种或多种:
[0060]1.游离循环的人或动物核酸，优选游离循环的胎儿核酸、来自恶性和/或非恶性肿瘤的核酸、来自凋亡细胞的核酸、非编码小RNA、微小RNA(miRNA)和siRNA，
[0061]i1.来自微生物的游离循环核酸，优选来自病原体，尤其优选来自细菌和病毒，和/或
[0062]ii1.微生物，优选病原体，尤其优选细菌和病毒，
[0063]C.含有细胞和/或核酸和/或生物体的法医学样品材料，其中所述细胞和/或核酸和/或生物体以液体样品材料或从所述样品材料提取的液体形式存在，
[0064]和/ 或
[0065]D.一种包括样品组分和任选生物体的组合物，其中，所述样品组分选自食物或其组分，以及环境成分，优选土壤、水和植物，并且任选进行重悬。
[0066]由于在步骤(a.)中按照本发明的预处理，所述方法具有上述优点。作为使用特定试剂预处理样品材料的的结果，显著改善了步骤(c.)中核酸的分离和/或纯化或者对于一些样品材料，甚至变得完全可能。此外，例如能够高效、有效并且甚至定量地分离在样品材料中仅以极小量存在的核酸。因此，使用按照本发明的方法，即使在样品材料中含有仅仅Ipg或更少量的核酸，它们也能被分离(甚至0.1pg或0.01pg量的分离也是可能的)。另外，按照本发明的预处理具有所述效果，即非常不同的样品材料也能够以相同的方式进行加工，而对于核酸分离的效率没有任何显著差异。实验已经显示，即使核酸在非常不同的样品材料中存在，例如具有3-9范围内的不同pH值，具有非常不同的化学组成和/或具有不同的盐浓度时，按照本发明的方法能够高效、有效和可靠地分离核酸。即使按照本发明的方法使用这类不同的样品材料，由于按照本发明的预处理，所述方法提供可靠地良好的分离结果。因此，按照本发明的方法开辟了迄今为止现有技术尚未令人满意地起作用的应用领域。具体地，核酸的定 量分离也变得可能，即使它们在样品材料中仅以少量存在。另外，按照本发明的方法适用于手动和自动化操作，尤其是当处理大量样品时这是有优势的。
[0067]所述方法的一个重要特征是在实施核酸分离和/或纯化的步骤之前特定试剂在步骤(a.)中的应用，这在现有技术中是已知的。该预处理具有所述效果，即样品材料中存在的核酸随后能高效和有效地纯化，即使它们仅在多个样品材料中少量存在和/或从样品材料中分离，该样品材料由于它们的组成而不能在没有进一步处理的情况下进行分离，例如生物处理样品就是如此。令人惊讶的是，在步骤(a.)中使用的试剂弥补了样品材料中的差异并且因此能够通过使用统一方法可靠分离核酸。此外，其使得核酸甚至能从没有本发明所述预处理情况下无法进行分离的样品材料中分离。
[0068]用于预处理样品材料的本发明所述方法步骤(a.)中使用的试剂包括至少一种或多种含选自上述(1.)-(vii1.)的氨基的化合物。如果在所述试剂中存在一种或多种具有氨基的化合物，例如，能够存在(1.)-(vii1.)各组之内或之间的组分的混合物。对于步骤(a.)中的预处理，所述化合物也能互相分开加入。从本发明的意义上说，此实施方式也应代表用本发明所述试剂按照步骤(a.)的预处理。
[0069]步骤(a.)中按照本发明使用的试剂因此在用于后续核酸分离和/或纯化的样品制备的多个实施方式中合适:例如，能够包括一种或多种极性-中性蛋白性a-氨基羧酸，如天冬酰胺和/或半胱氨酸和/或谷胺酰胺和/或甘氨酸和/或苏氨酸和/或丝氨酸。此外，一种或多种非极性-疏水性蛋白性a -氨基羧酸例如丙氨酸和/或亮氨酸和/或异亮氨酸和/或甲硫氨酸和/或脯氨酸和/或缬氨酸，以及一种或多种碱性a -氨基羧酸如精氨酸和/或赖氨酸和/或鸟氨酸也能包括在所述试剂中。也能包括一种或多种非蛋白性氨基羧酸，例如P -丙氨酸和/或D-丙氨酸和/或L-高丝氨酸和/或D-缬氨酸。所述试剂还能包括氨基羧酸聚合物，所述氨基羧酸聚合物可优选从相同、或两种或多种不同的氨基羧酸单体中形成，所述氨基羧酸单体具有极性-中性蛋白性a -氨基羧酸组和/或非极性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸组和/或碱性a-氨基羧酸组和/或非蛋白性氨基羧酸组。所述试剂还能包括来自2-4个氨基羧酸的肽，所述肽优选选自相同或不同的氨基羧酸，所述氨基羧酸具有极性-中性蛋白性a-氨基羧酸组和/或非极性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸组和/或碱性a-氨基羧酸组和/或非蛋白性氨基羧酸组。所述试剂中也能包括一种或多种通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相独立地选自氢、烷基、羟基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相独立地选自氣、烷基和羟基烷基，其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链的，是饱和或不饱和的并且其中R1、R2、R3和R4的残基中的至少一个不是氢。该化合物优选选自N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和/或N，N-二(2-羟基乙基)甘氨酸(bicine)。另外，所述试剂中也能包括一种或多种通式R3R4N-CR5R6R7 (II)的化合物，其中R3和R4互相独立地选自氢和羟基烷基，并且其中R5、R6和R7互相独立地选自氢、烷基和羟基烷基，其中优选R5、R6和R的7残基中的至少一个是羟基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链，饱和或不饱和的。对应此通式的一个优选化合物是三(羟基甲基)-氨基甲烷(Tris)化合物。
[0070]按照一个优选的实施方式,所述试剂的pH在pH3_pH9的范围内。如所述示例所示，按照本发明的试剂能够具有酸性和碱性pH。
[0071]按照本发明所述试剂的一个实施方式，所述试剂包括优选大小为0.5kDa-300kDa的氨基羧酸聚合物。所述氨基羧酸聚合物能够以来自相同氨基羧酸单体的均聚物或来自两种或多种不同氨基羧酸单体的共聚物形式存在，其中所述单体在聚合物链中排列，从而其是交替、随机分布的，采用梯度或块状形式。两种聚合物类型都优选从下组的氨基羧酸单体中形成:(1.)极性-中性蛋白性a-氨基羧酸和/或(i1.)非极性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸和/或(ii1.)碱性a-氨基羧酸和/或(iv.)非蛋白性氨基羧酸，优选与氢卤化物如溴化氢或氯化氢联合。优选选择的化合物是聚-L-赖氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚-L-赖氨酸盐酸盐、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-赖氨酸)氢溴酸盐、聚-L-鸟氨酸。此外，聚合物也包括从非蛋白性对映体化合物形式，如聚-D-赖氨酸、聚-D-赖氨酸氢溴酸盐、聚(D-谷胺酰`胺，D-赖氨酸)氢溴酸盐形成的聚合物。
[0072]如果本发明所述试剂的一个实施方式包含来自2-4个氨基羧酸的肽，这些氨基羧酸优选选自下组的相同或不同的氨基羧酸:(1.)极性-中性蛋白性a-氨基羧酸和/或(i1.)非极性-疏水性蛋白性a -氨基羧酸和/或(ii1.)碱性a -氨基羧酸和/或(iv.)非蛋白性氨基羧酸。优选地，肽化合物从以下优选描述的分子形成:天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、缬氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、^ -丙氨酸、D-丙氨酸、L-高丝氨酸和D-缬氨酸，其中这些分子任意组合作为二聚体、三聚体或四聚体是可能的。下列例子包括来自2氨基羧酸的肽化合物:天冬酰胺-天冬酰胺、天冬酰胺-半胱氨酸、天冬酰胺-谷胺酰胺、天冬酰胺-甘氨酸、天冬酰胺-苏氨酸、天冬酰胺-丝氨酸、天冬酰胺-丙氨酸、天冬酰胺-亮氨酸、天冬酰胺-异亮氨酸、天冬酰胺-甲硫氨酸、天冬酰胺-脯氨酸、天冬酰胺-缬氨酸、天冬酰胺-精氨酸、天冬酰胺-赖氨酸、天冬酰胺-鸟氨酸、天冬酰胺-3 -丙氨酸、天冬酰胺-D-丙氨酸、天冬酰胺-L-高丝氨酸、天冬酰胺-D-缬氨酸、半胱氨酸-天冬酰胺、半胱氨酸-半胱氨酸、半胱氨酸-谷胺酰胺、半胱氨酸-甘氨酸、半胱氨酸-苏氨酸、半胱氨酸-丝氨酸、半胱氨酸-丙氨酸、半胱氨酸-亮氨酸、半胱氨酸-异亮氨酸、半胱氨酸-甲硫氨酸、半胱氨酸-脯氨酸、半胱氨酸-缬氨酸、半胱氨酸-精氨酸、半胱氨酸-赖氨酸、半胱氨酸-鸟氨酸、半胱氨酸-3 -丙氨酸、半胱氨酸-D-丙氨酸、半胱氨酸-L-高丝氨酸、半胱氨酸-D-缬氨酸、谷胺酰胺-天冬酰胺、谷胺酰胺-半胱氨酸、谷胺酰胺-谷胺酰胺、谷胺酰胺-甘氨酸、谷胺酰胺-苏氨酸、谷胺酰胺-丝氨酸、谷胺酰胺-丙氨酸、谷胺酰胺-亮氨酸、谷胺酰胺-异亮氨酸、谷胺酰胺-甲硫氨酸、谷胺酰胺-脯氨酸、谷胺酰胺-缬氨酸、谷胺酰胺-精氨酸、谷胺酰胺-赖氨酸、谷胺酰胺-鸟氨酸、谷胺酰胺-3 -丙氨酸、谷胺酰胺-D-丙氨酸、谷胺酰胺-L-高丝氨酸、谷胺酰胺-D-缬氨酸、甘氨酸-天冬酰胺、甘氨酸-半胱氨酸、甘氨酸-谷胺酰胺、甘氨酸-甘氨酸、甘氨酸-苏氨酸、甘氨酸-丝氨酸、甘氨酸-丙氨酸、甘氨酸-亮氨酸、甘氨酸-异亮氨酸、甘氨酸-甲硫氨酸、甘氨酸-脯氨酸、甘氨酸-缬氨酸、甘氨酸-精氨酸、甘氨酸-赖氨酸、甘氨酸-鸟氨酸、甘氨酸-P -丙氨酸、甘氨酸-D-丙氨酸、甘氨酸-L-高丝氨酸、甘氨酸-D-缬氨酸、苏氨酸-天冬酰胺、苏氨酸-半胱氨酸、苏氨酸-谷胺酰胺、苏氨酸-甘氨酸、苏氨酸-苏氨酸、苏氨酸-丝氨酸、苏氨酸-丙氨酸、苏氨酸-亮氨酸、苏氨酸-异亮氨酸、苏氨酸-甲硫氨酸、苏氨酸-脯氨酸、苏氨酸-缬氨酸、苏氨酸-精氨酸、苏氨酸-赖氨酸、苏氨酸-鸟氨酸、苏氨酸-(6-丙氨酸、苏氨酸-D-丙氨酸、苏氨酸-L-高丝氨酸、苏氨酸-D-缬氨酸、丝氨酸-天冬酰胺、丝氨酸-半胱氨酸、丝氨酸-谷胺酰胺、丝氨酸-甘氨酸、丝氨酸-苏氨酸、丝氨酸-丝氨酸、丝氨酸-丙氨酸、丝氨酸-亮氨酸、丝氨酸-异亮氨酸、丝氨酸-甲硫氨酸、丝氨酸-脯氨酸、丝氨酸-缬氨酸、丝氨酸-精氨酸、丝氨酸-赖氨酸、丝氨酸-鸟氨酸、丝氨酸-P -丙氨酸、丝氨酸-D-丙氨酸、丝氨酸-L-高丝氨酸、丝氨酸-D-缬氨酸、丙氨酸-天冬酰胺、丙氨酸-半胱氨酸、丙氨酸-谷胺酰胺、丙氨酸-甘氨酸、丙氨酸-苏氨酸、丙氨酸-丝氨酸、丙氨酸-丙氨酸、丙氨酸-亮氨酸、丙氨酸-异亮氨酸、丙氨酸-甲硫氨酸、丙氨酸-脯氨酸、丙氨酸-缬氨酸、丙氨酸-精氨酸、精氨酸-赖氨酸、精氨酸-鸟氨酸、丙氨酸-P -丙氨酸、丙氨酸-D-丙氨酸、丙氨酸-L-高丝氨酸、丙氨酸-D-缬氨酸、亮氨酸-天冬酰胺、亮氨酸-半胱氨酸、亮氨酸-谷胺酰胺、亮氨酸-甘氨酸、亮氨酸-苏氨酸、亮氨酸-丝氨酸、亮氨酸-丙氨酸、亮氨酸-亮氨酸、亮氨酸-异亮氨酸、亮氨酸-甲硫氨`酸、亮氨酸-脯氨酸、亮氨酸-缬氨酸、亮氨酸-精氨酸、亮氨酸-赖氨酸、亮氨酸-鸟氨酸、亮氨酸-P -丙氨酸、亮氨酸-D-丙氨酸、亮氨酸-L-高丝氨酸、亮氨酸-D-缬氨酸、异亮氨酸-天冬酰胺、异亮氨酸-半胱氨酸、异亮氨酸-谷胺酰胺、异亮氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-苏氨酸、异亮氨酸-丝氨酸、异亮氨酸-丙氨酸、异亮氨酸-亮氨酸、异亮氨酸-异亮氨酸、异亮氨酸-甲硫氨酸、异亮氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-缬氨酸、异亮氨酸-精氨酸、异亮氨酸-赖氨酸、异亮氨酸-鸟氨酸、异亮氨酸-3 -丙氨酸、异亮氨酸-D-丙氨酸、异亮氨酸-L-高丝氨酸、异亮氨酸-D-缬氨酸、甲硫氨酸-天冬酰胺、甲硫氨酸-半胱氨酸、甲硫氨酸-谷胺酰胺、甲硫氨酸-甘氨酸、甲硫氨酸-苏氨酸、甲硫氨酸-丝氨酸、甲硫氨酸-丙氨酸、甲硫氨酸-亮氨酸、甲硫氨酸-异亮氨酸、甲硫氨酸-甲硫氨酸、甲硫氨酸-脯氨酸、甲硫氨酸-缬氨酸、甲硫氨酸-精氨酸、甲硫氨酸-赖氨酸、甲硫氨酸-鸟氨酸、甲硫氨酸-P -丙氨酸、甲硫氨酸-D-丙氨酸、甲硫氨酸-L-高丝氨酸、甲硫氨酸-D-缬氨酸、脯氨酸-天冬酰胺、脯氨酸-半胱氨酸、脯氨酸-谷胺酰胺、脯氨酸-甘氨酸、脯氨酸-苏氨酸、脯氨酸-丝氨酸、脯氨酸-丙氨酸、脯氨酸-亮氨酸、脯氨酸-异亮氨酸、脯氨酸-甲硫氨酸、脯氨酸-脯氨酸、脯氨酸-缬氨酸、脯氨酸-精氨酸、脯氨酸-赖氨酸、脯氨酸-鸟氨酸、脯氨酸-3 -丙氨酸、脯氨酸-D-丙氨酸、脯氨酸-L-高丝氨酸、脯氨酸-D-缬氨酸、缬氨酸-天冬酰胺、缬氨酸-半胱氨酸、缬氨酸-谷胺酰胺、缬氨酸-甘氨酸、缬氨酸-苏氨酸、缬氨酸-丝氨酸、缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-亮氨酸、缬氨酸-异亮氨酸、缬氨酸-甲硫氨酸、缬氨酸-脯氨酸、缬氨酸-缬氨酸、缬氨酸-精氨酸、缬氨酸-赖氨酸、缬氨酸-鸟氨酸、缬氨酸-3 -丙氨酸、缬氨酸-D-丙氨酸、缬氨酸-L-高丝氨酸、缬氨酸-D-缬氨酸、精氨酸-天冬酰胺、精氨酸-半胱氨酸、精氨酸-谷胺酰胺、精氨酸-甘氨酸、精氨酸-苏氨酸、精氨酸-丝氨酸、精氨酸-丙氨酸、精氨酸-亮氨酸、精氨酸-异亮氨酸、精氨酸-甲硫氨酸、精氨酸-脯氨酸、精氨酸-缬氨酸、精氨酸-精氨酸、精氨酸-赖氨酸、精氨酸-鸟氨酸、精氨酸-3 -丙氨酸、精氨酸-D-丙氨酸、精氨酸-L-高丝氨酸、精氨酸-D-缬氨酸、赖氨酸-天冬酰胺、赖氨酸-半胱氨酸、赖氨酸-谷胺酰胺、赖氨酸-甘氨酸、赖氨酸-苏氨酸、赖氨酸-丝氨酸、赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-亮氨酸、赖氨酸-异亮氨酸、赖氨酸-甲硫氨酸、赖氨酸-脯氨酸、赖氨酸-缬氨酸、赖氨酸-精氨酸、赖氨酸-赖氨酸、赖氨酸-鸟氨酸、赖氨酸-P -丙氨酸、赖氨酸-D-丙氨酸、赖氨酸-L-高丝氨酸、赖氨酸-D-缬氨酸、鸟氨酸-天冬酰胺、鸟氨酸-半胱氨酸、鸟氨酸-谷胺酰胺、鸟氨酸-甘氨酸、鸟氨酸-苏氨酸、鸟氨酸-丝氨酸、鸟氨酸-丙氨酸、鸟氨酸-亮氨酸、鸟氨酸-异亮氨酸、鸟氨酸-甲硫氨酸、鸟氨酸-脯氨酸、鸟氨酸-缬氨酸、鸟氨酸-精氨酸、鸟氨酸-赖氨酸、鸟氨酸-鸟氨酸、鸟氨酸-P -丙氨酸、鸟氨酸-D-丙氨酸、鸟氨酸-L-高丝氨酸、鸟氨酸-D-缬氨酸、^ -丙氨酸-天冬酰胺、^ -丙氨酸-半胱氨酸、^ -丙氨酸-谷胺酰胺、^ -丙氨酸-甘氨酸、^ -丙氨酸-苏氨酸、3 -丙氨酸-丝氨酸、(6-丙氨酸-丙氨酸、(6-丙氨酸-亮氨酸、(6-丙氨酸-异亮氨酸、3 -丙氨酸-甲硫氨酸、(6-丙氨酸-脯氨酸、(6-丙氨酸-缬氨酸、(6-丙氨酸-精氨酸、3 _丙氨酸_赖氨酸、丙氨酸_鸟氨酸、丙氨酸丙氨酸、丙氨酸_D_丙氨酸、P -丙氨酸-L-高丝氨酸、^ -丙氨酸-D-缬氨酸、D-丙氨酸-天冬酰胺、D-丙氨酸-半胱氨酸、D-丙氨酸-谷胺酰胺、D-丙氨酸-甘氨酸、D-丙氨酸-苏氨酸、D-丙氨酸-丝氨酸、D-丙氨酸-丙氨酸、D-丙氨酸-亮氨酸、D-丙氨酸-异亮氨酸、D-丙氨酸-甲硫氨酸、D-丙氨酸_ 脯氨酸、D-丙氨酸-纟颜氨酸、D-丙氨酸-精氨酸、D-丙氨酸-赖氨酸、D-丙氨酸_鸟氨酸、D-丙氨酸-P -丙氨酸、D-丙氨酸-D-丙氨酸、D-丙氨酸-L-闻丝氨酸、D-丙氨酸-D-缬氨酸、L-高丝氨酸-天冬酰胺、L-高丝氨酸-半胱氨酸、L-高丝氨酸-谷胺酰胺、L-高丝氨酸-甘氨酸、L-高丝氨酸-苏氨酸、L-高丝氨酸-丝氨酸、L-高丝氨酸-丙氨酸、L-高丝氨酸-亮氨酸、L-高丝氨酸-异亮氨酸、L-高丝氨酸-甲硫氨酸、L-高丝氨酸-脯氨酸、L-高丝氨酸-缬氨酸、L-高丝氨酸-精氨酸、L-高丝氨酸-赖氨酸、L-高丝氨酸-鸟氨酸、L-高丝氨酸-P -丙氨酸、L-高丝氨酸-D-丙氨酸、L-高丝氨酸-L-高丝氨酸、L-高丝氨酸-D-缬氨酸、D-缬氨酸-天冬酰胺、D-缬氨酸-半胱氨酸、D-缬氨酸-谷胺酰胺、D-缬氨酸-甘氨酸、D-缬氨酸-苏氨酸、D-缬氨酸-丝氨酸、D-缬氨酸-丙氨酸、D-缬氨酸-亮氨酸、D-缬氨酸-异亮氨酸、D-缬氨酸-甲硫氨酸、D-缬氨酸-脯氨酸、D-缬氨酸-缬氨酸、D-缬氨酸-精氨酸、D-缬氨酸-赖氨酸、D-缬氨酸-鸟氨酸、D-缬氨酸-P -丙氨酸、D-缬氨酸-D-丙氨酸、D-缬氨酸-L-高丝氨酸、D-缬氨酸-D-缬氨酸。与组合自2氨基羧酸的所述肽化合物类似，具有3-4个氨基羧酸的肽化合物也是可能的。
[0073]按照一个优选的实施方式，来自2-4个氨基羧酸的肽大概是甘氨酸-甘氨酸二聚体，并且优选是甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸三聚体和/或甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸四聚体。
[0074]当在本发明所述用于分离和/纯化核酸的方法中使用所述试剂，按照一个实施方式在样品材料与步骤(a.)中用于预处理的试剂的反应混合物中时，包括氨基的化合物和/或各种这些化合物的组合的总浓度是2.5mM-400mM,优选12.5mM-280mM,特别优选25mM-200mM。已证明这些浓度对于200 U 1-1000 U I大小的样品材料与试剂的反应混合物特别有利。在此，所述核酸的定量分离是可能的，即使本发明所述试剂与样品材料的反应混合物仅含有Ipg核酸数量级的少量核酸。达到了超过50%的回收率。按照本发明在步骤(a.)中使用的试剂优选包括含氨基的化合物和/或各种这些化合物的组合，其总浓度为5mM-500mM，优选 25mM-350mM，特别优选 50mM-250mM。
[0075]按照本发明所述方法的一个优选的实施方式，在步骤(a.)中使用的试剂还包括至少一种或多种下列组分:
[0076]-至少一种去污剂或去污剂的混合物，
[0077]-至少一种络合剂或络合剂的混合物，和/或
[0078]-至少一种蛋白或蛋白的混合物。
[0079]如果所述试剂含有几种组分或成分，这些组分或成分能够以均匀试剂的形式添加，例如溶液，或者，所述试剂能通过混合两种或多种制剂形成，例如这些制剂与样品材料一起接触或任选地互相分开接触，以按照步骤(a.)预处理所述样品材料。按照本发明，术语向样品材料加入试剂包括单独组分的分开加入。然而，优选地，所述组分或成分以一种均匀试剂的形式加入。
[0080]在用于预处理的试剂中可能含有的去污剂或去污剂的混合物优选选自非离子型表面活性剂并且特别优选选自烷基葡糖苷和/或聚氧乙烯烷基苯基醚。烷基葡糖苷组具体包括聚山梨酯组，优选聚山梨酯20、聚山梨酯40和聚山梨酯80,并且特别优选聚山梨酯20 (吐温20)。聚氧乙烯烷基苯基醚组优选包括辛苯聚醇9 (曲通X-100)和诺乃洗涤剂(Nonidet)P-40。步骤(a.)中存在去污剂或去污剂的混合物能够对预处理产生有益影响。因此，待纯化核酸的回收率以及因此核酸分离的效率能够优选通过加入至少一种去污剂而增加，其也通过实施例明确证明。所述去污剂优选是本发明所述试剂的组成部分；然而，如前述，其还能分别添加用于预处理所述样品材料。优选地，在所述试剂中，所述去污剂或去污剂的混合物尤其是一种或多种非离子型表面活性剂的总浓度是0.1% (v / v)-5% (v /v),优选 0.2% (v / v)-4% (v / v),并且优选 0.5% (v / v)-3% (v / v)并且也优选 I %(v / v)-3% (v / v)。0.2% (v / v)-0.5% (v / v)尤其优选用于聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100，并且1% (v / v)-5% (v / v)尤其优选用于烷基葡糖苷，尤其是聚山梨酯，例如吐温20。
[0081]按照一个实施方式，在样品材料与本发明所述试剂的反应混合物中，所述试剂包含的去污剂或去污剂混合物尤其是一种或多种非离子型表面活性剂的总浓度是0.05%(V / v) -4% (v / v),优选 0.1 % (v / v) -3 % (v / v)并且优选 0.25% (v / v) -2.5 %(v / v)并且也优选 0.5% (v / v) -2.5% (v / v)。优选已证明 0.1% (v / v) -0.4% (v /v)的值对具体用于聚氧乙烯烷基苯基醚特别有利，例如曲通X-100。按照一个实施方式，所述浓度优选是0.5% (V / v) -4% (v / V)。此浓度尤其优选用于聚山梨酯,例如吐温20。已经证明前述浓度对于2ooia-1oooia大小范围的样品材料与试剂的反应混合物特别有利。因此，核酸的定量分离是可能的，即使所述反应混合物仅仅含有ipg或更少的核酸。能达到超过50%和甚至75%以上的回收率，在很多情况下甚至高于85%。优选地，用于样品材料预处理的步骤(a.)所用试剂含有至少两种去污剂。按照一个实施方式，一种去污剂选自烷基葡糖苷组，优选聚山梨酯，尤其优选聚山梨酯20，并且另一种去污剂选自聚氧乙烯烷基苯基醚的组，优选曲通X-100。
[0082]按照本发明所述方法的一个实施方式，用于预处理的步骤(a.)所用试剂含有一种络合剂或络合剂的混合物。如前述，所述试剂也能由几种组合物组成，所述组合物首先组合或混合用于预处理，从而络合剂也能在步骤(a.)中单独加入用于预处理样品材料。然而，优选地，所述络合剂是均匀试剂的组成部分，例如用于所述样品材料预处理的溶液。所述络合剂优选选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(氨基乙基醚)-N，N'-四乙酸(EGTA)和/或乙二胺二琥珀酸(EDDS)。特别优选使用EDTA。
[0083]按照一个实施方式，所述试剂中络合剂的总浓度是10mM-500mM，优选10mM-300mM, 10mM-200mM并且更优选10mM-100mM。按照一个实施方式，对于包括在试剂中的络合物，样品和本发明所述试剂的反应混合物中的总浓度是5mM-400mM，优选5mM-80mM。如果本发明所述试剂与样品材料的反应混合物具有200 iU-lOOOia的尺寸并且仅含有Ipg的核酸，这些浓度显示在按照本发明的方法中特别有利。因此，达到了超过75%并且有时甚至在85%以上的回收率。
[0084]在一个具体的实施方式中，所述试剂含有化合物三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)，但不含有EDTA和/或EGTA。
[0085]按照本发明所述方法的一个实施方式，用于预处理的步骤(a.)所用试剂含有至少一种蛋白，优选球状蛋白或球状蛋白的混合物。如前述，所述试剂也能由几种组合物组成，所述组合物首先组合或混合用于预处理，从而所述蛋白也能在步骤(a.)中单独加入用于预处理样品材料。然而，优选`地，所述蛋白是均匀试剂的组成部分，例如用于所述样品材料预处理的溶液。根据一个实施方式，所述蛋白没有任何酶活性。优选地，该蛋白不是酶。球状蛋白优选选自白蛋白和/或球蛋白。所述白蛋白选自动物白蛋白、植物白蛋白和/或人白蛋白，优选牛血清白蛋白(BSA)。所述球蛋白选自动物球蛋白、植物球蛋白和/或人球蛋白，优选它们是免疫球蛋白，如优选使用Y-球蛋白。令人惊讶的是，如果用于预处理样品材料的步骤(a.)所用试剂含有相应的蛋白，其显示有利。因此，再次可提高核酸纯化的效率，尤其是当样品材料仅含有低蛋白浓度时。因此相应蛋白在步骤(a.)所用试剂中的应用改善了核酸纯化，尤其是当待处理样品材料仅包含少量的蛋白和/或在蛋白浓度方面显不差异时。
[0086]按照本发明所述方法的一个实施方式，步骤(a.)所用试剂中一种或多种蛋白的总浓度是 Img / mL-100mg / mL,优选 2mg / mL_25mg / mL, 2mg / ml-10mg / ml 并且还更优选 4mg / ml-10mg / ml。2mg / mL_25mg / mL、2mg / ml-10mg / ml 和优选 4mg /ml-10mg / ml的浓度特别适于球状蛋白，特别是例如IgG和BSA。
[0087]按照一个实施方式，就包含于试剂中的一种或多种蛋白而言，在样品和本发明所述试剂的反应混合物中的总浓度是0.5mg / mL-80mg / mL、lmg / mL-20mg / mL,优选Img / mL-8mg / mL,优选2mg / mL-8mg / mL。如果本发明所述试剂与样品材料的反应混合物具有2ooia-1oooia的尺寸，这些浓度显示在按照本发明的方法中特别有利。因此，核酸的定量分离是可能的，即使所述反应混合物仅仅含有ipg或更少的核酸。在这种情况下，达到了超过75%有时甚至在85%以上的回收率。所述蛋白的浓度特别适于球状蛋白，尤其是例如IgG和BSA。
[0088]按照一个实施方式，在步骤(a.)中使用的试剂不含总浓度≥5mM的磷酸盐和/或柠檬酸盐，其中尤其不含游离的磷酸盐。已经发现，尤其是过量的磷酸盐浓度可对核酸分离和/或纯化产生抑制效果，特别是从生物处理样品中纯化核酸时。
[0089]按照一个实施方式，所述试剂包括至少一个或多个含有氨基的化合物，所述氨基选自以下1-viii组中的一种或多种:
[0090]1.天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸，
[0091]i1.丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和缬氨酸，
[0092]ii1.精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸，
[0093]iv.P -丙氨酸、D-丙氨酸、L-高丝氨酸和D-缬氨酸，
[0094]V.聚-L-赖氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚-L-赖氨酸盐酸盐、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-赖氨酸)氢溴酸盐、聚-L-鸟氨酸，
[0095]v1.甘氨酸二聚体、甘氨酸三聚体、甘氨酸四聚体和二肽(Ala-Glu)，
[0096]vi1.N-(三(羟基 甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N，N- 二(2-羟基乙基)甘氨酸(bicine)，
[0097]和/ 或
[0098]vii1.三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)。
[0099]下面描述了所述试剂的特别优选的实施方式。在这些优选的实施方式中，所述试剂的单独组分优选以上面就单独组成部分描述的浓度存在，在此方面参考上述公开内容。如所述，还能够在样品材料的预处理期间分开加入所述试剂的单独组分，然而，其中优选以均匀试剂形式加入，例如溶液。
[0100]按照一个优选的实施方式，在步骤(a.)中使用的试剂包括至少甘氨酸、Gly-Gly,N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸和/或N，N-二(2-羟基乙基)甘氨酸作为含氨基的化合物、至少一种络合剂(优选EDTA)以及至少一种、优选至少两种去污剂，尤其优选聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯，例如优选吐温20。特别优选地，所述试剂还包括至少一种蛋白，优选球状蛋白如IgG或BSA。
[0101]按照一个实施方式，在步骤(a.)中使用的本发明所述试剂包括一个或多个选自天冬酰胺、谷胺酰胺、精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸的极性-中性和/或碱性a-氨基羧酸。因此，实验已经显示用相应的试剂预处理还能够改善分离和/或纯化，尤其是当这个/这些a -氨基羧酸与缓冲液组合时，具体例如Tris或磺酸缓冲液，如HEPES或HEPPS缓冲液。另外，所述试剂优选包括至少一种蛋白，优选球状蛋白如IgG或BSA。
[0102]按照另一个优选的实施方式，在步骤(a.)中使用的试剂包括氨基羧酸化合物谷胺酰胺、脯氨酸、聚-L-赖氨酸和/或聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)以及二肽(Ala-Glu)。优选地，其还包括络合剂例如EGTA，和至少一种、优选至少两种去污剂，尤其优选聚氧乙烯烷基苯基醚，如诺乃洗涤剂-P40和/或聚山梨酯，优选例如吐温20。更优选地，所述试剂也包括球状蛋白，优选IgG和一种或多种缓冲液，优选一种或两种磺酸缓冲液，例如HEPES和/或 HEPPS。
[0103]按照另一个优选的实施方式，在步骤(a.)中使用的试剂包括至少一种、优选两种以下氨基羧酸化合物即(6-丙氨酸和聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)。优选地，其还包括络合剂例如EDTA，和至少一种、优选至少两种去污剂，尤其优选聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯,优选例如聚山梨酯40。优选地,所述试剂也包括球状蛋白和一种或多种缓冲液，所述球状蛋白优选IgG，所述缓冲液优选一种或两种磺酸缓冲液，例如HEPES和 / 或 HEPPS。
[0104]按照另一个优选的实施方式，在步骤(a.)中使用的试剂包括至少两种、优选所有的以下氨基羧酸化合物即半胱氨酸、丙氨酸、精氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐和三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)。此外，该试剂优选包括球状蛋白，尤其是IgG。
[0105]按照另一个优选的实施方式，在步骤(a.)中使用的试剂包括至少两种、优选所有的以下氨基羧酸化合物即丝氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、D-缬氨酸和聚-L-鸟氨酸。优选地，其还包括络合剂例如EGTA，和至少一种、优选至少两种去污剂，尤其优选聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或 聚山梨酯，优选例如吐温20。优选地，所述试剂也包括球状蛋白，优选 BSA。
[0106]按照另一个优选的实施方式，在步骤(a.)中使用的试剂包括至少两种、优选所有的以下氨基羧酸化合物即苏氨酸、亮氨酸和鸟氨酸。优选地，其还包括络合剂例如EDDSJP至少一种、优选至少两种去污剂，尤其优选聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯，优选例如吐温20。优选地，所述试剂还包括蛋白和优选一种或多种缓冲液，所述蛋白优选球状蛋白如IgG或BSA，所述缓冲液优选一种或两种磺酸缓冲液，例如HEPES和/或HEPPS。
[0107]本发明所述用于分离和/或纯化核酸的方法的特征是通过连续几个步骤，从提供的样品材料到任选的、优选至少一部分经分离核酸的定量检测。单独的步骤和优选的实施方式如下文详细解释。所述实施方式也能够互相组合。
[0108]在所述方法的一个基本实施方式中，步骤(a)中出现按照本发明制备样品材料用于分离/纯化样品材料中含有的核酸。这通过向样品材料加入特定试剂来实现，其已经在前文中详细描述。如果所述试剂包括几种组分，从构建模块系统的意义上说，这些组分也能够互相分开加入，用于使用本发明所述试剂预处理步骤(a.)中的样品材料。然而，优选地，所述组分以均匀试剂如溶液的形式加入。在任选的混合步骤(b.)之后是核酸的实际分离和/或纯化(步骤c.)，然后是任选地，至少一部分经分离核酸的检测(步骤d.)。
[0109]按照本发明的方法能够具有下列一种或多种特征:
[0110]按照一个实施方式，在步骤(a.)中向样品材料加入的本发明所述试剂不含离液剂。按照一个实施方式，术语“离液剂”指离液化合物以及因此对于蛋白具有变性效果的化合物，并且其特定破坏基于氢键形成的液态水常规结构。具体地，术语“离液剂”是指离液盐，尤其是例如钠盐或胍盐，优选选自:碘化钠、高氯酸钠、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍和/或其两种或更多种盐的混合物。不含离液剂的这个实施方式是有利的，因为测试已经显示用于预处理的步骤(a)所用试剂中的离液化合物尤其在较高浓度下能对后续核酸纯化产生不利影响，所述离液化合物具体例如离液盐，。因此在步骤(a.)中用于预处理的试剂优选不含一定浓度的离液盐，该浓度会干扰后续的核酸分离，并且尤其是使得本发明所述预处理效果更差的浓度。优选地，在本发明所述方法的步骤(a.)中使用的试剂完全不含任何离液剂或在步骤(a.)中完全不添加离液剂。
[0111]按照第二个实施方式，如果在步骤(c.)中加入至少一种含有离液剂的试剂，含有离液剂的试剂是在具有1-5个碳原子的支链或直链烷醇不存在的情况下第一次加入步骤(C)中。能够在步骤(c.)中加入含有离液剂的试剂，例如用于消化预处理的样品材料。然而，在步骤(c.)中第一次加入含有离液剂的试剂之后，按照此实施方式这在没有支链或直链醇的情况下发生，随后具有1-5个碳原子的支链或直链烷醇能再次使用，例如用于调节结合条件和/或在任选的洗涤步骤中使用。这些后续的步骤能够另外在有或没有离液化合物的情况下发生。
[0112]按照第三个实施方式，在核酸结合到运载体材料之前，在步骤(c.)中将至少一种裂解剂加入已经按照步骤(a.)预处理的样品材料。能用于这个目的的经典裂解剂是例如酶，尤其是蛋白水解酶，优选蛋白酶例如蛋白酶K，和含有离液化合物优选例如离液盐和/或去污剂，优选非离子型去污剂的裂解剂。从而，发生按照步骤(a.)预处理的样品材料的消化。按照一个实施方式，在核酸结合到运载体材料之前，按照步骤(a.)预处理的样品材料在步骤(c.)中与至少一种蛋白水解酶和至少另一种裂解剂接触并且孵育，该裂解剂优选含有离液盐。按照一个实施方式，孵育步骤的持续时间是至少3分钟，优选至少5分钟，优选至少10分钟，特别优选至少15分钟，并且优选在使用的蛋白水解酶活动增加的温度下进行。优选地，在至少35°C，至少40°C，至少50°C，至少55°C或至少60°C下进行所述孵育步骤。优选地，在35°C -70°C，优选40°C -65°C的温度范围内进行所述孵育。特别优选地，使用蛋白水解酶和含有离液剂的裂解剂的组合。此消化步骤的细节也在下文中解释。按照一个优选的实施方式，下列孵育中加入至少一种醇和/或至少一种离液剂用于调节结合条件。此实施方式在下文中更详细解释(具体参见部分步骤c.1)和c.2))。
[0113]按照第四个实施方 式，在步骤(a.)中用于样品材料预处理的试剂没有任何裂解性质并且因此不能裂解所述样品材料。
[0114]如所述，上述实施方式也能够互相组合。
[0115]按照本发明，步骤(a.)中样品材料的制备能够以多种方式发生，例如，通过向提供的样品材料加入本发明所述试剂或以相反的顺序，通过向提供的试剂加入样品材料。在步骤(a.)中试剂和样品材料优选以下列比例一起加入:1+4(V至4+1 (Vwfl^V样品材料 )，优选 1+2 (Vwflj+V

样品材料 )至2+1 (V试剂+V

样品材料 )并且特别优选1+1 (V试剂+V
样品材料)。
应优选进行后续的混合步骤(b.)。
[0116]本发明所述步骤(a.)中的预处理以及任选的步骤(b.)之后是分离和/或纯化的步骤(c.)。任选地，本发明所述试剂和从步骤(a.)或步骤(a.)及步骤(b.)得到的样品材料的组合物在步骤(c.)之前能够进一步加工和/或处理，例如通过加入另外的制剂或通过分离单独组分。为简明起见，从相应的中间步骤得到的组合物也能在本申请内容中表示为本发明所述试剂和从步骤(a.)或步骤(a.)及步骤(b.)得到的样品材料的组合物。
[0117]取决于实施方式的步骤(c.)能够具有几个子步骤，基本上与任意类型的用于分离核酸的方法一起发挥功能。按照一个实施方式，在步骤(c.)中核酸的分离和/或纯化包括至少一个下列子步骤C.1)和C.2)，优选包括这两个子步骤:
[0118]c.1)本发明所述试剂与从步骤(a.)或步骤(a.)和步骤(b.)得到的样品材料的组合物的消化。该消化特别用于样品材料中可能存在的任意蛋白和可能存在的任意其他污染样品组分的变性和/或降解。此外，取决于样品材料，这个步骤也用于从例如络合物质中释放样品材料中所含核酸的目的。在这个消化步骤C.1)中，可使用经典裂解剂，例如蛋白水解酶，尤其是蛋白酶，优选例如蛋白酶K和含有至少一种离液化合物优选例如离液盐和/或至少一种去污剂优选非离子型去污剂的的裂解剂。合适裂解剂的优选实施方式也如下所述(参见例如下述步骤(c.)的优选实施方式的子步骤ii中使用的制剂)。例如，能够优选用于步骤c.1)的其他裂解剂也在W02009 / 144182中描述，其通过引用纳入。按照一个优选的实施方式，使用至少一种蛋白水解酶和至少一种额外裂解剂进行步骤c.1)中的消化，所述裂解剂包括至少一种离液化合物和/或至少一种去污剂，优选至少一种非离子型去污剂。对于消化步骤，按照一个实施方式，在步骤c.1)中，按照步骤(a.)预处理的样品材料与至少一种蛋白水解酶和至少一种额外裂解剂接触并且孵育，所述裂解剂优选含有至少一种离液化合物。孵育步骤的持续时间优选至少3分钟，优选至少5分钟且特别优选至少10分钟，并优选在蛋白水解酶活性提高的温度下进行。优选地，在至少30°C，在至少35°C，至少40°C，至少50°C，至少55°C或至少60°C下进行所述孵育步骤。优选地，在35°C -70°C,优选40°C _65°C的温度范围内进行所述孵育。特别优选地，使用蛋白水解酶和含有离液剂的裂解剂的组合。
[0119]c.2)优选通过结合到运载体材料来分离核酸。核酸结合运载体材料优选是核酸结合固相，其能够例如选自含有二氧化硅的材料、硅胶、二氧化硅、玻璃、沸石、氧化铝、二氧化钛、二氧化锆、高岭土、陶瓷、聚合运载体材料例如聚亚烷基(polyalkylene)，例如PE、PP或PE / PP和聚苯乙烯珠。最终，起决定性作用的是所述运载体材料能够在选定结合条件下结合到核酸上。能够用官能团例如阴离子交换基团修饰所述运载体材料，或者其能是未修饰的并且因此在表面不含额外的官能团。其他合适的运载体材料也如下描述。按照一个实施方式，能够通过步骤c.1)中使用的裂解剂调节或预定义结合条件，例如如果后者包括合适浓度的离液化合物。相应的 结合步骤在现有技术中描述，例如US5，234，809。然而，优选地，为了调节结合条件，加入结合剂，其包括至少一种醇，优选具有1-5个碳原子的支链或直链烷醇，尤其优选异丙醇。所述结合剂还能够包括至少一种离液化合物，优选离液盐和/或至少一种去污剂。所述去污剂优选是非离子型去污剂。优选实施方式也如下描述(参见例如下述步骤(c.)的优选实施方式的子步骤iv中使用的制剂)。能用于步骤c.2)的其他结合剂描述于例如W02009 / 144182，其通过引用纳入。核酸结合到运载体材料之后优选是从剩余样品中分离核酸。如果使用磁性二氧化硅颗粒，这通常在磁场协助下一般通过从剩余样品中分离结合到所述运载体材料的核酸来发生。任选地，所述核酸随后能进行洗涤和洗脱。
[0120]按照一个特别合适的实施方式，步骤(c.)中核酸的分离和/或纯化包括下列子步骤:
[0121]1.任选地，优选在没有支链或直链烷醇的情况下，通过向样品材料和试剂的组合物(其任选混合)加入一种或多种酶，优选蛋白水解酶如蛋白酶K，任选与含有离液剂的试剂组合来降解蛋白和/或污染样品组分。
[0122]i1.加入制剂，所述制剂包括至少一种离液化合物和/或至少一种选自非离子型去污剂的去污剂，优选选自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22个碳原子的脂肪醇部分，并且包括含有2-150个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯部分，优选用于调节或预定义用于核酸结合的结合条件。
[0123]ii1.优选在按照i加入的酶活性提高的温度下，优选35°C以上的温度(蛋白水解酶的合适温度也如上述)，任选混合和/或孵育。
[0124]iv.加入制剂，所述制剂包括至少一种具有1-5个碳原子的支链或直链烷醇，和任选地额外离液化合物和/或任选地选自非离子型去污剂的去污剂，优选选自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括一个具有6-22个碳原子的脂肪醇部分并包括一个含有2-150个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯部分，以调节用于结合核酸的结合条件。
[0125]V.核酸结合到运载体材料上，优选含有二氧化硅、玻璃纤维、聚亚烷基，例如PP、PE / PP、PE，其中所述运载体材料以颗粒形式作为非织造织物、纤维、凝胶基质或膜使用，优选作为柱填充材料，其中所述颗粒优选采用珠的形式，优选磁性颗粒，并且优选作为磁性珠；其他合适的运载体材料的实施方式如上述或下述。
[0126]v1.任选地，用一种或多种制剂洗涤结合的核酸，所述制剂作用作洗涤剂，优选包括至少一种具有1-5个碳原子的支链或直链醇，和此外任选的离液化合物，和/或任选来自非离子型表面活性剂的去污剂。
[0127]vi1.任选用一种或多种制剂洗脱，其用作洗脱剂，优选包括在缓冲介质中的至少一种络合剂。
[0128]如果样品材料和本发明所述试剂的组合物含有蛋白和/或污染样品组分，其可能干扰后续的核酸分离和/或纯化，则任选地，在步骤i中能够发生蛋白和/或其他样品污染组分的降解(指代下文的裂解，无论样品材料是否含有细胞)。样品材料和本发明所述试剂的组合物能够混合或不混合即用于该步骤，其中例如通过加入一种或多种酶，例如蛋白水解酶如裂解酶和/或蛋白酶，并且优选蛋白酶K进行所述降解。任选地，通过向反应混合物加入变性化合物例如离液剂可促进所述降解，其中在所得裂解反应混合物中优选没有支链或直链烷醇。通常，这也造成`样品的进一步消化。因此优选实施步骤i。
[0129]在步骤ii中向样品材料和本发明所述试剂的裂解反应混合物的组合物，或样品材料、本发明所述试剂和蛋白降解酶的裂解反应混合物的组合物，或样品材料、本发明所述试剂、蛋白降解酶和含有离液剂的试剂的裂解反应混合物的组合物中加入优选用作调节和/或预定义用于结合核酸与运载体材料的结合条件的制剂。该制剂包括至少一种离液化合物和/或至少一种选自非离子型去污剂的去污剂，优选选自聚氧乙烯-脂肪醇醚的组。该组的分子包括具有6-22个碳原子的脂肪醇部分，以及含有2-150个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯部分。所述制剂能够优选用作所有组分的优选混合物，或能够以任意顺序或任意组合的预先混合形式连续加入单独组分。所述制剂通常也支持蛋白的降解和/或样品的进一步消化。相应的裂解剂通常能够优选在本发明所述方法的范围内用作裂解剂(例如，在上述子步骤c.1)中)。
[0130]也能够通过以可变的顺序一起加入单独组分或通过加入两种或多种组分的混合物，得到所述样品材料、本发明所述试剂的组合物、蛋白水解酶和任选地离液剂以及包括用于调节和/或预定义结合条件的离液化合物和/或至少一种去污剂的制剂:
[0131]a)向样品材料与本发明所述试剂的混合或未混合的组合物中加入1.)蛋白水解酶，2.)制剂(优选按照ii)，其包括优选用于调节和/或预定义结合条件的离液化合物和/或去污剂，[0132]b)向样品材料与本发明所述试剂的混合或未混合的组合物中加入1.)蛋白水解酶，2.)离液剂，3.)制剂(优选按照ii)，其包括优选用于调节和/或预定义结合条件的离液化合物和/或去污剂，
[0133]c)向样品材料与本发明所述试剂的混合或未混合的组合物中加入1.)离液剂，
2.)蛋白水解酶，3.)制剂(优选按照ii)，其包括优选用于调节和/或预定义结合条件的离液化合物和/或去污剂，
[0134]d)向样品材料与本发明所述试剂的混合或未混合的组合物中加入1.)蛋白水解酶和离液剂的混合物，2.)制剂(优选按照ii)，其包括优选用于调节和/或预定义结合条件的离液化合物和/或去污剂，和/或
[0135]e)向样品材料与本发明所述试剂的混合或未混合的组合物中加入蛋白水解酶、任选离液剂和制剂(优选按照ii)的混合物，其包括优选用于调节和/或预定义结合条件的离液化合物和/或去污剂。
[0136]如前所解释，单独组分的共同加入能够以两种方式发生:样品材料和本发明所述试剂的组合物能如下加入:1.加入用于分离和/或纯化(例如按照步骤i和ii)的试剂或
2.通过加入可得到这些试剂。样品材料和本发明所述试剂的组合物也包括额外的组分，例如其在步骤(a.)中的预处理之后但在步骤(c.)的分离之前加入。
[0137]加入单独制剂之后任选是混合或孵育(例如按照步骤iii)。
[0138]按照一个实施方式，为了调节结合条件，向从样品材料中得到的组合物、本发明所述试剂、任选的蛋白水解酶、任选的离液裂解剂和包括用于调节和/或预定义结合条件的离液化合物和/或去污剂，但优选不含支链或直链烷醇的制剂中加入按照步骤iv的另一种制剂。前述制剂是含有烷醇的并且用作调节用于结合核酸与运载体材料的结合条件。按照一个实施方式，所述制剂包括至`少一种具有1-5个碳原子的支链或直链烷醇，以及还任选包括离液化合物和/或任选来自非离子型去污剂的去污剂。所述非离子型去污剂优选选自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22个碳原子的脂肪醇部分并且包括含有2-150个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯部分。例如，能够通过两种不同的方式向优选不含支链或直链烷醇的所述组合物加入含有烷醇的制剂:a)向制备的反应混合物中加入含有烷醇的制剂，b)向制备的含有烷醇的制剂加入反应混合物。含有烷醇的相应制剂通常能够优选在本发明所述方法的范围内用于调节结合条件(例如，在上述子步骤c.2)中)。
[0139]优选在此之后，在下一个步骤中，通过结合到运载体材料上来调节结合条件，所述材料优选含有二氧化硅、玻璃纤维、聚亚烷基，例如PP、PE / PP、PE。能用于本发明所述方法的其他合适运载体材料也已经如上所述。所述运载体材料能够以颗粒的形式，作为非织造织物、作为纤维、作为凝胶基质、作为膜和优选作为柱填充材料使用。所述颗粒优选采用珠的形式，并且从而优选作为磁性颗粒，优选作为磁性珠。特别优选地，使用二氧化硅材料。然后优选使用具有二氧化硅或玻璃表面的磁性颗粒。这些本质上能是珠状或球形的并且优选具有0.02-30 u m,优选0.05-15 u m并且特别优选0.1-10 y m范围内的粒度。优选用于本发明所述方法的磁性二氧化硅颗粒描述于例如国际专利申请WOOl / 71732，其在此通过引用全文纳入。磁性二氧化硅颗粒优选使本发明所述方法易于自动化。例如能够以两种不同的方式实现向制备用于结合的反应混合物加入运载体材料:a)向制备的反应混合物中加入运载体材料，b)向制备的运载体材料加入反应混合物。[0140]在来自样品材料的核酸结合到运载体材料之后，任选用一种或多种制剂在一个或多个步骤中洗涤已结合的核酸(例如按照步骤vi)，所述制剂用作洗涤剂。优选地，这些制剂包括至少一种具有1-5个碳原子的支链或直链醇，以及还任选包括离液化合物和/或任选来自非离子型表面活性剂的去污剂。
[0141]任选地，在这之后(例如在步骤vii中)是洗脱已结合核酸和任选用一种或多种用作洗脱剂的制剂洗涤的核酸。洗脱剂在现有技术中熟知。优选地，它们包括至少一种在缓冲环境中的络合剂。对于一些方法，例如一些基于聚合酶链式反应的方法，其即使在核酸与运载体材料结合的情况下也能检测核酸，在这种情况下能够省略用洗脱剂的洗脱。
[0142]上述特别优选的步骤(c.)的实施方式-分离和/或纯化，是基于核酸与运载体材料的结合。也能够使用与该方法不同的核酸分离和/或纯化方法，例如也包括其中污染物结合到运载体材料的方法和基于核酸沉淀的核酸分离方法。
[0143]本发明所述用于核酸分离和/或纯化的方法包括一个任选步骤用于至少一部分经分离核酸的定量和/或定性检测，如最后的步骤(d.)。对于检测，通常足以检测经分离核酸的合适核酸片段。优选通过特定待检测核酸片段的核酸扩增方法作为定量检测完成该步骤。相应的检测方法在现有技术中熟知并且不需要额外的解释。
[0144]按照一个实施方式，检测了至少一部分经分离的靶标核酸，其中优选进行定量检测。按照此实施方式，本发明所述方法宜具有如下LOD(检测限):lpg，优选0.lpg，特别优选0.01pg的样品中靶标核酸，从所述样品中检测靶标核酸。
[0145]由于按照本发明的预处理，从非常不同的样品材料中高效、有效和可靠地分离甚至如此少量的核酸，并且因此允许定量确定所研究样品中的靶标核酸量是可能的。当然，所述样品也能含有量大得多的靶标核酸。本发明所述方法的检测下限的优点具体是能够检测到甚至如此小的量并且因此能确保所述方法得到在Pg范围(或更高)内的可靠结果，即使样品材料差异显著。
[0146]在经分离靶标核酸的后续检测中，所分离靶标核酸的回收率优选是至少50%，优选至少75 %，尤其优选至少85 %。
[0147]按照本发明，除了上述的基本步骤(a.)_(d.)，也可能在上述步骤(a.)_(d.)之前或之后实施额外的步骤(并且例如在已经描述的步骤(c.)部分步骤之前或之后)。按照一个实施方式，能够在按照本发明的方法中额外完成后续方法步骤中的至少一个。如果待分离样品材料的核酸封闭在细胞中，通常需要从细胞裂解开始作为第一步骤，用于释放核酸并且因此能在步骤(a.)中使用本发明所述试剂进行有效预处理。能够通过现有技术已知的方法进行细胞裂解。一般的方法考虑向样品材料中加入含有离液剂的水性制剂和/或蛋白裂解酶，以用于细胞污染物的降解。然而，也能够使用其他方法以从细胞中释放核酸，包括机械方法。按照一个实施方式，由此完成样品材料中所含细胞的裂解。在此，优选在向样品材料加入本发明所述试剂之前并且因此在步骤(a.)之前进行所述裂解。
[0148]在细胞裂解之后，在步骤(a.)中向包括释放核酸的相应预处理样品材料加入本发明所述试剂之前，能够实施一个或多个后续的纯化步骤，特定用于去除细胞碎片。例如，能够通过过滤进行细胞片段的粗分离。按照一个实施方式，在步骤(a.)中向样品材料加入本发明所述试剂之前，样品材料不含细胞片段和/或一个或多个连续步骤中样品材料的分子和/或离子组分。[0149]向样品材料加入本发明所述试剂后，优选进行孵育步骤，以确保所述试剂对于样品材料的适当影响。优选地，在孵育之前混合所述试剂与样品材料。
[0150]本发明所述方法的一个具体应用是从产品，尤其是生物药物的生物技术生产过程得到的样品材料中纯化核酸。如开始所述，生物技术产品具体例如生物药物的纯化需要例如一个或者多个连续的纯化步骤，其通常是色谱步骤，通过这些步骤分离了例如细胞片段、分子和/或离子组分和其他污染物，以得到尽可能纯的生物药物。特别重要的是显著减少宿主生物的残留污染物和/或其他污染物，例如为了符合医药产品的规定。出于这个原因，分析在纯化过程中得到的生物处理样品，尤其是最终纯化的生物药物，例如宿主细胞的污染核酸，该宿主细胞用于生物药物的生产。成功纯化的评价需要定量检测可能仍含有的核酸污染物，例如宿主细胞核酸的残留量。本发明所述方法能够例如有效和可靠纯化宿主核酸或其他核酸污染物，即使这些核酸必须从非常不同的生物处理样品中分离，具体例如来自用于生物技术产品的纯化过程中得到的各种纯化部分，和/或这些核酸在样品材料中仅以少量存在。按照本发明所述方法的一个优选实施方式，在完成本发明所述后续步骤(b.)(任选的)、(c.)和(d.)(任选的)之前，在步骤(a.)中向纯化部分加入本发明所述试剂。纯化部分也能包括最终的、纯化的终产品。
[0151]按照本发明的方法能够从各种样品材料分离核酸，尤其例如DNA和RNA，其中所述核酸特定以少量存在。在上述说明书中提及合适的样品材料，并且在下文中详述实施例。按照本发明，已经加工的样品材料也能够用作样品材料，例如已经以一些其他方式裂解、过滤和/或预处理的样品材料，尤其是纯化前的样品，其中待纯化核酸优选不包封在细胞内。在本发明所述方法的步骤(a.)中用特定试剂预处理这些加工的样品材料，从而如前解释，显著改善了后续的核酸分离和/或纯化，尤其是在不同样品材料的情况中。
[0152]包括大多数情况下在样品材料中少量存在的待分离核酸的优选样品材料具体包括下组:
[0153]第一组的合适样品材料包括具有水性组合物的样品材料并且优选是来自纯化过程的纯化部分。按照一个实施方式，所述纯化部分是水性样品材料，除了待纯化核酸以外其还包括一种或多种缓冲物质和/或盐。在纯化部分中经常含有的缓冲剂示例是乙酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硫酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液。在纯化缓冲液中通常使用的生物缓冲剂是ACES、ADA、BES、BICINE、BIS-TRIS、CHES、柠檬酸盐、甘氨酸、Gly-Gly、HEPES、HEPPS、咪唑、MES、MOPS、PIPES、磷酸盐、TAPS、TES、TRICINE 和 TRIS。尤其在纯化部分中出现的常见盐是碱金属和碱土金属的金属离子以及铵作为阳离子的氯化物、硫酸盐、磷酸盐，以及任选Zn、Cu、N1、Fe盐(如果IMAC如N1-NTA用作纯化步骤)。按照一个实施方式，所述样品材料是色谱洗脱液，其任选也以进一步加工的形式提供。优选地，所述样品材料是在生物技术产品具体例如生物药物的纯化过程中得到的纯化部分。因此，样品材料能够含有例如生物分子和/或生物体，其中在本申请的意义上，生物分子指活生物体中出现的分子。在样品材料中含有的生物分子和/或生物体能够具有至少一种下列性质:
[0154]1.所述生物分子和/或生物体选自肽、多肽、蛋白、核酸、病毒和/或疫苗。所述核酸优选是DNA、RNA、质粒和非编码小RNA，尤其是例如小干扰RNA(siRNA)，
[0155]i1.所述生物分子和/或生物体是药学上活性物质，[0156]ii1.所述生物分子是合成或生物技术学产生的，和/或
[0157]iv.所述生物分子和/或生物体是生物药物。
[0158]这组样品材料尤其包括在药物和生物技术产业领域中出现的样品材料。该组特定包括生物处理样品，具体例如在生产过程中得到的生物技术产品和样品材料，尤其是在生物技术产品的纯化过程中得到的纯化部分。典型示例是从柱-色谱纯化过程中得到的纯化部分。相应的生物处理样品特定出现在产品尤其例如生物药物的生物技术学生产中。对作为诊断助剂或治疗药剂的生物药物是特别感兴趣的，具体例如治疗性肽、寡肽、多肽和蛋白，尤其是重组产生的生长因子、激素、细胞因子和治疗性抗体，这仅仅列举了生物药物的一些典型示例。然而，按照一个实施方式，所述生物药物也包括病毒、疫苗和核酸，如DNA、RNA和质粒。在前序部分中也提及了其他示例，并且在此通过引用纳入相应的公开文件。
[0159]由于所述生物技术学生产过程，生物处理样品通常含有两种生物技术学生产的产品，例如生物药物以及所用培养基和/或宿主生物各自宿主细胞的污染物，如待分离的宿主核酸等。此外，生物处理样品也可能由其他核酸污染，例如病毒核酸。例如，通常在纯化过程中采用特定措施以降低在生物产品中病毒核酸的比例。在纯化工艺的过程中，通常生物处理样品中生物技术产品的纯度增加，并且在纯化工艺中追求的目标之一是使污染核酸的量减少至最低。用于生物药物的剩余宿主核酸和或其他核酸污染物例如病毒核酸代表纯化终产物中的潜在危险污染物，并且因此优选在纯化的终产物和/或在一个或多个纯化过程所得生物处理样品中得到定量检测，例如为了能够向管理当局证明没有超过污染核酸的最大允许限度或最大推荐限度。基于其特定灵敏度、可靠性和实施简易性，本发明所述方法是特别适合此目的的核酸分离方法。
[0160]另外，该组也包括在化学合成领域中得到的样品材料，例如含有SiRNA分子的样品，其在合成之后经过例如色谱纯化过程，并且可以设想其通过本发明所述方法的后续定量和浓缩。
[0161]按照一个实施方式，样品材料尤其是例如生物处理样品，基本不含细胞。按照一个实施方式，所述样品材料不是在核酸扩增过程中得到的样品，特定例如PCR过程。
[0162]第二组包括少量待分离和/或纯化核酸的合适样品材料包括人或动物体组分，选自体液、体细胞和/或体组织，优选血液、血组分、血清、脑脊液、粘膜涂片、痰液、尿、粪便、精液和组织样品。这些身体组分优选含有一种或多种下列分子和/或生物体:
[0163]i.游离循环的人或动物核酸(DNA、RNA)，例如游离循环的胎儿核酸、来自恶性和/或非恶性肿瘤的核酸、来自凋亡细胞的核酸、非编码小RNA如微小RNA(miRNA)和siRNA,
[0164]ii.来自微生物的游离循环核酸，优选来自病原体，尤其优选来自原生动物、细菌和病毒，
[0165]iii.微生物,优选病原体,尤其优选原生动物、细菌和病毒。 [0166]此组特定包括在分子医学诊断中感兴趣的样品材料，但具体仅含有少量待检测的靶标核酸。这包括例如下列含有核酸的样品材料:血液产品，尤其是例如包括待分离短链游离循环胎儿核酸的母体血液、血浆或血清，包括游离循环肿瘤核酸的血液样品，来自包括游离核酸的凋亡组织的组织样品，以及用于检测非编码小RNA具体例如miRNA和SiRNA的组织样品。另外，例如，也包括来自感染的人或动物的血液样品，其病原体或病原体的降解产物尤其是它们的核酸在血液中存在。
[0167]第三组合适的样品材料包括在法医学核酸诊断中分析的样品材料。这些样品优选选自含有细胞和/或核酸和/或生物体的液体和固体材料。如果需要分析的材料是固体，在液体中提取该材料中或之上含有的细胞和/或核酸和/或生物体，从而它们能够在按照本发明用于核酸分离和/或纯化的方法中使用。
[0168]这组样品材料的特征具体是潜在无限多样的样品材料，其包括所有可能携带或含有核酸的材料，但特定通常仅含有较小痕量的待检测核酸。因此，按照本发明的方法特别有利，因为其能够有效和高效地分离在样品中仅以极低浓度存在的核酸，其中所述样品材料甚至非常不同的组成对于所述方法没有负面影响。由于不需要对于各种样品材料的特定单独预处理，本发明所述方法能够对非常多样化的法医学样品进行宽泛、标准、自动化和同步的核酸筛选。由此，可设想通过本发明所述方法，样品材料也能用作法医学证据，由于非常低含量的核酸，用现有技术中已知的方法不能从中分离足够量的核酸。因此，可以设想更广泛的基于更大数量和样品类型的分子诊断，其能产生新的和/或进一步的结果并且能因此提供可靠性提高的法医学调查结果。
[0169]第四组合适的样品材料包括具有样品组分和任选生物体的组合物。该组合物的样品组分优选选自食物或其组分和环境组分，优选土壤、水和植物，其中该组分溶于或重悬于样品材料。如果所述样品组分是水，水样品是所述组合物的组分或需要分析的样品本身。该组的样品材料因此包括含有核酸的样品，其用于食物和环境诊断中的核酸分析领域。例如，在食物生产和监测中，重要的是能够基于微生物核酸通过分子方法检测食物中甚至轻微的微生物污染。通过分子基础上的快速检测方法而不是经典方法如耗时的生物培养，从水样品中检测病原体是非 常重要的。这也应用于土壤和植物样品的分析，就共生体而言对其分析监测也令人感兴趣。因此，可以设想检测来自细菌、病毒、真菌和/或原生动物的核酸。甚至轻微污染的样品尤其在监测诊断的领域中提供了重要信息，从而本发明所述方法特别合适，用该方法能在污染生物体消化之后检测到少量的核酸。属于该组的样品材料也能在其组成和性质例如其PH和/或盐含量方面有显著变化。因此，按照本发明的方法也特别有利，因为本发明所述预处理允许从非常不同的样品中高效、有效和可靠地纯化甚至极少量的核酸，而不需要事前单独调整/调节样品材料和/或纯化过程。
[0170]在第一组样品材料中的生物技术学生产的产品具体例如生物药物，优选通过遗传修饰或未修饰的生物体和/或细胞生产。在原核和真核细胞中都生产生物技术产品。低等和高等真核生物的细胞用作真核细胞。这些生物体和/或细胞优选选自来自哺乳动物的细胞系、来自鸟类的细胞系、来自昆虫的细胞系、来自鱼类的细胞系、来自植物的细胞系和微生物，其中来自哺乳动物的细胞系优选包括下列细胞系:人细胞系、来自马细胞的细胞系、来自牛细胞的细胞系、来自猪细胞的细胞系、来自袋鼠细胞的细胞系、来自绵羊细胞的细胞系、来自猴细胞的细胞系、来自狗细胞的细胞系、来自猫细胞的细胞系、来自貂鼠细胞的细胞系、来自兔细胞的细胞系、啮齿动物细胞系、来自仓鼠细胞的细胞系、来自大鼠细胞的细胞系和来自小鼠细胞的细胞系，并且特别优选细胞系Hek293(人胚胎肾细胞系)、HeLa (人宫颈癌)、Vero (正常成年非洲绿猴的肾脏)、MDCK (可卡犬肾)、CH0 (中国仓鼠卵巢细胞)、SP2 (小鼠骨髓瘤)、NSO (小鼠骨髓瘤)、杂交瘤细胞系和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。按照一个实施方式,所用的宿主细胞是永生化细胞。所述微生物优选包括细菌和酵母，并且特别优选大肠杆菌(Escherichia coli)。如引言所述，能够使用遗传工程技术修饰各细胞以能够产生感兴趣的产物，例如能够通过例如使用载体重组引入编码感兴趣产物如肽或蛋白的基因。然后各修饰细胞能够生产感兴趣产物。另外，能够使用细胞尤其是细菌或酵母细胞通过细胞的酶机器从前体分子产生需要的产物。
[0171]按照另一方面，本发明提供了用于从样品材料分离和/或纯化核酸的方法的试剂，尤其是用于样品材料的制备，其中所述试剂至少包括下列组分:
[0172]a.至少一种或多种含氨基的化学物，所述化合物选自下组中的一种或多种:
[0173]1.极性-中性蛋白性a -氨基羧酸，优选天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸，
[0174]i1.非极性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸，优选丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和缬氨酸，
[0175]ii1.碱性a-氨基羧酸，优选精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸，
[0176]iv.非蛋白性氨基羧酸，选自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高丝氨酸和D-缬氨酸，
[0177]V.氨基羧酸聚合物，包括至少一种在(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸，优选0.5kDa-300kDa的大小，优选形成自相同、两种或多种不同的氨基羧酸单体，优选与卤化物联合，优选选自聚-L-赖氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚-L-赖氨酸盐酸盐、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-赖氨酸)氢溴酸盐、聚-L-鸟氨酸，优选氨基羧酸聚合物由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸组成，
[0178]v1.来自2-4个氨基羧酸的肽，包括至少一种(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸，其中所述肽包括的氨基羧酸优选选自相同或不同的(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸，优选甘氨酸二聚体、甘氨酸三聚体和甘氨酸四聚体，并且优选所述肽由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸组成，`
[0179]vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相独立地选自氢、烷基、羟基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相独立地选自氣、烷基、羟基烷基，其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链的，是饱和或不饱和的并且其中R1、!?2、!?3和R4中的至少一个不是氢。一个、两个、三个、四个或五个羟基能够以羟基烷基的形式存在。二(羟基烷基)基团和三(羟基烷基)基团也是合适的。通式(I)的化合物优选选自N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二(2-羟基乙基)甘氨酸(bicine),
[0180]vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相独立地选自氢和羟基烷基，并且其中R5、R6和R7互相独立地选自氢、烷基和羟基烷基，其中优选R5、R6和R7中的至少一个是羟基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链，饱和或不饱和的。一个、两个、三个、四个或五个羟基能够以羟基烷基的形式存在。二(羟基烷基)基团和三(羟基烷基)基团也是合适的。化合物(II)优选是三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)，
[0181]以及至少一种或多种下列组分:
[0182]b.至少一种去污剂或去污剂的混合物，优选选自非离子型表面活性剂，包括烷基葡糖苷和/或聚氧乙烯烷基苯基醚，
[0183]c.至少一种络合剂或络合剂的混合物，
[0184]d.至少一种蛋白或蛋白的混合物，优选所述蛋白是优选选自白蛋白和/或球蛋白的球状蛋白，[0185]其中，如果所述试剂含有一种或多种组(1.)、(i1.)、(ii1.)和/或(v1.)的组分，所述试剂额外包括至少一种蛋白或蛋白混合物，其中所述蛋白优选是优选选自白蛋白和/或球蛋白的球状蛋白。
[0186]因此，本发明所述试剂适合各种用以制备用于后续核酸分离和/或纯化的样品的实施方式。用所述试剂的预处理能够从非常不同的样品材料中有效并且甚至定量分离核酸，即使所述样品材料仅含有极少量的核酸。对于一些样品材料，核酸纯化仅当用本发明所述试剂进行预处理时是可能的，如在实施例中所不。
[0187]在含有化合物三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)的本发明所述试剂的一个【具体实施方式】中，所述制剂不含有EDTA和/或EGTA。
[0188]所述试剂含有至少一种包括氨基的化合物，但也能够含有几种相应的化合物。如果存在两种或更多种包括氨基的化合物，优选存在组(1.)之内和/或之间的组分的混合物。
[0189]例如，能够包括一种或多种极性-中性蛋白性a -氨基羧酸，如天冬酰胺和/或半胱氨酸和/或谷胺酰胺和/或甘氨酸和/或苏氨酸和/或丝氨酸。此外，所述试剂中还能包括一种或多种非极性-疏水性蛋白性a -氨基羧酸，例如丙氨酸和/或亮氨酸和/或异亮氨酸和/或甲硫氨酸和/或脯氨酸和/或缬氨酸，以及一种或多种碱性a -氨基羧酸如精氨酸和/或赖氨酸和/或鸟氨酸。也能包括一种或多种非蛋白性氨基羧酸，例如P -丙氨酸和/或D-丙氨酸和/或L-高丝氨酸和/或D-缬氨酸。所述试剂中还能包括氨基羧酸聚合物，所述氨基羧酸聚合物可优选从相同或者两种或更多种不同的氨基羧酸单体中形成，所述氨基羧酸单体选自极性-中性蛋白性a-氨基羧酸组和/或非极性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸组和/或碱性a-氨基羧酸组和/或非蛋白性氨基羧酸组。所述试剂中还能包括来自2-4个氨基羧酸的肽，所述肽可优选从相同或不同的氨基羧酸中形成，所述氨基羧酸选自极性-中`性蛋白性a-氨基羧酸组和/或碱性a-氨基羧酸组和/或非极性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸组和/或非蛋白性氨基羧酸组。此外，所述试剂中也能包括一种或多种通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相独立地选自氢、烷基、羟基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相独立地选自氣、烷基和羟基烷基，其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链的，是饱和或不饱和的并且其中R1、R2、R3和R4残基中的至少一个不是氢。一个、两个、三个、四个或五个羟基能够以羟基烷基的形式存在。二(羟基烷基)基团和三(羟基烷基)基团也是合适的。通式(I)的化合物优选选自N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和/或N,N_ 二(2-羟基乙基)甘氨酸(bicine)。另外，所述试剂中也能包括一种或多种通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相独立地选自氢和羟基烷基，并且其中R5、R6和R7互相独立地选自氢、烷基和羟基烷基，其中优选R5、R6和R的7残基中的至少一个是羟基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链，并且是饱和或不饱和的。一个、两个、三个、四个或五个羟基能够以羟基烷基的形式存在。二(羟基烷基)基团和三(羟基烷基)基团也是合适的。对应此通式的一个优选化合物是三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)化合物。合适的饱和或不饱和、支链或直链烷基组分示例已在上面联合所述试剂加以描述。这些在此应类似地使用。
[0190]除一种或多种包括一个氨基的所述化合物以外，本发明所述试剂包含至少一种或多种下列组分:至少一种去污剂和/或至少一种络合剂和/或至少一种蛋白，优选球状蛋白，其中每个组分能够以纯化合物或几种化合物的混合物的形式存在，例如，以去污剂的混合物和/或络合剂的混合物和/或蛋白混合物的形式存在。如上述，这些额外组分对于预处理具有正面影响，因为其提高待纯化核酸的回收率。参考上述公开内容。
[0191]所述试剂的pH优选在pH3_pH9的范围内。
[0192]在所述试剂的实施方式中，如果所述试剂含有一种或多种组(1.)、(i1.)、(ii1.)和/或(v1.)的组分，其还含有至少一种蛋白或蛋白的混合物。即，如果所述试剂含有例如一种或多种极性-中性蛋白性a -氨基羧酸，例如天冬酰胺和/或半胱氨酸和/或谷胺酰胺和/或甘氨酸和/或苏氨酸和/或丝氨酸，和/或一种或多种非极性-疏水性蛋白性a -氨基羧酸，例如丙氨酸和/或亮氨酸和/或异亮氨酸和/或甲硫氨酸和/或脯氨酸和/或缬氨酸，和/或一种或多种碱性a -氨基羧酸，例如精氨酸和/或赖氨酸和/或鸟氨酸，和/或来自2-4个氨基羧酸的肽，所述氨基羧酸优选选自相同或不同的来自以下的氨基羧酸:极性-中性蛋白性a -氨基羧酸组(1.)和/或非极性-疏水性蛋白性a -氨基羧酸组(i1.)和/或碱性a -氨基羧酸组(ii1.)和/或非蛋白性氨基羧酸组(iv.)，例如^ -丙氨酸和/或D-丙氨酸和/或L-高丝氨酸和/或D-缬氨酸。所述试剂中包括的蛋白优选是球状蛋白，其优选选自白蛋白和/或球蛋白。
[0193]向本发明所述试剂添加蛋白意外显示是有利的，其中用于样品材料预处理的所述试剂与所述样品材料接触。这增加了核酸纯化的效率，尤其是当所述样品材料仅含有低浓度的蛋白时。因此相应蛋白在本发明所述试剂中的应用改善了核酸纯化，尤其是当待处理样品材料仅包含少量的蛋白和/或在所含蛋白浓度方面有差异时。
[0194]按照本发明所述试剂的一个实施方式，含有组分Tris和/或N，N-二(2_羟基乙基)甘氨酸和/或N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸的实施方式中不含离液化合物。此实施方式的优势已经结合本发 明所述方法中相应试剂的使用来解释；参考上述公开内容。
[0195]按照一个实施方式中，本发明所述试剂包括大小为0.5kDa-300kDa的一种或多种氨基羧酸聚合物。所述氨基羧酸聚合物能够以来自相同氨基羧酸单体的均聚物或来自两种或更多种不同氨基羧酸单体的共聚物存在，其中所述单体在聚合物链中交替排列、随机分布，采用梯度或块状形式。两种聚合物类型都优选从下组的氨基羧酸单体中形成:(1.)极性-中性蛋白性a-氨基羧酸和/或(i1.)非极性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸和/或(ii1.)碱性a -氨基羧酸和/或(iv.)非蛋白性氨基羧酸，优选与氢卤化物如溴化氢或氯化氢联合。优选选择的化合物是聚-L-赖氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚-L-赖氨酸盐酸盐、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-赖氨酸)氢溴酸盐、聚-L-鸟氨酸。也包括从非蛋白性对映体形式形成的聚合物，例如聚-D-赖氨酸、聚-D-赖氨酸氢溴酸盐、聚(D-谷胺酰胺，D-赖氨酸)氢溴酸盐。
[0196]如果本发明所述试剂的一个实施方式包含来自2-4个氨基羧酸的肽，这些氨基羧酸优选选自下组的相同或不同的氨基羧酸:(1.)极性-中性蛋白性a-氨基羧酸和/或(i1.)非极性-疏水性蛋白性a -氨基羧酸和/或(ii1.)碱性a -氨基羧酸和/或(iv.)非蛋白性氨基羧酸。肽化合物优选在以下优选描述的分子间形成:天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、缬氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、P -丙氨酸、D-丙氨酸、L-高丝氨酸和D-缬氨酸，其中这些分子任意组合作为二聚体、三聚体或四聚体是可能的。来自2个氨基羧酸的肽化合物的合适例子已经在本发明所述方法的范围内，结合本发明所述试剂的使用来展示。参考上述公开内容。与组合自2个氨基羧酸的所述肽化合物类似，具有3-4个氨基羧酸的肽化合物是可能的。
[0197]优选地，来自2-4个氨基羧酸的肽是甘氨酸-甘氨酸二聚体，优选甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸三聚体并且优选甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸四聚体。
[0198]按照一个实施方式，在试剂中包括氨基的化合物和/或各种这些化合物的组合的总浓度是 5mM-500mM，优选 25mM-350mM，特别优选 50mM-250mM。
[0199]具有去污剂的本发明所述试剂的一个实施方式含有去污剂或去污剂的混合物，其优选选自非离子型表面活性剂，优选选自烷基葡糖苷和/或聚氧乙烯烷基苯基醚。烷基葡糖苷优选选自聚山梨酯，优选选自聚山梨酯20、聚山梨酯40和聚山梨酯80，并且特别优选聚山梨酯20 (吐温20)。聚氧乙烯烷基苯基醚的组优选包括辛苯聚醇9 (曲通X-100)和诺乃洗涤剂P-40。
[0200]按照一个实施方式，在所述试剂中，所述去污剂优选一种或多种非离子型表面活性剂的总浓度是0.1% (V / v) -5% (v / V),优选0.2% (v / v) -4% (v / v),并且优选0.5% (v / v) -3% (v / v)并且也优选 I % (v / v)-3% (v / v)。0.2% (v / v) -0.5%(v / v)的值已显示特别优选用于聚氧乙烯烷基苯基醚，例如曲通x-100。按照一个实施方式，当使用烷基葡糖苷，特别如聚山梨酯例如吐温20时，使用在约1% (v / v)-5% (v /v)水平的浓度。优选使用至少两种去污剂，其中一种去污剂优选选自聚氧乙烯烷基苯基醚而另一种去污剂选自烷基葡糖苷，例如聚山梨酯。特别优选地，本发明所述试剂含有曲通x-100和吐温20的组合。
[0201]按照一个实施方式， 本发明所述试剂含有络合剂或络合剂的混合物，选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(氨基乙基醚)-N，N'-四乙酸(EGTA)和/或乙二胺二琥珀酸(EDDS)。特别优选使用EDTA。在这个具有络合剂的实施方式中，在所述试剂中络合剂的总浓度优选是10mM-500mM，优选10mM-300mM，10mM-200mM并且更优选10mM-100mM。在本发明所述试剂的一个【具体实施方式】中，所述试剂含有化合物三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)，然而，所述制剂不含有EDTA和/或EGTA。
[0202]按照一个实施方式，本发明所述试剂含有蛋白或蛋白的混合物。按照一个实施方式，所述蛋白没有任何酶活性，优选所述蛋白不是酶。优选地，所述蛋白是优选选自白蛋白和/或球蛋白的球状蛋白。所述白蛋白优选选自动物白蛋白、植物白蛋白和/或人白蛋白，优选牛血清白蛋白(BSA)。所述球蛋白优选选自动物球蛋白、植物球蛋白和/或人球蛋白，优选Y-球蛋白。在试剂中，所述一种或多种蛋白的总浓度优选是Img / mL-100mg / mL,优选 2mg / ml-25mg / ml,优选 2mg / ml-10mg / ml 并且优选 4mg / mL-10mg / mL。对于IgG和BSA的使用，优选使用2mg / ml_25mg / ml,优选2mg / ml-10mg / ml并且优选4mg / mL-lOmg / mL。这些浓度是有利的，特别当使用球状蛋白，尤其是例如IgG和/或BSA 时。
[0203]按照本发明的试剂优选不含水性制剂，所述水性制剂含有总浓度> 5mM的磷酸盐和/或柠檬酸盐，因为这些对于核酸分离和/或纯化具有抑制效果。
[0204]按照一个实施方式，本发明所述试剂包括至少一个或多个含有氨基的化合物，所述氨基选自下述1-viii组中的一种或多种:
[0205]1.天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸，[0206]i1.丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和缬氨酸，
[0207]ii1.精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸，
[0208]iv.P -丙氨酸、D-丙氨酸、L-高丝氨酸和D-缬氨酸，
[0209]V.聚-L-赖氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚-L-赖氨酸盐酸盐、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-赖氨酸)氢溴酸盐、聚-L-鸟氨酸，
[0210]v1.甘氨酸二聚体、甘氨酸三聚体、甘氨酸四聚体和二肽(Ala-Glu)，
[0211]vi1.N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N，N-二(2_羟基乙基)甘氨酸(bicine)，
[0212]和/或
[0213]vin.三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris),
[0214]其中，如果所述试剂含有一种或多种组(1.)、(i1.)、(ii1.)和/或(v1.)的化合物，所述试剂另外包含至少一种蛋白或蛋白混合物，其中所述蛋白优选是优选选自白蛋白和/或球蛋白的球状蛋白。
[0215]下面描述了本发明所述试剂的特别优选的实施方式。在这些优选的实施方式中，所述试剂的单独组分优选以上面就单独组成部分描述的浓度存在，在这个方面参考上述公开内容。
[0216]按照一个优选的实施方式，本发明所述试剂包括至少甘氨酸、Gly-Gly、N_(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸和/或N`，N-二(2-羟基乙基)甘氨酸作为含氨基的化合物、至少一种络合剂(优选EDTA)以及至少一种，优选至少两种去污剂，优选曲通X-100和/或吐温20。
[0217]优选地,所述试剂还包括至少一种蛋白，优选球状蛋白如IgG或BSA。
[0218]在另一个优选的实施方式中，本发明所述试剂包括一个或多个来自天冬酰胺、谷胺酰胺、精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸的极性-中性和/或碱性a-氨基羧酸。添加相应的a -氨基羧酸在样品材料的预处理中也具有正面影响，尤其是当这些a -氨基羧酸与缓冲液组合时，特定在Tris或磺酸缓冲液中，例如HEPES或HEPPS缓冲液。另外，所述试剂优选包括至少一种蛋白，优选球状蛋白如IgG或BSA。
[0219]按照另一个优选的实施方式，本发明所述试剂包括氨基羧酸化合物谷胺酰胺、脯氨酸、聚-L-赖氨酸和/或聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)以及二肽(Ala-Glu)。优选地，其还包括络合剂例如EGTA，和至少一种、优选至少两种去污剂，尤其优选聚氧乙烯烷基苯基醚，如诺乃洗涤剂-P40和/或聚山梨酯，优选例如吐温20。所述试剂也包括球状蛋白以及优选一种或多种缓冲液，所述球状蛋白优选IgG，所述缓冲液优选一种或两种磺酸缓冲液，例如HEPES 和 / 或 HEPPS。
[0220]在另一个优选的实施方式中，本发明所述试剂包括至少一种、优选两种以下氨基羧酸化合物即3 -丙氨酸和聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)。优选地，其还包括络合剂例如EDTA，和至少一种、优选至少两种去污剂，尤其优选聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯，优选例如聚山梨酯40。优选地，所述试剂也包括球状蛋白和一种或多种缓冲液，所述球状蛋白优选IgG，所述缓冲液优选一种或两种磺酸缓冲液，例如HEPES和/或HEPPS。
[0221]按照另一个优选的实施方式，本发明所述试剂包括至少两种、优选所有的以下氨基羧酸化合物即半胱氨酸、丙氨酸、精氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐和三(羟基甲基)-氨基甲烷(Tris)。此外，如果所述试剂中含有一种或多种氨基羧酸化合物半胱氨酸、丙氨酸和/或精氨酸，该试剂包括球状蛋白，尤其是IgG。
[0222]在另一个优选的实施方式中，本发明所述试剂包括至少两种、优选所有的以下氨基羧酸化合物即丝氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、D-缬氨酸和聚-L-鸟氨酸。优选地，其还包括络合剂例如EGTA，和至少一种、优选至少两种去污剂，尤其优选聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯，优选例如吐温20。，如果所述试剂中含有一种或多种氨基羧酸化合物丝氨酸、甲硫氨酸和/或赖氨酸，所述试剂也包括球状蛋白，优选BSA。
[0223]在另一个优选的实施方式中，本发明所述试剂包括至少两种、优选所有的以下氨基羧酸化合物即苏氨酸、亮氨酸和鸟氨酸。优选地，其还包括络合剂例如EDDS，和至少一种、优选至少两种去污剂，尤其优选聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯，优选例如吐温20。所述试剂还包括至少一种蛋白和优选一种或多种缓冲液，所述蛋白优选球状蛋白如IgG或BSA，所述缓冲液优选一种或两种磺酸缓冲液，例如HEPES和/或HEPPS。
[0224]按照一个实施方式，本发明所述试剂没有任何裂解性质并且因此不能裂解样品材料，使所述试剂与所述样品材料接触以用于制备。
[0225]就核酸纯化应用本发明所述试剂以预处理样品材料能够从各种样品材料中分离和/或纯化核酸，即使它们仅以少量存在于样品材料中。另外，例如在本示例中所用，用本发明所述试剂预处理样品材料能够从样品材料中纯化核酸，而在不使用本发明所述试剂的情况下，用常规标准方法从这些样品材料中分离核酸是不可能的。需要纯化的核酸能选自单链或双链的真核、原核和病毒核酸，包括RNA、DNA和质粒。按照一个实施方式，需要纯化的核酸代表至少部分样品材料的污染。
[0226]另外，本发明提供了用于从生物处理样品中分离靶标核酸的方法，其优选包括至少一种生物药物,其中所述方法包括至少下列步骤:
[0227]a.用试剂预处理所述生物处`理样品，其中所述试剂包括至少一种或多种含氨基的化合物，所述化合物选自下组中的一种或多种:
[0228]1.极性-中性蛋白性a -氨基羧酸，优选天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸，
[0229]i1.非极性-疏水性蛋白性a -氨基羧酸，优选丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和缬氨酸，
[0230]ii1.碱性a-氨基羧酸，优选精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸，
[0231]iv.非蛋白性氨基羧酸，选自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高丝氨酸和D-缬氨酸，
[0232]V.氨基羧酸聚合物，包括在(1.)-(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸组成，优选形成自相同、两种或几种不同的氨基羧酸单体，优选与卤化物联合，优选选自聚-L-赖氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚-L-赖氨酸盐酸盐、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-赖氨酸)氢溴酸盐、聚-L-鸟氨酸，优选大小为 0.5kDa-300kDa,
[0233]v1.来自2-4个氨基羧酸的肽，包括至少一种(i)-(iv)中所述的氨基羧酸，优选由(1.)-(iv.)中所述的氨基羧酸组成，优选选自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同的氨基羧酸，优选是甘氨酸二聚体、甘氨酸三聚体和甘氨酸四聚体，[0234]vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相独立地选自氢、烷基、羟基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相独立地选自氣、烷基、羟基烷基，其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链的，是饱和或不饱和的并且其中R1、!?2、!?3和R4中的至少一个不是氢。一个、两个、三个、四个或五个羟基能够以羟基烷基的形式存在。二(羟基烷基)基团和三(羟基烷基)基团也是合适的。通式(I)的化合物优选选自N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二(2-羟基乙基)甘氨酸(bicine),
[0235]vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相独立地选自氢和羟基烷基，并且其中R5、R6和R7互相独立地选自氢、烷基和羟基烷基，其中优选R5、R6和R7中的至少一个是羟基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链，饱和或不饱和的。一个、两个、三个、四个或五个羟基能够以羟基烷基的形式存在。二(羟基烷基)基团和三(羟基烷基)基团也是合适的。化合物(II)优选是三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)，
[0236]b.优选混合所述试剂与生物处理样品，
[0237]c.从所述生物处理样品中分离和/或纯化核酸，所述样品已经与所述试剂接触和/或与所述试剂混合，
[0238]d.任选定量和/或定性检测至少一部分经分离的靶标核酸，优选通过扩增待检测核酸片段进行定量检测。
[0239]如已经结合本发明所述第一种方法所提到，用步骤(a)中定义的试剂预处理生物处理样品具有以下优势:后续的核酸纯化能够显著改善，尤其是当所述生物处理样品仅含有少量的靶标核酸时。对于一些生物处理样品，所述核酸的分离仅由此变得可能。在步骤(a.)中进行的预处理能通过一种令人惊讶的简单方式从甚至非常不同的生物处理样品中以基本恒定的效率可靠分离核酸，例如在容许的变化之内。因此，用按照本发明的方法分离靶标核酸(例如宿主DNA或其他核酸污染物)是可能的，即使它们以仅仅Ipg或更少的量存在于所述生物处理样品中。由于按照本发明的预处理，能够有效纯化甚至0.1pg的量或甚至0.01pg的量。因此，按照本发明的方法足够灵敏，甚至在应用生物处理样品的这个高要求领域中，能够用统一的分离方法可靠分离并且甚至定量分离靶标核酸。因此，所述方法也能够易于自动化，这在通常必须处理大量样品的所述领域中是一个显著的优势。
[0240]本发明所述用于从生物处理样品中分离靶标核酸的方法基本上是本发明所述第一种方法的【具体实施方式】，其已经如上详细描述，用于从样品材料中分离和/或纯化核酸。特别合适和优选的包括氨基基团的化合物(其能包括在步骤(a.)使用的试剂中)以及合适和优选浓度的预处理所用试剂单独组分已经结合本发明所述第一种方法详细解释并且也应用于从生物处理样品中分离靶标核酸的方法。为了避免重复，因而参考上述公开内容的全文，其在此也是适用的。然而，为了完整性目的，特别优选的实施方式在下文中再次详细解释。特别优选地，上文详述的本发明所述试剂用于步骤(a.)中的预处理，并且也在权利要求中更为详细地描述。
[0241]合适和优选的包括氨基 的化合物如上详细描述；参考相应的公开内容。按照一个实施方式，在生物处理样品与步骤(a.)内用于预处理的试剂的反应混合物中，包括氨基的化合物和/或各种这些化合物的组合的总浓度是2.5mM-400mM,优选12.5mM-280mM,特别优选25mM-200mM。这些浓度已经证明对于200 yl-1000 yl大小范围的样品材料与试剂的反应混合物特别有利。在此，所述核酸的定量分离是可能的，即使本发明所述试剂与样品材料的反应混合物仅含有Ipg核酸数量级的少量核酸。按照本发明用于步骤(a.)的试剂中，优选包含氨基的化合物和/或各种这些化合物的组合总浓度为5mM-500mM，优选25mM-350mM，特别优选 50mM-250mM。
[0242]按照用于从生物处理样品中分离核酸的本发明所述方法的一个优选实施方式，用某一试剂完成步骤(a.)中的预处理，所述试剂也包括以下组分中的至少一种或多种:
[0243]-至少一种去污剂或去污剂的混合物，
[0244]-至少一种络合剂或络合剂的混合物，优选选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(氨基乙基醚)-N，N'-四乙酸(EGTA)和/或乙二胺二琥珀酸(EDDS)，特别优选EDTA，
[0245]和/ 或
[0246]-至少一种蛋白或蛋白的混合物。
[0247]实验已经显示，使用额外含有一种或多种相应组分的相应试剂预处理，能够进一步改善后续的分离和/或纯化。如果所述试剂包括几种组分或成分，它们能够以均匀试剂的形式添加，例如溶液，或者，所述试剂能通过混合两种或多种组合物形成，例如使这些组合物与生物处理样品一起接触或还任选地互相分开接触，以按照步骤(a.)进行所述样品的预处理。按照本发明，术语使用试剂预处理生物过程样品也涵盖单独组分的分开添加。优选使用均匀试剂。
[0248]如上所述，所述去污剂优选是非离子型表面活性剂，优选烷基葡糖苷和/或聚氧乙烯烷基苯基醚。烷基葡糖苷的组特定包括聚山梨酯的组，优选聚山梨酯20、聚山梨酯40和聚山梨酯80。特别优 选地，使用聚山梨酯20 (吐温20)作为烷基葡糖苷。聚氧乙烯烷基苯基醚优选是辛苯聚醇9(曲通X-100)或诺乃洗涤剂P-40。优选地，在所述试剂中，所述去污剂或去污剂的混合物尤其是一种或多种非离子型表面活性剂的总浓度是0.1% (v /v) -5 % (v / v),优选 0.2% (v / v)-4% (v / v),并且优选 0.5% (v / v) -3% (v / v)并且也优选I % (v / v) -3% (v / v)。0.2% (v / v) -0.5% (v / v)优选用于聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100，并且I % (v / v)-5% (v / v)优选用于烷基葡糖苷，尤其是聚山梨酯，例如吐温20。
[0249]按照一个实施方式，在生物处理样品与本发明所述试剂的反应混合物中，所述试剂所含去污剂或去污剂的混合物尤其是一种或多种非离子型表面活性剂的总浓度是0.05 % (V / v) -4 % (v / v),优选 0.1 % (v / v) -3 % (v / v)并且优选 0.25 % (v /v) -2.5% (v / v)以及优选 0.5% (v / v) -2.5% (v / v)。0.1% (v / v) -0.4% (v / v)的值已经证明特别优选用于聚氧乙烯烷基苯基醚，例如曲通x-100。按照一个实施方式，所述浓度优选是0.5% (v / v)-4% (v / V)。这个浓度尤其优选用于聚山梨酯，例如吐温20。优选地，用于预处理生物处理样品的步骤(a.)所用试剂含有至少两种去污剂。按照一个实施方式，一种去污剂选自烷基葡糖苷组，优选聚山梨酯，尤其优选聚山梨酯20，并且另一种去污剂选自聚氧乙烯烷基苯基醚的组，优选曲通X-100。
[0250]按照一个实施方式，用于预处理的步骤(a.)所用试剂包括络合剂或络合剂的混合物。按照一个实施方式，在试剂中络合剂的总浓度是10mM-500mM，优选lOmM-lOOmM。按照一个实施方式，在生物处理样品与本发明所述试剂的反应混合物中，所述试剂所含络合剂的总浓度是5mM-400mM，优选5mM-80mM。其优点已经如上解释。
[0251]按照本发明所述方法的一个实施方式，用于预处理的步骤(a.)所用试剂包括至少一种蛋白，优选球状蛋白或球状蛋白的混合物。根据一个实施方式，所述蛋白没有任何酶活性。优选地，该蛋白不是酶。球状蛋白优选选自白蛋白和/或球蛋白。按照本发明所述方法的一个实施方式，在步骤(a.)所用试剂中一种或多种蛋白的总浓度是Img /mL-100mg / mL,优选 2mg / mL_25mg / mL, 2mg-10mg / ml 并且也优选 4mg_10mg / ml。2mg / mL-25mg / mL、2mg / ml-10mg / ml 和优选 4mg / ml-10mg / ml 的浓度特别适于球状蛋白，具体例如IgG和BSA。按照一个实施方式，在生物处理样品与本发明所述试剂的反应混合物中，来自试剂的一种或多种蛋白的总浓度是0.5mg / mL-80mg / mL, Img /mL-20mg / mL,优选 Img / mL-8mg / mL,优选 2mg / mL-8mg / mL。对于细节和优势，参考上述公开内容以及本发明所述方法。
[0252]按照一个实施方式，在步骤(a.)中使用的试剂不含总浓度> 5mM的磷酸盐和/或柠檬酸盐。
[0253]按照一个实施方式，在步骤(a.)中使用的试剂不含或仅含有少量的离液化合物。这个实施方式是有利的，因为测试已经显示用于预处理的步骤(a.)所用试剂中的离液化合物例如离液盐，特别是在较高浓度下能对后续核酸纯化产生不利影响，例如其可能反映为在经分离靶标核酸的定量检测中的较低回收率。因此用于预处理的步骤(a.)所用试剂优选不含一定浓度的离液化合物，该浓度使得按照本发明的预处理效果更差，并且尤其是干扰后续核酸分离的浓度。优选地，用于本发明所述方法步骤(a.)的试剂不含浓度超过71、611、511、411、311、211、謹或超过0.5M的离液盐，尤其是胍盐。优选离液盐尤其是胍盐的量在0.1M以下。特别优选地，在步骤(a.)中使用的试剂不含任意离液盐或其他离液化合物。优选地，这相应用于步骤(a.)中的预处理，例如，在步骤(a.)中优选没有离液化合物加入到生物处理样品中。
[0254]按照一个实施方式，用于预处理的步骤(a.)所用试剂没有任何裂解性质。
[0255]按照一个实施方式，用于预处理的步骤(a.)所用试剂包括至少一个或多个含有氨基的化合物，所述化合物选自下述1-viii组中的一种或多种:
[0256]1.天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸，
[0257]i1.丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和缬氨酸，
[0258]ii1.精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸，
[0259]iv.^ -丙氨酸、D-丙氨酸、L-高丝氨酸和D-缬氨酸，
[0260]V.聚-L-赖氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚-L-赖氨酸盐酸盐、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-赖氨酸)氢溴酸盐、聚-L-鸟氨酸，
[0261]v1.甘氨酸二聚体、甘氨酸三聚体、甘氨酸四聚体和二肽(Ala-Glu)，
[0262]vi1.N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N，N- 二(2-羟基乙基)甘氨酸(bicine)，
[0263]和/ 或
[0264]vii1.三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)。
[0265]下面描述了步骤(a.)所用试剂的特别优选的实施方式。在这些优选的实施方式中，所述试剂的单独组分优选以上面就单独组成部分描述的浓度存在，在这个方面参考上述的公开内容。如前已述，能够在样品材料的预处理中分开加入所述试剂的单独组分，然而，其中优选以均匀试剂形式加入，例如溶液。[0266]按照一个优选的实施方式，在步骤(a.)中使用的试剂包括至少甘氨酸、Gly-Gly、N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸和/或N，N-二(2-羟基乙基)甘氨酸作为包含氨基的化合物、至少一种络合剂(优选EDTA)以及至少一种，优选至少两种去污剂，尤其优选聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯，例如优选吐温20。特别优选地，所述试剂还包括至少一种蛋白，优选球状蛋白如IgG或BSA。
[0267]按照另一个优选的实施方式，在步骤(a.)中使用的本发明所述试剂包括一个或多个选自天冬酰胺、谷胺酰胺、精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸的极性-中性和/或碱性a -氨基羧酸。在此，实验已经显示用相应试剂预处理还能够改善分离和/或纯化，尤其是当所述a -氨基羧酸与缓冲液组合，具体例如Tris或磺酸缓冲液，例如HEPES或HEPPS缓冲液。另外，所述试剂优选包括至少一种蛋白，优选球状蛋白如IgG或BSA。
[0268]按照另一个优选的实施方式，在步骤(a.)中使用的试剂包括氨基羧酸化合物谷胺酰胺、脯氨酸、聚-L-赖氨酸和/或聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)以及二肽(Ala-Glu)。优选地，其还包括络合剂例如EGTA，和至少一种、优选至少两种去污剂，尤其优选聚氧乙烯烷基苯基醚，如诺乃洗涤剂-P40和/或聚山梨酯，优选例如吐温20。优选地，所述试剂也包括球状蛋白和一种或多种缓冲液，所述球状蛋白优选IgG，所述缓冲液优选一种或两种磺酸缓冲液，例如HEPES和/或HEPPS。
[0269]按照另一个优选的实施方式，在步骤(a.)中使用的试剂包括至少一种、优选两种以下氨基羧酸化合物即(6-丙氨酸和聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)。优选地，其还包括络合剂例如EDTA，和至少一种、优选至少两种去污剂，尤其优选聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯，优选例如聚山梨酯40。优选地，所述试剂也包括球状蛋白以及一种或多种缓冲液，所述球状蛋白优选IgG，所述缓冲液优选一种或两种磺酸缓冲液，例如HEPES 和 / 或 HEPPS。
[0270]按照另一个优选的实施方式，在步骤(a.)中使用的试剂包括至少两种、优选所有的以下氨基羧酸化合物即半胱氨酸、丙氨酸、精氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐和三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)。此外，该试剂优选包括球状蛋白，尤其是IgG。
`[0271]按照另一个优选的实施方式，在步骤(a.)中使用的试剂包括至少两种、优选所有的以下氨基羧酸化合物即丝氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、D-缬氨酸和聚-L-鸟氨酸。优选地，其还包括络合剂例如EGTA，和至少一种、优选至少两种去污剂，尤其优选聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯，优选例如吐温20。优选地，所述试剂也包括球状蛋白，优选 BSA。
[0272]按照另一个优选的实施方式，在步骤(a.)中使用的试剂包括至少两种、优选所有的以下氨基羧酸化合物即苏氨酸、亮氨酸和鸟氨酸。优选地，其还包括络合剂例如EDDSJP至少一种、优选至少两种去污剂，尤其优选聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯，优选例如吐温20。优选地，所述试剂还包括蛋白以及优选一种或多种缓冲液，所述蛋白优选球状蛋白如IgG或BSA，所述缓冲液优选一种或两种磺酸缓冲液，例如HEPES和/或HEPPS。
[0273]按照一个优选的实施方式，步骤(a.)所用试剂的pH在pH3_pH9的范围内。
[0274]优选地，50-3000 iil，优选100-1500 y 1，特别优选200-1000 量的特定生物处
理样品用于本发明所述核酸分离，并且在步骤(a.)中用本发明所述制剂相应处理。在步骤(a.)中试剂和生物处理样品优选以下列比例一起加入:1+4至4+1 (Vww
+V生物处理样品)，优选1+2 (V试剂+V生物处理样品)M 2+1 (V试剂+V生物处理样品)并且特别优选1+1 (V试剂
+V)。应优选进行后续的混合步骤。
[0275]在步骤(a.)以及任选的步骤(b.)中本发明所述预处理之后是分离和/或纯化核酸的步骤(C.)。任选地，本发明所述试剂与从步骤(a.)或步骤(a.)和步骤(b.)得到的生物处理样品的组合物在步骤(c.)之前还能进一步加工和/或处理，例如通过加入另外的制剂或通过分离单独的组分。生物处理样品与本发明所述试剂的组合物因此还可包括额外的组分，例如其在步骤(a.)中的预处理之后但在步骤(c.)的分离之前加入。为简明起见，从相应中间步骤得到的组合物也能在本申请的内容中表示为本发明所述试剂与从步骤(a.)或步骤(a.)和步骤(b.)得到的生物处理样品的组合物。
[0276]取决于实施方式的步骤(c.)可能具有几个子步骤，基本上与任意类型的核酸分离方法一起发挥功能。使用或不使用运载体材料以结合核酸的分离方法的非详尽示例已经结合本发明所述第一种方法在前文中描述。参考上述公开内容。按照一个实施方式，步骤(C.)中核酸的分离和/或纯化包括至少一个下列子步骤C.1)和C.2)，优选包括两个子步骤:
[0277]c.1)通过添加至少一种裂解剂，消化本发明所述试剂与从步骤(a.)或步骤(a.)和步骤(b.)得到的生物处理样品的组合物。用裂解剂的该处理特别用于生物处理样品中可能含有的任意蛋白和可能存在的任意其他污染样品组分的变性和/或降解。此外，取决于生物处理样品，这个步骤也用于从例如络合物质中释放生物处理样品所含核酸的目的。由于本发明所述方法优选能够从非常不同的生物处理样品中分离靶标核酸，其可能因此在组成方面不同，因此使用裂解剂处理是有利的，即使生物处理样品中的靶标核酸一般不包含在细胞内。在这个消化步骤中，优选使用典型的裂解剂，例如蛋白水解酶，优选蛋白酶如蛋白酶K，离液化合物，优选`例如离液盐和/或去污剂，优选非离子型去污剂。按照一个实施方式，在此消化步骤中使用超过一种裂解剂。因此，在步骤(a.)中用试剂预处理的生物处理样品可用至少一种蛋白水解酶以及至少一种裂解剂处理，所述蛋白水解酶优选蛋白酶K，所述裂解剂包括至少一种离液化合物和/或去污剂。离液盐特别例如胍盐，优选用作离液化合物。非离子型去污剂优选用作去污剂。对于去污剂，优选使用聚氧乙烯脂肪醇醚，其包括优选具有6-22个碳原子的脂肪醇部分，并且包括优选具有2-150个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯部分。能优选用于此消化步骤的裂解剂也描述于例如W02009 / 144182，其在此通过引用纳入。按照一个实施方式，在消化步骤中，使按照步骤(a.)预处理的生物处理样品与至少一种蛋白水解酶和至少一种其他裂解剂接触并且孵育，所述裂解剂优选含有离液化合物。孵育步骤的持续时间优选至少3分钟，优选至少5分钟，优选至少10分钟，特别优选至少15分钟并且优选在蛋白水解酶活性提高的温度下进行。优选地，在至少35°C，至少40°C，至少50°C，至少55°C或至少60°C进行所述孵育步骤。优选地，在35°C -70°C，优选40°C_65°C的温度范围内进行所述孵育。特别优选地，使用蛋白水解酶和含有离液剂的裂解试剂的组合，其优选也包括前述去污剂之一。
[0278]c.2)优选通过结合到运载体材料来分离核酸。如果所述生物处理样品除了靶标核酸以外也含有其他核酸，这些也能同时进行纯化。然而，如果需要，也能产生靶标核酸的选择性纯化。运载体材料优选是核酸结合固相，其来自含二氧化硅材料、硅胶、二氧化硅、玻璃、沸石、氧化铝、二氧化钛、二氧化锆、高岭土、硅胶、陶瓷、聚合物运载体材料，例如聚亚烷基和聚苯乙烯珠。最终起决定性作用的是运载体材料能够结合核酸。能够用官能团例如阴离子交换基团修饰所述运载体材料，或者其能是未修饰的并且因此在表面不含任何额外的官能团。所述运载体材料的其他实施方式已经如上述，并且参考相应的公开内容。特别优选地，使用二氧化硅材料。在这种情况下优选使用具有二氧化硅或玻璃表面的磁性颗粒。磁性二氧化硅颗粒优选使本发明所述方法易自动化，并且优选的实施方式已经结合本发明所述第一种方法如上描述；参考相应的公开内容。按照一个实施方式，能够通过步骤C.1)使用的裂解剂调节结合核酸所必需的结合条件，例如当所述裂解剂包含合适浓度的离液化合物时。相应的结合步骤已在现有技术中描述，例如在US5，234，809中。然而，优选地，为了调节结合条件，加入结合剂，其包括至少一种醇，优选具有1-5个碳原子的支链或直链烷醇，尤其优选异丙醇。所述结合剂也能够包括离液化合物，优选离液盐和/或至少一种去污剂。所述去污剂优选是非离子型去污剂。所述结合剂的优选实施方式也结合本发明所述第一种方法如上描述。参考相应的公开内容。能用于步骤c.2)的其他结合剂描述于例如W02009 / 144182，其在此通过引用纳入。核酸结合到运载体材料之后优选是从剩余样品中分离结合的核酸。如果使用磁性二氧化硅颗粒，这通常在磁场协助下优选通过分离结合到所述运载体材料的核酸来完成。任选地，所述核酸随后能进行洗涤和洗脱。
[0279]本发明所述用于从生物处理样品中分离靶标核酸的方法还包括用于检测至少一部分经分离靶标核酸的任选步骤(d.)。检测能够是定性的，但是在生物药物领域，优选是定量的。对于检测，通常足以检测经分离靶标核酸的核酸片段。定量检测优选通过扩增靶标核酸的片段发生。定 量检测能够对生物处理样品所含靶标核酸的量做出定量陈述。由于管理机构要求，这尤其在生物药物领域是重要的，因为不能超过特定量的例如宿主DNA或其他核酸污染物。
[0280]除了上文已描述的基本步骤(a.)-(d.)，按照本发明的额外步骤也能够在所述步骤(a.)-(d.)之前或之后进行(并且例如在所述步骤(c.)的子步骤之前或之后)。详细内容也结合本发明所述第一种方法加以解释；参考相应的公开内容。
[0281]术语生物处理样品特别涉及在生物技术学生产过程中得到或产生的样品材料。按照一个实施方式，所述生物处理样品是在纯化过程中得到的纯化部分。例如，其能是生物技术学生产的产品(尤其是生物药物)的纯化过程中得到的纯化部分。通常在此使用的用于纯化相应所生产生物技术产品的方法如上所解释；参考相应的公开内容。术语生物处理样品和纯化部分也包括最终纯化和/或配制的生物技术产物(例如生物药物)。根据一个实施方式，所述纯化部分是色谱洗脱液。例如可能在离子交换色谱、蛋白-A / G-亲和色谱、疏水性相互作用色谱和/或亲水相互作用色谱的过程中得到所述洗脱液。按照一个实施方式，所述纯化部分是水性样品材料，除了需要分离的核酸以外其还包括一种或多种缓冲物质和/或盐。相应纯化部分中经常含有的缓冲物质示例是乙酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硫酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液。在纯化缓冲液中经常使用并且因此在纯化部分中包含的其他缓冲剂是ACES、ADA、BES、BICINE、BIS-TRIS、CHES、柠檬酸盐、甘氨酸、Gly-Gly、HEPES、HEPPS、咪唑、MES、MOPS、PIPES、磷酸盐、TAPS、TES、TRICINE、TRIS。也使用马来酸盐、丙二酸盐、甲酸盐、三甲基胺、三乙基胺。尤其也在纯化部分中出现的常见盐是，例如碱金属和碱土金属基团的氯化物、硫酸盐、磷酸盐以及铵化合物，以及任选的Zn、Cu、N1、Co、Fe盐(例如当IMAC方法如N1-NTA用于纯化时)。
[0282]按照一个实施方式，所述生物处理样品并且尤其是纯化部分基本没有细胞。需要研究的纯化部分能源自用于生物技术学生产的产品纯化过程的任意阶段。按照一个实施方式，用本发明所述方法从纯化过程得到的不同纯化部分中分离靶标核酸。因此，例如能够用本发明所述方法从纯化过程的各种或甚至每个纯化部分(包括最终纯化的终产物)纯化靶标核酸。这使得优选能监测纯化过程并且例如确保所纯化终产物中包含的靶标核酸量不超过所需和/或允许的量成为可能。基于按照本发明在步骤(a.)中完成的生物处理样品预处理，能够用统一方法实现核酸的实际分离，即使所述生物处理样品例如各种纯化部分在其组成方面不同。此外，甚至极少量核酸的定量分离也是可能的。
[0283]按照一个实施方式，靶标核酸代表所述生物处理样品例如纯化部分的污染。代表污染的核酸能是例如病毒核酸或微生物的核酸。按照一个实施方式，靶标核酸是DNA，尤其是例如来自宿主或宿主细胞的基因组DNA，所述宿主或宿主细胞用于生物技术产品具体例如生物药物的生产。通常用作生产器的宿主和宿主细胞结合本发明所述第一种方法如上述解释。参考相应的公开内容。特别是当使用永生化宿主细胞时，来自宿主细胞的DNA不应以较大的量存在于最终生产的生物药物中。当重组产生感兴趣的生物药物，尤其是例如生物药物肽或蛋白时，经常使用各永生化宿主细胞。如上所述，管理当局要求证明没有超过特定的限制。另外，用于提供这种证明的核酸分离方法必须满足特定的标准，尤其是它们必须足够灵敏和可靠以保证可靠的结果。本发明所述方法满足这些要求。相应的背景、生物处理样品的其他示例以及合适并且优选的生物药物示例已经在前序中并结合本发明所述第一种方法详细解释。参考上述公开内容，其也在此相关。按照一个实施方式，所述生物药物不是核酸。按照一个实施方式，所述生物药物是肽或蛋白。如上所述，能够用各种宿主细胞重组生产肽和蛋白。
[0284]按照一个实施方式，检测了至少一部分经分离的靶标核酸，并且所述检测优选是定量的。如已提及的，其优势在于能测定所分析生物处理样品中靶标核酸的量在允许和/或需要的最大限度以上或是以下。
[0285]按照一个实施方式，本发明所述方法具有如下L0D(检测限):生物处理样品中的lpg、0.5pg,优选0.lpg、0.05pg,特别优选0.01pg祀标核酸,从所述生物处理样品中分离革巴标核酸。由于按照本发明的预处理，从非常不同的生物处理样品中高效、有效和可靠地分离甚至如此小量的靶标核酸，并且因此能定量确定生物处理样品中的靶标核酸量。当然，然而，所述生物处理样品也可能含有显著较高量的靶标核酸。本发明所述方法的检测下限的特别优点在于甚至能够检测到如此小的量并且因此也能确保所述方法得到在Pg范围(或更高)内的可靠结果，即使所述生物处理样品有显著差异并且因此纯化受到明显阻碍。在其低LOD的基础上，本发明所述方法满足用于核酸污染物检测的核酸纯化方法的灵敏度官方要求。
[0286]在经分离靶标核酸的任选后续检测中，经分离靶标核酸的回收率优选是至少50 %，优选至少75 %，特别优选至少85 %。
[0287]按照一个具体的实施方式，本发明提供了用于在从纯化过程得到的各种生物处理样品中检测至少一种靶标核酸的方法，其中所述方法的特征在于所述靶标核酸按照上述用于从生物处理样品分离靶标核酸的方法分离自需要研究的生物处理样品并且检测了至少一部分纯化的靶标核酸。优选地，所述检测是定量的，例如通过已知的扩增技术。对于用于从生物处理样品中分离靶标核酸的方法的详细内容，参考前述公开内容。所述方法的这种变化具有的优势在于靶标核酸能够通过本发明所述方法从各种纯化过程所得生物处理样品中分离，所述生物处理样品优选包括最终纯化的终产物。如上所述，这能监测纯化的过程并且例如确保纯化的终产物不超过需要的和/或允许的靶标核酸量。所述靶标核酸优选是宿主DNA(特别是当所述宿主细胞是永生化细胞时)和/或病毒核酸。生物处理样品、生物药物和单独过程步骤的实施方式的合适示例如上详细解释。参考相应的公开内容。
[0288]本发明还涉及用于制备生物处理样品的试剂的应用，所述生物处理样品优选含有一种用于后续核酸分离和/或纯化以及优选核酸检测的生物药物，其中所述试剂包括至少下列组分:
[0289]a.至少一种或多种包括氨基的化学物，所述化合物来自下组中的一种或多种:
[0290]1.极性-中性蛋白性a -氨基羧酸，优选天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸，
[0291]i1.非极性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸，优选丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和缬氨酸，
[0292]ii1.碱性a-氨基羧酸，优选精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸，
[0293]iv.非蛋白性氨基羧酸，选自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高丝氨酸和D-缬氨酸，
[0294]V.氨基羧酸聚合物，包括在(1.)-(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸组成，优选形成自相同、两种或几种不同的氨基羧酸单体，优选与卤化物联合，优选选自聚-L-赖氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚-L-赖氨酸盐酸盐、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-赖氨酸)氢溴酸盐、聚-L-鸟氨酸，优选大小为 0.5kDa-300kDa,
[0295]v1.来自2-4个氨基羧酸的肽，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸组成，优选选自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，优选甘氨酸二聚体、甘氨酸三聚体和甘氨酸四聚体，
[0296]vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相独立地选自氢、烷基、羟基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相独立地选自氣、烷基、羟基烷基，其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链的，是饱和或不饱和的并且其中R1、!?2、!?3和R4中的至少一个不是氢。一个、两个、三个、四个或五个羟基能够以羟基烷基的形式存在。二(羟基烷基)基团和三(羟基烷基)基团也是合适的。通式(I)的化合物优选选自N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二(2-羟基乙基)甘氨酸(bicine),
[0297]vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相独立地选自氢和羟基烷基，并且其中R5、R6和R7互相独立地选自氢、烷基和羟基烷基，其中优选R5、R6和R7中的至少一个是羟基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链，饱和或不饱和的。一个、两个、三个、四个或五个羟基能够以羟基烷基的形式存在。二(羟基烷基)基团和三(羟基烷基)基团也是合适的。化合物(II)优选是三(羟基甲基)_5氨基甲烷(Tris)，
[0298]以及优选至少一种或多种下列组分:
[0299]b.至少一种去污剂，
[0300]c.至少一种络合 剂，[0301]d.至少一种蛋白。
[0302]所述试剂在预处理中的应用优选具有以下效果:能增加核酸纯化效率并且因此能从优选含有生物药物的生物处理样品中分离甚至极少量的靶标核酸。在一些生物处理样品的情况中，核酸纯化仅仅作为使用本发明所述试剂的结果而变得可能。优选分离之后是靶标核酸的检测。在此，按照本发明的应用使得靶标核酸的回收率能够增加并且因此回收率为至少50%，优选至少75%，特别优选至少85%。
[0303]对于包括合适和优选浓度的单独组分在内的试剂单独组分以及组分组合的优选实施方式和本发明所述试剂的优选实施方式，参考所述试剂的上述公开内容，尤其是已经在本发明所述用于从样品材料分离和/或纯化核酸的第一种方法中描述的试剂，以及按照本发明的试剂。所述生物处理样品优选是纯化部分，优选从色谱过程中得到的纯化部分。所述生物处理样品优选是水性样品材料，除了需要纯化的核酸以外其还包括一种或多种缓冲剂和/或盐。关于生物处理样品和优选实施方式、纯化部分的组成和性质的进一步详细内容结合本发明所述用于从生物处理样品纯化核酸的方法如上解释。参考上述公开内容。
[0304]此外，应用本发明所述试剂和/或本发明所述方法能定量检测分离和纯化的核酸，所述核酸优选包含于来自纯化过程的纯化部分中。作为本发明所述预处理的结果，优选能降低L0D。按照本发明的应用能够使样品中核酸分离的检测限降低到至少lpg，优选至少0.1pg并且特别优选0.01pg的核酸。由于按照本发明的预处理，能分离甚至如此小量的核酸。当然，较大量的核酸纯化也是可能的并且由本发明的各个方面覆盖。另外，按照本发明的预处理允许以至少50%，优选至少75%，特别优选至少85%的回收率纯化和检测核酸。这些惊人的检测下限和高回收率增加了核酸纯化的可靠性，因为它们确保能够从生物处理样品中可靠地纯化甚至微量(和当然较大的量)的核酸。增加对于患者的安全性并且排除由少量核酸产生的污染是非常重要的，尤其是与生物药物的医药产品授权/批准程序相关。
[0305]本发明所述用于从样品材料分离和/或纯化核酸的方法的试剂盒包括本发明所述试剂的实施方式，其对应于在分离和纯化核酸方法内使用的试剂的上文描述和/或对应于本发明所述用于核酸分离和/或纯化方法的上文描述。所述试剂盒包括以下组分中的至少一种或多种:`
[0306]1.运载体材料，优选含有用于分离靶标核酸的二氧化硅、玻璃纤维、聚亚烷基，例如PP、PE / PP、PE。所述运载体材料能够以颗粒的形式作为非织造织物、纤维、凝胶基质、膜和优选作为柱填充材料使用，其中所述颗粒优选采用珠的形式。所述珠优选采用磁性颗粒的形式，优选磁性珠。
[0307]i1.一种或多种用作裂解剂的制剂，优选包括至少一种离液剂和/或至少一种来自非离子型去污剂组的去污剂，优选选自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22个碳原子的脂肪醇部分并且包括含有2-150个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯部分，
[0308]ii1.一种或多种酶，优选蛋白酶K、DNA酶和/或RNA酶，
[0309]iv.一种或多种用作结合剂的制剂，优选包括至少一种离液剂和/或至少一种来自非离子型去污剂组的去污剂，优选选自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22个碳原子的脂肪醇部分并且包括含有2-150个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯部分，以及任选至少一种具有1-5个碳原子的支链或直链醇，[0310]v.一种或多种用作洗涤剂的制剂，所述制剂优选包括至少一种具有1-5个碳原子的支链或直链醇，以及任选的离液化合物和/或任选来自非离子型表面活性剂组的去污剂，
[0311]v1.一种或多种用作洗脱剂的制剂，优选包括缓冲介质中的至少一种络合剂。
[0312]所述试剂盒适于手动使用和自动化应用，尤其是基于膜和/或柱以及磁性珠的运载体材料能够实践自动化。
[0313]术语“试剂”在本申请内容中特定指化学组合物。术语试剂、组合物和制剂在此作为同义词使用，除非使用它们的上下文有一些其他的意思。优选地，所述试剂是水性组合物。
[0314]术语“核酸”和“多种核酸”以及其衍生的术语在本申请内容中以单数或复数形式同义使用。能用本方法分离的核酸是例如DNA、RNA、mRNA、质粒、粘粒、线粒体，表观遗传修饰的、单链、双链、环状、游离循环、胎儿的、人工或合成的核酸，以及cDNA和其片段。按照一个实施方式，需要纯化的核酸代表样品材料尤其是例如生物处理样品的污染。在生物处理样品的情况中，相应污染物示例特定是生产者的基因组DNA或病毒核酸。取决于本发明所述方法的步骤(c.)的实施，可纯化总核酸和特定DNA或RNA。此外，能够在设定的合适结合条件下纯化短链核酸(例如具有< 1000bp、< 800bp、< 500bp、< 300bp ( 200bp 或< IOObp长度的任意形式的DNA和RNA，包括非编码RNA，例如miRNA或合成核酸)。用于分离短链核酸的相应条件/方法在现有技术中熟知并且可以相应地按照本发明在本发明所述方法的步骤(c.)中使用。
[0315]特别优选的实施方式再次如下描述:
[0316]按照第一个实施`方式，提供了一种用于从样品材料中分离和/或纯化核酸的方法，所述方法包括以下步骤:
[0317]a.向所述样品材料加入试剂，其中所述试剂包括至少一种或多种含氨基的化合物，所述化合物选自下组中的一种或多种:
[0318]1.极性-中性蛋白性a -氨基羧酸，优选天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸，
[0319]i1.非极性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸，优选丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和缬氨酸，
[0320]ii1.碱性a-氨基羧酸，优选精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸，
[0321]iv.非蛋白性氨基羧酸，选自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高丝氨酸和D-缬氨酸，
[0322]V.氨基羧酸聚合物，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸组成，优选形成自相同、两种或几种不同的氨基羧酸单体，优选与卤化物联合，优选选自聚-L-赖氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚-L-赖氨酸盐酸盐、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-赖氨酸)氢溴酸盐、聚-L-鸟氨酸，
[0323]v1.来自2-4个氨基羧酸的肽，包括(1.)_(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸组成，优选选自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，优选甘氨酸二聚体、甘氨酸三聚体和甘氨酸四聚体，
[0324]vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相独立地选自氢、烷基、
羟基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相独立地选自氣、烷基、羟基烷基、二(羟基烧基)和三(羟基烷基)，其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链的，是饱和或不饱和的并且其中R1、R2> R3和R4中的至少一个不是氢，优选选自N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二 (2-羟基乙基)甘氨酸(bicine),
[0325]vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相独立地选自氢和羟基烷基，并且其中R5、R6和R7互相独立地选自氢、烷基和羟基烷基，其中优选地R5、R6和R7中的至少一个是羟基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链，饱和或不饱和的，其中所述化合物优选是三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)，
[0326]b.优选混合该试剂与样品材料，
[0327]c.从所述样品材料中分离和/或纯化核酸，所述样品材料已经与所述试剂接触和/或与所述试剂混合，
[0328]d.任选定量和/或定性检测至少一部分经分离的核酸，优选通过扩增待检测核酸片段进行定量检测，
[0329]其中，所述方法包括以下特征中的至少一种:
[0330]1.向所述样品材料加入的按照步骤(a.)的试剂不含离液试剂，或
[0331]I1.如果步骤(c.)中加入了至少一种含有离液剂的试剂，在步骤(c.)中加入含有离液剂的试剂在缺乏具有1-5个碳原子的支链或直链烷醇的情况下第一次发生，
[0332]其中，所述具有待分离和/或纯化核酸的样品材料选自下组之一:
[0333]A.水性组合物，优选来自纯化过程的纯化部分，所述组合物包括生物分子和/或生物体，其中所述生物分子和/或生物体具有至少一种下列特征:
[0334]1.所述生物分子和/或生物体选自下组:蛋白、核酸(优选DNA、RNA、质粒、小干扰RNA(siRNA))、病毒和/或疫苗，
[0335]i1.所述生物分子和/或生物体是药学上活性物质，
[0336]ii1.所述生物分子是合成或生物技术学产生的，和/或
[0337]iv.所述生物分子是生物技术学产生的分子，其通过遗传修饰或未修饰的生物产生，
[0338]B.人或动物体组分选自体液、体细胞和/或体组织,优选血液、血液组分、血清、脑脊液、液体粘膜涂片(liquor mucosal smear)、痰液、尿、粪便、精液和组织样品,其中这些身体组分包括下列分子和/或生物体中的一种或多种:
[0339]1.游离循环的人或动物核酸，优选游离循环的胎儿核酸、来自恶性和/或非恶性肿瘤的核酸、来自凋亡细胞的核酸、非编码小RNA、微小RNA(miRNA)和siRNA，
[0340]i1.来自微生物的游离循环核酸，优选来自病原体，尤其优选来自细菌和病毒，和/或
[0341]ii1.微生物，优选病原体，尤其优选细菌和病毒，
[0342]C.含有细胞和/或核酸和/或生物体的法医学样品材料，其中所述细胞和/或核酸和/或生物体以液体样品材料或从溶于液体的样品材料中提取的形式存在，
[0343]和/ 或
[0344]D.一种包括样品组分和任选生物体的组合物，其中，所述样品组分选自食物或其组分，以及环境组分，优选土壤、水和植物，并且任选进行重悬。
[0345]按照第一个实施方式的方法在第二个实施方式中特征为步骤c.分离和/或纯化包括至少下列子步骤:
[0346]1.任选地，在没有支链或直链烷醇的情况下，通过向按照第一个实施方式从步骤(a.)或(a.)和(b.)得到的样品材料与试剂的组合物中加入一种或多种酶，优选蛋白酶K，任选与含有离液剂的试剂组合来降解蛋白和/或污染样品组分，
[0347]i1.加入制剂，所述制剂包括至少一种离液化合物和/或至少一种来自非离子型去污剂的去污剂，优选选自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22个碳原子的脂肪醇部分，并且包括含有2-150个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯部分，优选用于调节或预定义用于结合核酸的结合条件。
[0348]ii1.任选混合和/或孵育，
[0349]iv.加入
[0350]包括至少一种具有1-5个碳原子的支链或直链烷醇的制剂，
[0351]任选额外离液化合物和/或
[0352]任选来自非离子型去污剂的去污剂，优选选自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22个碳原子的脂肪醇部分，并且包括含有2-150个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯部分，
[0353]用于调节结合核酸的结合条件，
[0354]V.使核酸结合到运载体材料上，优选含有二氧化硅、玻璃纤维或聚亚烷基，例如PP、PE / PP、PE，其 中所述运载体材料以颗粒形式作为非织造织物、纤维、凝胶基质或膜使用，优选作为柱填充材料，其中所述颗粒优选采用珠的形式，优选磁性颗粒，并且优选作为磁性珠，
[0355]v1.任选地，用一种或多种制剂洗涤结合的核酸，所述制剂用作洗涤剂，优选包括至少一种具有1-5个碳原子的支链或直链醇，和任选的额外离液化合物，和/或任选来自非离子型表面活性剂的去污剂，
[0356]vi1.任选地，用一种或多种制剂洗脱，其用作洗脱剂，优选包括缓冲介质中的至少一种络合剂，
[0357]其中，按照所述第二个实施方式的步骤1.和i1.的制剂或按照所述第二个实施方式的步骤1.和i1.的混合物能够以可变顺序加到按照第一个实施方式的步骤(a.)，或(a.)和(b.)得到的样品材料和试剂的组合物中。
[0358]按照第一个实施方式或第二个实施方式的方法在第三个实施方式中的优选特征在于除了前述步骤以外，发生以下步骤中的至少一个额外步骤:
[0359]1.完成样品材料所含细胞的裂解，其中在向按照来自第一个实施方式的步骤(a.)的样品材料加入试剂之前进行裂解，
[0360]i1.纯化样品材料以在向按照来自第一个实施方式的步骤(a.)的样品材料加入试剂之前，在一个或多个连续步骤中去除样品材料的细胞片段和/或分子和/或离子组分，其中这些步骤优选包括色谱技术，和/或
[0361]ii1.孵育按照第一个实施方式从工艺权利要求(a.)得到的样品材料与试剂的组合物，并且优选混合后的样品材料与试剂的组合物，按照第一个实施方式从工艺权利要求(a.)和(b.)得到。
[0362]按照第一个、第二个和第三个实施方式中一个或多个的所述方法在第四个实施方式中的特征为生物技术学生产的生物分子通过遗传修饰或未修饰的生物产生，优选选自哺乳动物细胞系、鸟类细胞系、昆虫细胞系、鱼类细胞系、植物细胞系和克隆的微生物，其中所述哺乳动物细胞系优选包括以下细胞系:人细胞系、来自马细胞的细胞系、来自牛细胞的细胞系、来自猪细胞的细胞系、来自袋鼠细胞的细胞系、来自绵羊细胞的细胞系、来自猴细胞的细胞系、来自狗细胞的细胞系、来自猫细胞的细胞系、来自貂鼠细胞的细胞系、来自兔细胞的细胞系、来自仓鼠细胞的细胞系、来自大鼠细胞的细胞系和来自小鼠细胞的细胞系，并且特别优选细胞系Hek293 (人胚胎肾细胞系)、HeLa (人宫颈癌)、Veix)(正常成年非洲绿猴的肾脏)、MDCK (可卡犬肾)、CHO (中国仓鼠卵巢细胞)、SP2 (小鼠骨髓瘤)、NSO (小鼠骨髓瘤)、和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0363]按照实施方式1-4中一个或多个的方法在第五个实施方式中特征为用于预处理的试剂也包括至少一种或多种以下组分:
[0364]-至少一种去污剂或去污剂的混合物，优选选自非离子型表面活性剂，包括烷基葡糖苷和/或聚氧乙烯烷基苯基醚，
[0365]-至少一种络合剂或络合剂的混合物，
[0366]和/ 或
[0367]-至少一种蛋白或蛋白的混合物，其中所述蛋白优选是优选选自白蛋白和/或球蛋白的球状蛋白。
[0368]按照第六个实施方式，提供了在用于从样品材料中分离和/或纯化核酸的方法，尤其是用于制备样品材料的方法中使用的试剂，所述试剂包括以下组分: [0369]a.至少一种或多种包括氨基的化合物，所述化合物选自一种或多种下列组:
[0370]1.极性-中性蛋白性a -氨基羧酸，优选天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸，
[0371]i1.非极性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸，优选丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和缬氨酸，
[0372]ii1.碱性a-氨基羧酸，优选精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸，
[0373]iv.非蛋白性氨基羧酸，选自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高丝氨酸和D-缬氨酸，
[0374]V.氨基羧酸聚合物，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸组成，优选形成自相同、两种或几种不同的氨基羧酸单体，优选与卤化物联合，优选选自聚-L-赖氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚-L-赖氨酸盐酸盐、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-赖氨酸)氢溴酸盐、聚-L-鸟氨酸，
[0375]v1.来自2-4个氨基羧酸的肽，包括(1.)_(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸组成，优选选自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，优选甘氨酸二聚体、甘氨酸三聚体和甘氨酸四聚体，
[0376]vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相独立地选自氢、烷基、羟基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相独立地选自氣、烷基、羟基烷基、二(羟基烧基)和三(羟基烷基)，其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链的，是饱和或不饱和的并且其中R1、R2> R3和R4中的至少一个不是氢，优选选自N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二 (2-羟基乙基)甘氨酸(bicine),
[0377]vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相独立地选自氢和羟基烷基，并且其中R5、R6和R7互相独立地选自氢、烷基和羟基烷基，其中优选地R5、R6和R7中的至少一个是羟基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链，饱和或不饱和的，其中所述化合物优选是三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)，
[0378]以及至少一种或多种下列组分:
[0379]b.至少一种去污剂或去污剂的混合物，优选选自非离子型表面活性剂，包括烷基葡糖苷和/或聚氧乙烯烷基苯基醚，
[0380]c.至少一种络合剂或络合剂的混合物，
[0381]d.至少一种蛋白或蛋白的混合物，其中所述蛋白优选是优选选自白蛋白和/或球蛋白的球状蛋白，
[0382]其中，如果所述试剂含有一种或多种组(1.)、(i1.)、(ii1.)和/或(v1.)的组分，所述试剂中另外包括至少一种蛋白或蛋白混合物，其中所述蛋白优选是优选选自白蛋白和/或球蛋白的球状蛋白，
[0383]其中，所述试剂不是由Tris和EDTA或Tris和EGTA组成的混合物，并且其中，如果所述组分(a.)是Tris、N，N-二(2-羟基乙基)甘氨酸或N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸，所述试剂不包括离液化合物。
[0384]按照第五个或第六个实施方式的方法和/或试剂优选特征是所述去污剂选自下组中的一种或多种:
[0385]a.烷基葡糖苷，优选来自聚山梨酯，优选选自聚山梨酯20、聚山梨酯40和聚山梨酯80，所述去污剂特别优选是 聚山梨酯20(吐温20)。
[0386]b.聚氧乙烯烷基苯基醚，优选是辛苯聚醇9 (曲通X-100)和诺乃洗涤剂P-40。
[0387]按照实施方式5-7中一个或多个的方法和/或试剂按照第八个实施方式，特征在于所述络合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(氨基乙基醚)_N，N'-四乙酸(EGTA)和乙二胺二琥珀酸(EDDS)。
[0388]按照实施方式5-8中一个或多个的方法和/或试剂按照第九个实施方式，特征在于所述蛋白选自下组中的一种或多种:
[0389]a.选自动物白蛋白、植物白蛋白和/或人白蛋白的白蛋白，优选牛血清白蛋白(BSA)，
[0390]b.选自动物球蛋白、植物球蛋白和/或人球蛋白的球蛋白，优选Y -球蛋白。
[0391]按照实施方式5-9中一个或多个的试剂和/或方法按照第十个实施方式，特征在于
[0392]a.用于样品材料预处理的试剂具有以下特征中的至少一个:
[0393]1.包括氨基的化合物和/或各种这些化合物的组合在试剂中的总浓度是5mM-500mM，优选 25mM-350mM，特别优选 50mM-250mM，
[0394]i1.试剂中去污剂的总浓度是0.1% (V / v)~5% (v / v),优选0.2% (v / v)-4%(v / v),并且优选 0.5% (v / v) -3% (v / v)并且也优选 I % (v / v) -3% (v / v),就曲通X-100的使用而言优选0.2% (v / v) -0.5% (v / v),就吐温20的使用而言优选I %(v / v)-5% (v / v)，其中所述去污剂优选是非离子型表面活性剂，
[0395]ii1.试剂中络合剂的总浓度是10mM-500mM，优选IOmM-1OOmM,
[0396]iv.试剂中一种蛋白或多种蛋白的总浓度是Img / mL-100mg / mL,优选2mg /mL-25mg / mL, 2mg / mL-10mg / mL 并且更优选 4mg / mL-10mg / mL,就 IgG 和 BSA 的使用而言优选2mg / mL-25mg / mL,
[0397]v.所述试剂的pH值优选在pH3_pH9的范围内，
[0398]b.在样品材料和试剂的反应混合物中试剂的组分具有以下特征中的至少一种:
[0399]1.包括氨基的化合物和/或各种这些化合物的组合在反应混合物中的总浓度是2.5mM-400mM，优选 12.5mM-280mM，特别优选 25mM-200mM，
[0400]i1.试剂中去污剂的总浓度是0.05 % (v / v)-4% (v / v),优选0.1 % (v /v) -3% (v / v),并且优选 0.25% (v / v) -2.5% (v / v)并且也优选 5% (v / v) -2.5%(v / v),就曲通X-100的使用而言优选0.1% (v / v) -0.4% (v / v),就吐温20的使用而言优选0.5% (v / v)-4% (v / v)，其中非离子型表面活性剂用作去污剂，
[0401]ii1.反应混合物中络合剂的总浓度是5mM-400mM，优选5mM-80mM，
[0402]iv.反应混合物中一种蛋白或多种蛋白的总浓度是0.5mg / mL_80mg / mL,优选Img / mL-20mg / mL, Img / mL-8mg / mL 并且也优选 2mg / mL-8mg / mL,就 IgG 和 BSA的使用而言优选Img / mL-20mg / mL,
[0403]c.试剂与样品材料以以下比例混合:1+4(V试剂+V样品材料)至4+1 (V试剂+V样品材料)，优选 1+2 (Vwflj+V样品材料 )至2+1 (V试剂+V样品材料 )，特别优选1+1 (V_+V 样品材料)’
[0404]d.所述试剂不包括含有总浓度> 5mM的磷酸盐和/或柠檬酸盐的水性制剂，
[0405]e.所述方法具有至少lpg，优选至少0.1pg的LOD (检测限)，
[0406]和/ 或
[0407]f.经分离靶标核酸的回收率是至少50%，优选至少75%，特别优选至少85%。
[0408]按照第十一个实施方式，提供了用于从生物处理样品中分离和/或纯化至少一种靶标核酸的方法，所述生物处理样品优选包括至少一种生物药物，其特征在于所述方法包括以下步骤:
[0409]a.用试剂预处理所述生物处理样品，其中所述试剂包括至少一种或多种有氨基的化合物，所述化合物选自下组中的一种或多种:
[0410]1.极性-中性蛋白性a -氨基羧酸，优选天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸，
[0411]i1.非极性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸，优选丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和缬氨酸，
[0412]ii1.碱性a-氨基羧酸，优选精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸，
[0413]iv.非蛋白性氨基羧酸，选自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高丝氨酸和D-缬氨酸，
[0414]V.氨基羧酸聚合物，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸组成，优选形成自相同、两种或几种不同的氨基羧酸单体，优选与卤化物联合，优选选自聚-L-赖氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚-L-赖氨酸盐酸盐、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-赖氨酸)氢溴酸盐、聚-L-鸟氨酸，
[0415]v1.来自2-4个氨基羧酸的肽，包括(1.)_(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸组成，优选选自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，优选甘氨酸二聚体、甘氨酸三聚体和甘氨酸四聚体，
[0416]vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相独立地选自氢、烷基、
羟基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相独立地选自氣、烷基、羟基烷基、二(羟基烧基)和三(羟基烷基)，其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链的，是饱和或不饱和的并且其中R1、R2> R3和R4中的至少一个不是氢，优选选自N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二 (2-羟基乙基)甘氨酸(bicine),
[0417]vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相独立地选自氢和羟基烷基，并且其中R5、R6和R7互相独立地选自氢、烷基和羟基烷基，其中优选地R5、R6和R7中的至少一个是羟基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链，饱和或不饱和的，其中所述化合物优选是三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)，
[0418]b.优选混合所述试剂与生物处理样品，
[0419]c.从所述生物处理样品中分离和/或纯化核酸，所述样品与所述试剂接触和/或与所述试剂混合，
[0420]d.任选定量和/或定性检测至少一部分经分离的靶标核酸，优选通过扩增待检测核酸片段进行定量检测。
[0421]按照第十二个实施方式，按照第十一个实施方式的所述方法的特征是以下特征中的一个或多个:
[0422]a.所述生物处理样品是在用于生物技术学生产的产品优选生物药物的纯化过程中得到的纯化部分，
[0423]b.所述生物药物是药物活性物质，优选包括一种或多种生物分子，
[0424]c.靶标核酸代表生物处理样品的污染，
[0425]d.靶标核酸包括`来自用于生成生物技术学所生产产品的宿主细胞和或宿主生物体的DNA，其中所述宿主细胞优选是永生化宿主细胞，
[0426]e.所述方法具有至少lpg，优选至少0.1pg的LOD (检测限)，
[0427]f.经分离靶标核酸的分离和/或检测是定量的，和/或
[0428]g.经分离靶标核酸的回收率是至少50%，优选至少75%，特别优选至少85%。
[0429]按照第十三个实施方式，按照第十一个实施方式或第十二个实施方式的方法的特征在于步骤(c.)中的分离包括以下步骤的至少一个，优选两个:
[0430]c.1)向按照(a.)预处理的生物处理样品中加入至少一种裂解剂，其中含有至少一种蛋白水解酶和/或离液剂的试剂作为裂解剂加入，
[0431]c.2)优选通过结合到运载体材料来分离靶标核酸，其中对于结合，优选加入包括醇和/或离液化合物的结合剂。
[0432]按照第十四个实施方式，提供了用于从获自纯化过程的不同生物处理样品中检测至少一个靶标核酸的方法，其特征在于所述靶标核酸是通过上述方法分离自需要研究的生物过程样品并且检测到至少一部分经分离的靶标核酸。
[0433]按照第十五个实施方式，按照第十四个实施方式的方法的特征是以下特征中的一个或多个:
[0434]a.用于生物处理样品预处理的试剂包括以下特征中的至少一个:
[0435]1.包括氨基的化合物和/或各种这些化合物的组合在试剂中的总浓度是5mM-500mM，优选 25mM-350mM，特别优选 50mM-250mM，
[0436]i1.试剂中去污剂的总浓度是0.1% (V / v)~5% (v / v),优选0.2% (v / v)-4%(v / v),并且优选 0.5% (v / v) -3% (v / v)并且也优选 I % (v / v) -3% (v / v),就是用曲通X-1OO而言优选0.2% (V / v) -0.5% (V / V),就是用吐温20而言优选I % (v /v)-5% (v / v)，所述一种或多种去污剂优选是非离子型表面活性剂并且特别优选选自第七个实施方式中定义的去污剂，
[0437]ii1.试剂中络合剂的总浓度是10mM-500mM，优选IOmM-1OOmM,优选地，所述络合剂选自第八个实施方式中定义的络合剂，
[0438]iv.试剂中蛋白的总浓度是 Img / mL-100mg / mL,优选 2mg / mL_25mg / mL,2mg / mL-10mg / mL并且也优选4mg / mL-10mg / mL,就IgG和BSA的使用而言优选2mg /mL-25mg / mL,优选地,所述蛋白选自第九个实施方式中定义的蛋白，
[0439]V.所述试剂的pH值优选在pH3_pH9的范围内，和/或
[0440]v1.所述试剂是按照实施方式6-10中一个或多个的试剂，
[0441]b.在按照第十一个实施方式从步骤(a.)得到的生物处理样品和试剂的反应混合物中，所述试剂的组分具有以下特征中的至少一种:
[0442]1.包括氨基的化合物和/或各种这些化合物的组合的总浓度是2.5mM-400mM，优选 12.5mM-280mM，特别优选 25mM-200mM，
[0443]i1.反应混合物中去污剂的总浓度是0.05% (v / v)-4% (v / v)，优选0.1 %(v / v)-3 % (v / v ),并且优选 0.25 % (v / v)-2.5 % (v / v)并且也优选 5% (v /v) -2.5% (v / v),就曲通 X-100 的使用而言优选 0.1 % (v / v) -0.4% (v / v),就吐温 20的使用而言优选0.5% (v / v)-4% (v / v)，优选地，所述去污剂是非离子型表面活性剂并且特别优选选自第七个实施方式中定义的去污剂，
[0444]ii1.反应混合物中络合剂的总浓度是5mM-400mM，优选5mM-80mM，和/或
[0445]iv.反应混合物中试剂所含蛋白的总浓度是0.5mg / ml / mL_80mg / mL,优选Img / mL-20mg / mL, Img / mL-8mg / mL 并且也优选 2mg / mL-8mg / mL,就 IgG 和 BSA的使用而言优选Img / mL-20mg / mL,
[0446]c.在步骤(a.)中，所述试剂与所述生物处理样品材以下列比例混合:1+4(V试剂+V样品材料)至4+1 (V试剂+V样品材料)，优选1+2 (V试剂+V样品材料)至2+1 (V试剂+V样品材料)，特别优选1+1 (V试剂+V样品材料)，
[0447]和/ 或
[0448]d.所述试剂不包括含有总浓度> 5mM的磷酸盐和/或柠檬酸盐的水性制剂。
[0449]按照第十六个实施方式，本发明涉及使用试剂以制备用于后续核酸分离和/或纯化的含有生物药物的生物处理样品，其特征在于所述试剂包括以下组分:
[0450]a.至少一种或多种包括氨基的化学物，所述化合物选自下组中的一种或多种:
[0451]1.极性-中性蛋白性a -氨基羧酸，优选天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸，
[0452]i1.非极性-疏水性蛋白性a -氨基羧酸，优选丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和缬氨酸，
[0453]ii1.碱性a-氨基羧酸，优选精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸，
[0454]iv.非蛋白性氨基羧酸，选自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高丝氨酸和D-缬氨酸，
[0455]V.氨基羧酸聚合物，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸组成，优选形成自相同、两种或几种不同的氨基羧酸单体，优选与卤化物联合，优选选自聚-L-赖氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚-L-赖氨酸盐酸盐、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-赖氨酸)氢溴酸盐、聚-L-鸟氨酸，
[0456]v1.来自2-4个氨基羧酸的肽，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸组成，优选选自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，优选甘氨酸二聚体、甘氨酸三聚体和甘氨酸四聚体，
[0457]vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相独立地选自氢、烷基、羟基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相独立地选自氣、烷基、羟基烷基、二(羟基烧基)和三(羟基烷基)，其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链的，是饱和或不饱和的并且其中R1、R2> R3和R4中的至少一个不是氢，优选选自N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二 (2-羟基乙基)甘氨酸(bicine),
[0458]vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相独立地选自氢和羟基烷基，并且其中R5、R6和R7互相独立地选自氢、烷基和羟基烷基，其中优选地R5、R6和R7中的至少一个是羟基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链，饱和或不饱和的，其中所述化合物优选是三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)，
[0459]以及任选的一种或多种以下组分:
[0460]b.至少一种去污剂，
[0461]c.至少一种络合剂，
[0462]d.至少一种蛋白， [0463]其中所述试剂优选是按照实施方式6-10的试剂。
[0464]按照第十七个实施方式，提供了用于从样品材料分离和/或纯化核酸的试剂盒，其含有按照实施方式6-10中一个或多个的试剂。
[0465]按照第十八个实施方式，按照第十七个实施方式的试剂盒优选包括至少一种或多种以下组分:
[0466]a.用于分离靶标核酸的运载体材料，优选含有二氧化硅、玻璃纤维或聚亚烷基，例如PP、PE / PP、PE，其中所述运载体材料以颗粒形式作为非织造织物、纤维、凝胶基质或膜使用，优选作为柱填充材料，其中所述颗粒优选采用珠的形式，优选磁性颗粒，更优选作为磁性珠，
[0467]b.一种或多种用作裂解剂的制剂，优选包括至少一种离液剂和/或至少一种来自非离子型去污剂组的去污剂，优选选自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22个碳原子的脂肪醇部分并且包括含有2-150个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯部分，
[0468]c.一种或多种酶，优选蛋白酶K、DNA酶和/或RNA酶，
[0469]d.一种或多种用作结合剂的制剂，优选包括至少一种离液剂和/或至少一种来自非离子型去污剂组的去污剂，优选选自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22个碳原子的脂肪醇部分并且包括含有2-150个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯部分，以及任选至少一种具有
1-5个碳原子的支链或直链醇，
[0470]e.一种或多种用作洗涤剂的制剂，所述制剂优选包括至少一种具有1-5个碳原子的支链或直链醇，以及任选的离液化合物和/或任选来自非离子型表面活性剂组的去污剂，
[0471]f.一种或多种用作洗脱剂的制剂，优选包括缓冲介质中的至少一种络合剂。实施例
[0472]本发明的可能实施方式和优点通过实施例方式在下列部分中描述。如下所述完成这些实施例。
[0473]实施例1:使用本发明所述试剂从各种纯化缓冲液中提取真核DNA
[0474]包括待分离和纯化核酸的起始样品是来自纯化缓冲液的溶液，其通常在柱色谱方法中使用，并且对于这个测试，向其中加入限定量的来自CHO细胞的经纯化染色体DNA。此样品是常规生物处理样品的良好模型体系。磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液用作纯化缓冲液:a)PBS pH7，b)含IM NaCl的PBS，pH7以及c)柠檬酸盐缓冲液pH3。这些样品的一部分另外与本发明所述试剂混合。所有样品然后经过自动化的核酸分离和纯化。在定量PCR(qPCR)中检测所得的核酸量。
[0475]下列方案如下:
[0476]在每种情况下，将来自CHO细胞的Ipg DNA加入到200 U I纯化缓冲液中。另外，在每种情况下，100 U I纯化缓冲液与来自CHO细胞的Ipg DNA混合，然后与100 yl本发明所述试剂(此处:0.1M甘氨酸溶液，pH3.2)混合。所得的样品用于后续自动化的核酸分离和纯化，其使用QIAsymphony病毒/细菌试剂盒(恰根(QIAGEN))在QIAsymphony自动化实验室自动机(QIAsymphony automatic laboratory automat)(恰根)上进行。然后，通过定量实时qPCR检测洗脱液中分离的DNA。
[0477]图1显示了所述实验结果的示意图:
[0478]通过在核酸分离和纯化之前向由纯化缓冲液(PBS、PBS+1M NaCl或柠檬酸盐缓冲液)和真核DNA组成的样品中加入本发明所述试剂，显著增加了核酸产率。这能够从与未用本发明所述试剂预处理的样品(ct=39.6-40)相比，这些样品明显较低的ct (阈值循环)值(ct = 35.5-36.5)看出。在含有柠檬酸盐缓冲液的部分中的DNA显示处于PCR-阴性-对照/非模版对照(NTC)区域的信号，例如没有核酸能够被分离并且因此检测到。只有在用本发明所述试剂处理之后，核酸能够从含有柠檬酸盐缓冲液的样品中提取并且检测到。结果显示，尽管起始样品有非常不同的性质，按照本发明的预处理不仅具有以下效果，即在一些情况下核酸的分离变得完全可能，而且用所有样品实现了相似的良好结果。
[0479]实施例2:通过加入各种试剂从相同的纯化缓冲液中提取真核DNA
[0480]有待分离核酸的起始样品是来自纯化缓冲液的同种溶液，其通常在离子交换色谱中使用，并且对于这个测试，向其中加入限定量的来自CHO细胞的经纯化染色体DNA。磷酸盐缓冲液用作纯化缓冲液:含有IM NaCl的PBS，pH7。能视作模型生物处理样品的这些样品另外与以下制剂之一混合:在两个实施方式中按照本发明的试剂或磷酸盐缓冲液。所有样品然后经过自动化的核酸分离和纯化。在定量PCR中检测所得的核酸量。
[0481]下列方案如下:
[0482]在每种情况下，将来自CHO细胞的IpgDNA加入到三份有200 U I纯化缓冲液的制剂中。然后，这些制剂与SOOiil的以下溶液之一混合:
[0483]1.本发明所述制剂，按照一个特别优选的实施方式(0.1M甘氨酸-甘氨酸，pH3.2)，
[0484]2?来自QIAsymphony病毒/细菌试剂盒(恰根)的裂解缓冲液，如本发明所述试剂的一个可能实施方式，
[0485]3.PBS，pH7.2。
[0486]然后如实施例1中所述，进行自动化的核酸分离和纯化。应注意的是，虽然纯化试剂盒的裂解缓冲液已经用于按照本发明的预处理，但是按照2.在后续核酸纯化中，完成如实施例1所述的完整纯化步骤，例如在核酸纯化中再次使用所述裂解缓冲液。通过实时qPCR并且通过与先前所制备标准系列的比较来完成洗脱液中经分离核酸的检测和纯化，对此也使用来自CHO细胞的纯化DNA。
[0487]图2和图3显示了所述实验结果的示意图:
[0488]如实施例 1 (图1)所示，图2也显示了由于使用本发明所述试剂对由纯化缓冲液(PBS+1M NaCl)组成的样品与真核DNA进行预处理，因此核酸产率显著增加。在后续进行样品的进一步消化和核酸的分离(使用QIAsymphony病毒/细菌方法，见上)之前，出于样品预处理目的而加入已知裂解缓冲液已经使ct值降至38。本发明所述试剂的优选实施方式引起甚至更为显著降低ct值至36。相对高许多的ct值(ct = 40)，其在加入PBS代替本发明所述试剂的样品(并且因此没有经过按照本发明进行预处理)中检测到，显示出从该样品中分离和纯化得到量小得多的核酸。纯磷酸盐缓冲液(PBS)对于核酸分离具有抑制效果，从而如同纯柠檬酸盐缓冲液样品(参见实施例1)，在PCR-阴性-对照(NTC)的区域检测到信号。这个发现也明显证明了在从典型生物处理样品例如纯化部分中分离核酸时可能出现问题，因为基于常用的纯化缓冲液，使用标准方法的经典纯化是不可能的。用来自纯化试剂盒的裂解剂进行额外预处理已经允许核酸的分离，但是程度小于用本发明所述试剂的更优选实施方式进行预处理。图3显示加入裂解剂产生13%的核酸回收率，而加入本发明所述试剂的优选实施方式产生57%的回收率，并且因此实现了 DNA产率的显著增加。
[0489]来自实施例1和实施例2的结果提供了证据，即作为在后续分离核酸之前用本发明所述试剂预处理样品的结果，在来自不同纯化缓冲液的核酸回收率方面实现了显著增加，所述缓冲液通常用于采用柱色谱的纯化方法。有时，只有通过按照本发明的预处理，核酸分离才变得可能。结果也显示使用经典分离和纯化方法而没有用本发明所述试剂预处理样品不能就样品而言实现核酸分离，在所述样品中待分离核酸包含于例如纯的含有磷酸盐或含有柠檬酸盐的纯化缓冲液中。相反，高磷酸盐和柠檬酸盐含量对于核酸分离以及因此对于洗脱液中核酸回收具有抑制效果。因此，来自生物处理样品的核酸纯化在没有特别措施的情况下通常是不可能的，尤其是当所述样品仅含有少量的核酸时。
[0490]通过使用按照本发明的试剂和方法，在经分离核酸产率方面有显著的改善，其反映为例如明显增加的核酸回收率，所述核酸仅仅以小量存在。由于其灵敏性，按照本发明的方法因此提供了关于在生物药物活性物质纯化中和之后残余宿主细胞DNA和/或其他核酸污染物含量的可靠得多的信息，尤其是当纯化部分中仅仅存在极少小量的污染核酸(例如宿主生物体的核酸)。用仅Ipg DNA /样品成功地进行了本实验，例如是IOpg宿主细胞DNA /剂药物产品的官方推荐限度的十分之一。因此使用按照本发明的试剂和方法代表了非常灵敏、高效、有效和可靠的核酸分离和纯化方法，其特别适于针对少量残余宿主细胞核酸定量监测和评估生物处理样品的纯化过程直到最终产物。
[0491]实施例3:通过本发明所述试剂的方式，在蛋白影响下从等份相同纯化缓冲液提取真核DNA[0492]用于该测试的起始样品是来自纯化缓冲液的溶液，向所述溶液中加入定义量的来自CHO细胞的经纯化染色体DNA。如实施例2所示，使用的纯化缓冲液是通常在柱色谱方法中使用的磷酸盐缓冲液:含有IM NaCl的PBS，pH7。也能视作模型生物处理样品的这些样品与本发明所述含有蛋白的试剂混合，测试仅仅蛋白浓度不同的试剂的各种实施方式。
[0493]下列方案如下:
[0494]在每种情况下，将来自CHO细胞的Ipg DNA加入到四份有200 U I纯化缓冲液的制剂中。然后这些制剂与800 ill的0.2M N，N-二(2-羟基乙基)甘氨酸溶液混合，该溶液含有0、5、50或IOOmg / ml浓度的BSA。然后进行如实施例1所述的自动化核酸分离和纯化以及后续分析。
[0495]图4显示向本发明所述试剂加入BSA使得核酸回收率显著增加超过10%。试剂中5mg / ml BSA的浓度足以达到效果。进一步显著提高蛋白浓度并不显示出对于回收率的任意其他正面效应。结果显示，氨基化合物与蛋白的组合会带来本发明所述试剂有效性的优化。
[0496]实施例4:通过本发明所述试剂和各种蛋白的方式，在从等份的相同纯化缓冲液提取真核DNA
[0497]用于此测试的起始样品是两种不同的纯化缓冲液，向其中加入限定量的来自CHO细胞的经纯化染色体DNA以及限定量的蛋白，其中使用蛋白BSA和IgG。使用的纯化缓冲液是通常在柱-色谱方法中使用的磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液:含有IM NaCl的PBS，pH7和柠檬酸盐，pH3.2。然后制备的样品与本发明所述试剂混合用于后续的核酸分离和纯化。
[0498]下列方案如下:`[0499]在每种情况下，将来自CHO细胞的IpgDNA加入到两份有200 ill PBS(含有IMNaCl)的制剂和三份有柠檬酸盐的制剂中，从而得到基于所用纯化缓冲液的模型生物处理样品。在每种情况中随后向一份PBS制剂和一份柠檬酸盐制剂加入5mg / mL IgG,而向另一份柠檬酸盐制剂加入5mg / mL BSA。向每个如此安排的测试制剂中加入800 的0.2MN，N-二(2-羟基乙基)甘氨酸溶液。然后如实施例1所述进行核酸的分离和纯化以及后续分析。
[0500]图5以图形证明了实施例3的结果。向生物过处理型样品加入BSA以及IgG对于所加入DNA的核酸回收率具有显著正面效应，其中IgG的正面效应与BSA的正面效应相比甚至稍高，高出15%的回收率。此外，实施例3和实施例4的结果显示对于核酸回收率的正面效应能够以两种方式实现:a)通过将蛋白和有氨基化合物的本发明所述试剂连续加入模型生物处理样品(实施例4)，或b)通过一步加入，其中本发明所述试剂包含蛋白和氨基化合物的组合。
[0501]实施例5:通过加入本发明所述试剂的各种制剂从等份的相同纯化缓冲液中提取真核DNA
[0502]具有待分离和纯化核酸的起始样品是来自纯化缓冲液的相同溶液，向所述溶液中加入限定量的来自CHO细胞的经纯化染色体DNA。如实施例1-4，使用的纯化缓冲液是通常在柱-色谱方法中用作纯化缓冲液的磷酸盐缓冲液:含有IM NaCl的PBS，pH7。能视作模型生物处理样品的这些样品另外与以下制剂之一混合:在13个不同的实施方式中提供自身具有DNA或本发明所述试剂的样品。所有样品随后经过自动化的核酸分离和纯化。在定量PCR中检测所得的核酸量。
[0503]下列方案如下:
[0504]在每种情况下，将来自CHO细胞的Ipg DNA加入到14种制剂中，所述制剂各具有
500 U I的纯化缓冲液。然后，这些制剂与500 ill的以下溶液之一混合:
[0505]1.有IM NaCl的PBS纯化缓冲液，pH7，含有来自CHO细胞的Ipg DNA,
[0506]2.试剂 Gl
[0507]3.试剂 G2
[0508]4.试剂 GGl
[0509]5.试剂 GG2
[0510]6.试剂 GG3
[0511]7.试剂 BI
[0512]8.试剂 B2
[0513]9.试剂 B3
[0514]10.试剂 B4
[0515]11?试剂 Tl
[0516]12.试剂丁2
[0517]13.试剂丁3
[0518]14?试剂 T4，
[0519]其中溶液2-14代表具有表1所列组分的本发明所述试剂的各个实施方式。
[0520]表1:
[0521]本发明所述试剂的各种实施方式
[0522]
【权利要求】
1.一种从样品材料中分离和/或纯化核酸的方法，其中所述样品材料是生物处理样品并且其中所述生物处理样品是在用于生物技术产品的纯化过程中得到的纯化部分并且所述待分离核酸代表所述生物处理样品的污染，其中所述方法包括以下步骤: a.向所述样品材料加入试剂，其中所述试剂包括至少一种或多种含氨基的化合物，所述化合物选自下组中的一种或多种: 1.极性-中性蛋白性α-氨基羧酸，优选天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸， ?.非极性-疏水性蛋白性α-氨基羧酸，优选丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和缬氨酸， ii1.碱性α-氨基羧酸，优选精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸， iv.非蛋白性氨基羧酸，选自丙氨酸、D-丙氨酸、L-高丝氨酸和D-缬氨酸， V.氨基羧酸聚合物，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸组成，优选形成自相同、两种或几种不同的氨基羧酸单体，优选与卤化物联合，优选选自聚-L-赖氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚-L-赖氨酸盐酸盐、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-赖氨酸)氢溴酸盐、聚-L-鸟氨酸， v1.来自2-4个氨基羧酸的肽，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸组成，优选选自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，优选甘氨酸二聚体、甘氨酸三聚体和甘氨酸四聚体， vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相独立地选自氢、烷基、羟基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相独立地选自氣、烷基、羟基烷基、二(羟基烷基)和三(羟基烷基)，其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链的，是饱和或不饱和的并且其中R1、!?2、!?3和R4中的至少一个不是氢，优选选自N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二 (2-羟基乙基)甘氨酸(bicine), vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相独立地选自氢和羟基烷基，并且其中R5、R6和R7互相独立地选自氢、烷基和羟基烷基，其中优选R5、R6和R7中的至少一个是羟基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链，饱和或不饱和的，其中所述化合物优选是三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)， b.优选混合该试剂与样品材料， c.从所述样品材料中分离和/或纯化核酸，所述样品材料已经与所述试剂接触和/或与所述试剂混合， d.任选定量和/或定性检测至少一部分经分离的核酸，优选通过扩增待检测核酸片段进行定量检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物技术产品是生物药物并且待分离的污染核酸是用于生成所述生物药物的宿主细胞的核酸和/或是病毒核酸并且其中实施检测步骤d.以分析这种污染核酸是否包含于所述生物处理样品中。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下特征中的至少一种: .1.向所述样品材料加入的按照步骤(a.)的试剂不含离液试剂，或 I1.如果在步骤(C.)中加入了至少一种含有离液剂的试剂，步骤(c.)中加入含有离液剂的试剂在缺乏具有1-5个碳原子的支链或直链烷醇情况下第一次发生，并且其中，具有待分离和/或纯化核酸的所述样品材料是水性组合物，即来自用于生物技术学生产的产品的纯化过程的纯化部分，包括生物分子和/或生物体，其中所述生物分子和/或生物体具有以下特征中的至少一种:L.所述生物分子和/或生物体选自蛋白、病毒和/或疫苗， i1.所述生物分子和/或生物体是药学上活性物质， ii1.所述生物分子是生物技术学产生的分子，其通过遗传修饰或未修饰的生物产生。
4.如权利要求1-3中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述步骤c.的分离和/或纯化包括至少以下子步骤: L.任选地，优选在没有支链或直链烷醇的情况下，通过向如权利要求1所述步骤(a.)，或(a.)和(b.)得到的样品材料与试剂的组合物中加入一种或多种酶，优选蛋白酶K，任选与含有离液剂的试剂联用来降解蛋白和/或污染样品组分， i1.加入制剂，所述制剂包括至少一种离液化合物和/或至少一种来自非离子型去污剂组的去污剂，优选选自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22个碳原子的脂肪醇部分，并且包括含有2-150个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯部分，优选用于调节或预定义用于结合核酸的结合条件， ii1.任选混合和/或孵育， iv.加入 包括至少一种具有1-5个碳原子的支链或直链烷醇的制剂， 任选额外离液化合物和/或 任选来自非离子型去污剂组的去污剂，优选选自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22个碳原子的脂肪醇部分，并且包括含有2-150个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯部分， 用于调节结合核酸的结合条件， V.使核酸结合运载体材料，优选含有二氧化硅、玻璃纤维或聚亚烷基，例如PP、PE /PP、PE，其中所述运载体材料以颗粒形式作为非织造织物、纤维、凝胶基质或膜使用，优选作为柱填充材料，其中所述颗粒优选采用珠的形式，优选磁性颗粒，并且优选作为磁性珠， v1.任选用一种或多种制剂洗涤结合的核酸，所述制剂用作洗涤剂，优选包括至少一种具有1-5个碳原子的支链或直链醇，和任选额外的离液化合物，和/或任选来自非离子型表面活性剂组的去污剂， vi1.任选用一种或多种制剂洗脱，其用作洗脱剂，优选包括缓冲介质中的至少一种络合剂， 其中，如权利要求4所述的步骤1.和i1.的制剂或如权利要求4所述的1.和i1.的混合物能够以可变顺序加到如权利要求1所述(a.)或(a.)和(b.)得到的样品材料和试剂的组合物中。
5.如权利要求1-4中一项或多项所述的方法，其特征在于，除了前述步骤以外，发生以下步骤中的至少一个额外步骤: 1.完成样品材料中含有的细胞的裂解，其中在向如权利要求1步骤(a.)所述的样品材料加入试剂之前进行裂解， i1.纯化所述样品材料以在向如权利要求1步骤(a.)所述样品材料加入试剂之前，在一个或多个连续步骤中去除样品材料的细胞片段和/或分子和/或离子组分，其中这些步骤优选包括色谱技术，和/或 iii.孵育从如权利要求1所述工艺权利要求(a.)得到的样品材料与试剂的组合物，并且优选混合后的样品材料与试剂的组合物，所述组合物从如权利要求1所述的工艺权利要求(a.)和(b.)得到。
6.如权利要求1-5中一项或多项所述的方法,其特征在于,所述生物技术学生产的生物分子通过遗传修饰或未修饰的生物产生，优选选自哺乳动物细胞系、鸟类细胞系、昆虫细胞系、鱼类细胞系、植物细胞系和克隆的微生物，其中所述哺乳动物细胞系优选包括以下细胞系:人细胞系、来自马细胞的细胞系、来自牛细胞的细胞系、来自猪细胞的细胞系、来自袋鼠细胞的细胞系、来自绵羊细胞的细胞系、来自猴细胞的细胞系、来自狗细胞的细胞系、来自猫细胞的细胞系、来自貂鼠细胞的细胞系、来自兔细胞的细胞系、来自仓鼠细胞的细胞系、来自大鼠细胞的细胞系和来自小鼠细胞的细胞系，并且特别优选细胞系Hek293 (人胚胎肾细胞系)、HeLa(人宫颈癌)、Vero (正常成年非洲绿猴的肾脏)、MDCK(可卡犬肾)、CHO (中国仓鼠卵巢细胞)、SP2(小鼠骨髓瘤)、NS0(小鼠骨髓瘤)、杂交瘤细胞系和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
7.一种用于从生物处理样品中分离和/或纯化至少一种靶标核酸的方法，其中所述生物处理样品是在用于生物技术学所生产产品的纯化过程中得到的纯化部分并且其中所述靶标核酸代表所述生物处理样品的污染，其特征在于所述方法包括以下步骤: a.用试剂预处理所述生物处理样品，其中所述试剂包括至少一种或多种具有氨基的化合物，所述化合物选自下组中的一种或多种: i.极性-中性蛋白性α-氨基羧酸，优选天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸， ii.非极性-疏水性蛋白性α-氨基羧酸，优选丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和缬氨酸， iii.碱性α-氨基羧酸，优选精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸， iv.非蛋白性氨基羧酸，选自丙氨酸、D-丙氨酸、L-高丝氨酸和D-缬氨酸， V.氨基羧酸聚合物，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸组成，优选形成自相同、两种或几种不同的氨基羧酸单体，优选与卤化物联合，优选选自聚-L-赖氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚-L-赖氨酸盐酸盐、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-赖氨酸)氢溴酸盐、聚-L-鸟氨酸， vi.来自2-4个氨基羧酸的肽，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸组成，优选选自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，优选甘氨酸二聚体、甘氨酸三聚体和甘氨酸四聚体， vii.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相独立地选自氢、烷基、羟基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相独立地选自氣、烷基、羟基烷基、二(羟基烷基)和三(羟基烷基)，其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链的，是饱和或不饱和的并且其中R1、!?2、!?3和R4中的至少一个不是氢，优选选自N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二 (2-羟基乙基)甘氨酸(bicine), viii.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相独立地选自氢和羟基烷基，并且其中R5、R6和R7互相独立地选自氢、烷基和羟基烷基，其中优选地R5、R6和R7中的至少一个是羟基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链，饱和或不饱和的，其中所述化合物优选是三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)， b.优选混合所述试剂与生物处理样品， c.从所述生物处理样品中分离和/或纯化核酸，所述样品与所述试剂接触和/或与所述试剂混合， d.任选定量和/或定性检测至少一部分经分离的靶标核酸，优选通过扩增待检测核酸片段进行定量检测。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(c.)的分离包括以下步骤中的至少一种，优选两种: c.1)向按照(a.)预处理的生物处理样品中加入至少一种裂解剂，其中含有至少一种蛋白水解酶和/或离液剂的试剂作为裂解剂加入， c.2)优选通过结合到运载体材料来分离靶标核酸，其中对于结合，优选加入包括醇和/或离液化合物的结合剂。
9.一种用于从来自纯化过程的不同生物处理样品中检测至少一个靶标核酸的方法，其特征在于所述靶标核酸通过如权利要求7或8所述的方法分离自待研究的生物处理样品并且检测到至少一部分经分离的靶标核酸。
10.如权利要求 1-9中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述下列特征中的一种或多种: a.所述生物技术学生产的产品是生物药物， b.所述生物处理样品包括生物药物，其中所述生物药物是包括一种或多种生物分子的药物活性物质， c.所述生物技术学生产的产品是生物药物，其中所述生物药物不是核酸并且其中优选地，所述生物药物是肽或蛋白， d.所述生物处理样品包括纯化和/或配制的生物技术学生产的产品，所述产品优选是生物药物。
11.如权利要求1-10中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述纯化部分具有以下特征中的一种或多种: a.所述纯化部分基本不含细胞， b.所述纯化部分是色谱洗脱液，和/或 c.除待分离的靶标核酸以外，所述纯化部分还包括作为生物技术学所生产产品的生物药物、一种或多种缓冲液物质和/或盐。
12.如权利要求1-11中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述方法具有以下特征中的至少一种: a.所述靶标核酸包括来自用于生成生物技术学所生产产品的宿主细胞和/或宿主生物体的DNA，其中所述宿主细胞优选是永生化宿主细胞， b.所述目标核酸是用于生成生物技术学所生产产品的宿主细胞的核酸，尤其是宿主细胞DNA，和/或是病毒核酸。
13.如权利要求1-12中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述方法具有以下特征中的一种或多种:a.所述方法具有至少lpg，优选至少0.1pg的LOD (检测限)， b.经分离靶标核酸的分离和/或检测是定量的，和/或 c.经分离靶标核酸的回收率是至少50%，优选至少75%，特别优选至少85%。
14.如权利要求1-13中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述方法具有以下特征中的一种或多种: a.所述靶标核酸分离自从用于生物技术学所生产产品的纯化过程中得到的不同纯化部分， b.在纯化的终产物和/或在一个或多个纯化工艺过程所得生物处理样品中检测用于生成所述生物药物的细胞的剩余核酸和/或其他核酸污染物，和/或 c.所述靶标核酸分离自所述纯化过程的各种或每个纯化部分，包括最终纯化的终产 物。
15.如权利要求1-14中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述方法具有一种或多种以下特征: a.实施所述方法用于监测纯化的过程， b.实施所述方法用于分析经纯化终产物中含有的污染靶标核酸量没有超过需要和/或允许的量，和/或 c.检测到至少一部分经分离的靶标核酸并且确定所分析的生物处理样品中污染靶标核酸的量是否在允许和/或需要的最大限度之上或之下。
16.如权利要求1-15中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述用于预处理的试剂也包括至少一种或多种以下组分: -至少一种去污剂或去污剂的混合物，优选选自非离子型表面活性剂，包括烷基葡糖苷和/或聚氧乙烯烷基苯基醚， -至少一种络合剂或络合剂的混合物， 和/或 -至少一种蛋白或蛋白的混合物，其中所述蛋白优选是优选选自白蛋白和/或球蛋白的球状蛋白。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述去污剂选自下组中的一种或多种: a.烷基葡糖苷,优选选自聚山梨酯,优选选自聚山梨酯20、聚山梨酯40和聚山梨酯80，所述去污剂特别优选是聚山梨酯20(吐温20)。 b.聚氧乙烯烷基苯基醚，优选是辛苯聚醇9(曲通X-100)和诺乃洗涤剂P-40。
18.如权利要求16或17所述的方法，其特征在于，所述络合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(氨基乙基醚)-N，N'-四乙酸(EGTA)和乙二胺二琥珀酸(EDDS)。
19.如权利要求16-18中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述蛋白选自下组中的一种或多种: a.选自动物白蛋白、植物白蛋白和/或人白蛋白的白蛋白，优选牛血清白蛋白(BSA), b.选自动物球蛋白、植物球蛋白和/或人球蛋白的球蛋白，优选Y-球蛋白。
20.如权利要求1-19中一项或多项所述的方法，其特征在于 a.用于样品材料预处理的试剂具有以下特征中的至少一个: i.包括氨基的化合物和/或各种这些化合物的组合在试剂中的总浓度是5mM-500mM，优选 25mM-350mM，特别优选 50mM-250mM， i1.试剂中去污剂的总浓度是0.1 % (V / v)-5% (v / v),优选0.2% (v / v) -4%(v / v),并且优选 0.5% (v / v)-3% (v / v)且也优选 I % (v / v) -3% (v / v),就曲通X-100的使用而言优选0.2% (v / v) -0.5% (v / v),就吐温20的使用而言优选I % (v /v)-5% (v / v)，其中所述去污剂优选是非离子型表面活性剂， ii1.试剂中的络合剂的总浓度是10mM-500mM，优选IOmM-1OOmM, iv.试剂中一种蛋白或多种蛋白的总浓度是Img/ mL-100mg / mL,优选2mg /mL-25mg / mL, 2mg / mL-10mg / mL 并且更优选 4mg / mL-10mg / mL,就 IgG 和 BSA 的使用而言优选2mg / mL-25mg / mL, v.所述试剂的pH值优选在pH3-pH9的范围内， b.在样品材料和试剂的反应混合物中试剂的组分具有至少一种以下特征:I.包括氨基的化合物和/或各种这些化合物的组合在反应混合物中的总浓度是,2.5mM-400mM，优选 12.5mM-280mM，特别优选 25mM-200mM， i1.试剂中去污剂的总浓度是0.05% (V / v) -4% (v / v),优选0.1% (v / v) -3%(v / v),并且优选 0.25% (v / v) -2.5% (v / v)且也优选 5% (v / v) -2.5% (v / v)，就曲通X-100的使用而言优选0.1% (v / v)-0.4% (v / v),就吐温20的使用而言优选，0.5% (v / v)-4% (v / v)，其中非离子型表面活性剂用作去污剂， ii1.反应混合物中络合剂的总浓度是5mM-400mM，优选5mM-80mM， iv.反应混合物中一种蛋白或多种蛋白的总浓度是0.5mg / mL-80mg / mL,优选Img /mL-20mg / mL, Img / mL-8mg / mL 且也优选 2mg / mL-8mg / mL,就 IgG 和 BSA 的使用而言优选 Img / mL-20mg / mL, c.所述试剂与所述样品材料以下列比例混合:1+4(V试剂+V样品材料)至4+1(V试剂+V样品材料)，优选1+2 (V试剂+V
样品材料 )至2+1 (V试剂+V

样品材料 )，特别优选1+1 (V_+V样品材料)，和/或 d.所述试剂不包括含有总浓 度>5mM的磷酸盐和/或柠檬酸盐的水性制剂。
21.如权利要求1-20中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述试剂包括至少一种或多种含氨基的化合物，所述化合物选自下组1-viii中的一种或多种: ，1.天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸， i1.丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和缬氨酸， ii1.精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸， iv.^ -丙氨酸、D-丙氨酸、L-高丝氨酸和D-缬氨酸， V.聚-L-赖氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚-L-赖氨酸盐酸盐、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-赖氨酸)氢溴酸盐、聚-L-鸟氨酸， v1.甘氨酸二聚体、甘氨酸三聚体、甘氨酸四聚体和二肽(Ala-Glu)， vi1.N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N，N-二(2-羟基乙基)甘氨酸(bicine), 和/或 vii1.三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)。
22.如权利要求1-21中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述试剂包括至少一种选自N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)、N,N_二(2-羟基乙基)甘氨酸(bicine)和三(羟基甲基)-氨基甲烷(Tris)的化合物作为含氨基的化合物。
23.如权利要求1-22中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述试剂至少包括甘氨酸、Gly-Gly、N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸和/或N，N-二(2-羟基乙基)甘氨酸作为含氨基的化合物，至少一种络合剂，以及至少一种，优选至少两种去污剂和任选至少一种蛋白。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述试剂包括N，N-二(2-羟基乙基)甘氨酸。
25.如权利要求23或24所述的方法，其特征在于，所述用于步骤(a.)的试剂包括聚氧乙烯烷基苯基醚和/或聚山梨酯作为去污剂。
26.如权利要求23-25中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述试剂包括至少一种蛋白，优选球状蛋白，更优选选自IgG或BSA的蛋白。
27.如权利要求1-26中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述用于步骤(a.)中预处理的试剂没有任何裂解性质。
28.一种在用于从样品材料中分离和/或纯化核酸，尤其是用于所述样品材料制备的方法中使用的试剂，其中所述样品材料是生物处理样品并且其中所述生物处理样品是在用于生物技术学所生产产品的纯化过程中得到的纯化部分并且其中所述待分离核酸代表所述生物处理样品的污染，所述试剂包括以下组分: a.至少一种或多种包括氨基的化合物，所述化合物选自一种或多种下列组: I.极性-中性蛋白性a-氨基羧酸，优选天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸，II非极性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸，优选丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和缬氨酸， III.碱性a-氨基羧酸，优选精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸， iv.非蛋白性氨基羧酸，选自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高丝氨酸和D-缬氨酸， V.氨基羧酸聚合物，包括在(1.)-(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸组成，优选形成自相同、两种或几种不同的氨基羧酸单体，优选与卤化物联合，优选选自聚-L-赖氨酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚-L-赖氨酸盐酸盐、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-赖氨酸)氢溴酸盐、聚-L-鸟氨酸， v1.来自2-4个氨基羧酸的肽，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸组成，优选选自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，优选甘氨酸二聚体、甘氨酸三聚体和甘氨酸四聚体， viI.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相独立地选自氢、烷基、羟基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相独立地选自氣、烷基、羟基烷基、二(羟基烷基)和三(羟基烷基)，其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链的，是饱和或不饱和的并且其中R1、R2、R3和R4中的至少一个不是氢，优选选自N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二 (2-羟基乙基)甘氨酸(bicine), viiI.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相独立地选自氢和羟基烷基，并且其中R5、R6和R7互相独立地选自氢、烷基和羟基烷基，其中优选地R5、R6和R7中的至少一个是羟基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链，饱和或不饱和的，其中所述化合物优选是三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)， 和 b.至少一种去污剂或去污剂的混合物，优选选自非离子型表面活性剂，包括烷基葡糖苷和/或聚氧乙烯烷基苯基醚， c.任选至少一种络合剂或络合剂的混合物， 和 d.至少一种蛋白或蛋白的混合物，其中所述蛋白选自白蛋白和/或球蛋白。
29.如权利要求28所述的试剂，其特征在于，所述试剂还具有一种或多种如权利要求16-27所限定的特征。
30.用于制备含有生物药物的生物处理样品的试剂在后续核酸分离和/或纯化中的应用，其中所述生物处理样品是在生物药物的纯化过程中得到的纯化部分并且其中所述待分离核酸代表生物处理样品的污染，其特征在于所述试剂包括以下组分: a.至少一种或多种包括氨基的化学物，所述化合物选自下组中的一种或多种: . 1.极性-中性蛋白性a-氨基羧酸，优选天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸， i1.非极性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸，优选丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和缬氨酸， ii1.碱性a-氨基羧酸，优选精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸， iv.非蛋白性氨基羧酸，选自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高丝氨酸和D-缬氨酸， V.氨基羧酸聚合物，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸组成，优选形成自相同、两种或几种不同的氨基羧酸单体，优选与卤化物联合，优选选自聚-L-赖氨 酸、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚-L-赖氨酸盐酸盐、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-赖氨酸)氢溴酸盐、聚-L-鸟氨酸， v1.来自2-4个氨基羧酸的肽，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一种氨基羧酸，优选由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸组成，优选选自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，优选甘氨酸二聚体、甘氨酸三聚体和甘氨酸四聚体， vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相独立地选自氢、烷基、羟基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相独立地选自氣、烷基、羟基烷基、二(羟基烷基)和三(羟基烷基)，其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链的，是饱和或不饱和的并且其中R1、R2、R3和R4中的至少一个不是氢，优选选自N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二 (2-羟基乙基)甘氨酸(bicine), vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相独立地选自氢和羟基烷基，并且其中R5、R6和R7互相独立地选自氢、烷基和羟基烷基，其中优选地R5、R6和R7中的至少一个是羟基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的链长度，其是支链或直链，饱和或不饱和的，其中所述化合物优选是三(羟基甲基)_氨基甲烷(Tris)， 以及任选的一种或多种以下组分: b.至少一种去污剂， c.至少一种络合剂， d.至少一种蛋白，其中所述试剂优选是如权利要求16-27中一项或多项限定的试剂。
31.如权利要求30所述的应用，其特征在于，所述试剂包括于用于从生物处理样品分离和/后纯化核酸的试剂盒中，并且其中所述试剂盒任选还包括至少一种或多种以下组分: a.用于分离靶标核酸的运载体材料，优选含有二氧化硅、玻璃纤维或聚亚烷基，例如PP、PE / PP、PE，其中所述运载体材料以颗粒形式作为非织造织物、纤维、凝胶基质或膜使用，优选作为柱填充材料，其中所述颗粒优选采用珠的形式，优选磁性颗粒，更优选作为磁性珠， b.一种或多种用作裂解剂的制剂，优选包括至少一种离液剂和/或至少一种来自非离子型去污剂组的去污剂，优选选自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22个碳原子的脂肪醇部分并且包括含有2-150个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯部分， c.一种或多种酶，优选蛋白酶K、DNA酶和/或RNA酶， d.一种或多种用作结合剂的制剂，优选包括至少一种离液剂和/或至少一种来自非离子型去污剂组的去污剂，优选选自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22个碳原子的脂肪醇部分并且包括含有2-150个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯部分，以及任选地至少一种具有1-5个碳原子的支链或直链醇， e.一种或多种用作洗涤剂的制剂，所述制剂优选包括至少一种具有1-5个碳原子的支链或直链醇，以及任选的离液化合物和/或任选来自非离子型表面活性剂组的去污剂， f.一种或多种用作洗脱剂的制剂，优选包括缓`冲介质中的至少一种络合剂。
【文档编号】C12N15/10GK103764827SQ201280031887
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年7月4日 优先权日:2011年7月4日
【发明者】P·波尔什斯基 申请人:恰根有限公司