液体疫苗制剂的制作方法
【专利摘要】本文件提供了制备和使用用于经口施用的液体疫苗制剂所涉及的方法和材料。例如，提供了制备和使用用于经口施用的液体疫苗制剂的方法和材料，所述液体疫苗制剂包括冻干或干燥的疫苗组分（例如冻干的致病体，例如冻干的轮状病毒制剂）和液体食用油组合物（例如含有一种或多种中链甘油三酯的液体食用油组合物）。在一些情况下，提供了包括缓冲剂组分（例如CaCO3）的液体疫苗制剂。
【专利说明】液体疫苗制剂
[0001]与相关申请的交叉参考
本申请要求于2011年4月28日提交的美国临时专利申请系列号61/480，118的优先权，所述申请通过引用整体并入本文。
[0002]发明背景
1.【技术领域】
本文件关于制备和使用用于经口施用的液体疫苗制剂所涉及的方法和材料。例如，本文件涉及用于制备和使用经口施用的液体疫苗制剂的方法和材料，所述液体疫苗制剂包括冻干或干燥的疫苗组分(例如冻干的致病体，例如冻干的轮状病毒制剂)和液体食用油组合物(例如含有一种或多种中链甘油三酯的液体食用油组合物)。在一些情况下，液体疫苗制剂可以包括缓冲剂组分(例如CaCO3X
[0003]2.背景信息
一般而言，疫苗是设计为改善哺乳动物对特定病原体的免疫力的生物制剂。疫苗可以含有与能够引起疾病的病原体类似的一种或多种组分且通常由减弱形式的病原体制备。疫苗组分设计为刺激哺乳动物的免疫系统，以将疫苗的组分和/或与它们类似的病原体识别为外源的，从而允 许哺乳动物的免疫系统在未来遇到该病原体时，快速破坏该病原体。
[0004]发明概述
本文件提供了与液体疫苗制剂有关的方法和材料。例如，本文件提供了液体疫苗制剂以及用于制备和使用液体疫苗制剂的方法和材料。液体疫苗制剂可以包括冻干或干燥的疫苗组分(例如冻干的轮状病毒疫苗，例如冻干的RotaShield)和液体食用油组合物(例如含有一种或多种中链甘油三酯的液体食用油组合物)。如本文描述的，干燥疫苗组分例如冻干的轮状病毒可以连同液体食用油组合物一起配制成悬浮体，以允许疫苗组分以液体形式被运送、贮存且递送至哺乳动物，其中疫苗组分保持有效滴度水平，而无需维持在低于4°C的温度(例如冷藏库或冷冻器温度)。例如，本文提供的液体疫苗制剂可以以稳定方式在室温下保持延长的时间段(例如超过30天)，以致于得以保留有效滴度水平(例如每mL至少IxlO4卩遼斑形成单位(PFU)或突光灶单位(fluorescent focus units) (FFU)(对于病毒)或集落形成单位(CFU)(对于微生物)的滴度)。具有提供在室温下保持稳定的液体形式的疫苗制剂的能力可以允许用户以液体递送疫苗制剂，而无需用户或其他人在护理点或在递送到护理点沿途的点将干燥组合物重构或以别的方式配制成液体组合物。在一些情况下，具有提供在室温下保持稳定的液体形式的疫苗制剂的能力可以允许免除对用于疫苗制剂的分配和贮存的冷藏条件的需要。
[0005]在一些情况下，本文提供的疫苗制剂可以包括缓冲剂组分(例如CaCO3X例如，配置用于经口递送的疫苗组分可连同在液体食用油组合物中的一种或多种缓冲剂一起配制。本文提供的疫苗制剂的缓冲剂组分可以以有效减少胃液对疫苗组分的作用的量被包括，从而增加疫苗组分在经口施用于个体后的活力。如本文描述的，干燥疫苗组分可以连同在液体食用油组合物中的一种或多种干燥或粉末缓冲剂一起配制以制备悬浮体，其中在该悬浮体内的疫苗组分和缓冲剂组分之间具有最小或无相互作用，从而允许疫苗组分在室温或更暖下保持稳定延长的时间段(例如超过30天)，而无需将缓冲剂组分分开容纳在与容纳疫苗组分的容器不同的容器中。因此，具有提供在室温下保持稳定且包括一种或多种缓冲剂组分的液体形式的疫苗制剂的能力，可以允许制造商给用户提供在容器中的即用型疫苗制剂，其不需要与用于缓冲剂组分的室分开的用于疫苗组分的室。
[0006]一般而言，本文件的一个方面的特征在于用于经口递送至哺乳动物的液体疫苗制剂。制剂包含液体形式的食用油和以悬浮体形式存在于食用油内的活病原体，或基本上由液体形式的食用油和以悬浮体形式存在于食用油内的活病原体组成，其中当在37°C下贮存30天时，疫苗制剂经历活病原体的活力减少不超过50%。在多个实施方案中，活病原体可以包括活病毒、活微生物或活寄生虫。制剂可以包含干燥或冻干的活病原体。制剂可以包含以悬浮体形式存在于食用油内的缓冲剂组分。当在37°C下贮存30天时，疫苗制剂可以经历活病原体的活力减少不超过25%。当在37°C下贮存30天时，疫苗制剂可以经历活病原体的活力减少不超过10%。当在37°C下贮存30天时，疫苗制剂可以经历活病原体的活力减少不超过5%。当在37°C下贮存30天时，疫苗制剂可以经历活病原体的活力减少不超过1%。
[0007]在另一个方面，本文件的特征在于包含下述或基本上由下述组成的疫苗制剂:液体形式的食用油、以悬浮体形式存在于食用油内的缓冲剂组分，和以悬浮体形式存在于食用油内的活病原体(例如活病毒、活微生物或活寄生虫)，其中(a)疫苗制剂具有每mL疫苗制剂至少最小病原体滴度的滴度，或(b)当在37°C下贮存30天时，疫苗制剂经历活病原体的活力减少不超过50%。食用油可以包含中链甘油三酯。中链甘油三酯的合适脂肪酸可以包括例如己酸、辛酸、癸酸和/或月桂酸。至少40%的食用油可以包含中链甘油三酯。至少50%的食用油可以包含中链甘油三酯。至少60%的食用油可以包含中链甘油三酯。至少65%的食用油可以包含中链甘油三酯。食用油可以包含椰子油、玉米油、棉籽油、橄榄油、棕榈油、花生油、菜籽油、红花油、芝麻油、大豆油或向日葵油。食用油可以是橄榄油、大豆油或向曰葵油。缓冲剂组分可以包含碳酸钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、氢氧化铝或氢氧化镁。缓冲剂组分可以是碳酸氢钠或碳酸钙。活病原体可以包括活病毒例如减毒轮状病毒。可替代地，活病毒可以是恒河猴轮状病毒血清型3、恒河猴-人VP7重配株(reassortant)轮状病毒血清型1、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型2，或恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型4。活病毒可以是恒河猴轮状病毒血清型3、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型1、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型2，和恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型4。活病毒可以是减毒脊髓灰质炎病毒。活病毒可以包含冻干的活病毒。在其中活病原体包括活病毒的实施方案中，疫苗制剂可以具有每mL疫苗制剂至少3.5x10sPFU或FFU的病毒滴度。疫苗制剂可以具有每mL疫苗制剂至少8xl05 PFU或FFU的病毒滴度。疫苗制剂可以缺乏水(或含有不超过5%、4%、3%、2%或1%水)。在一些情况下，疫苗制剂的活病毒可以是可以与食用油组合的冻干的活病毒。在一些情况下，疫苗制剂的缓冲剂组分可以是可以与食用油组合的缓冲剂组分的粉末形式。疫苗制剂可以缺乏溶解的活病毒。疫苗制剂可以缺乏溶解的缓冲剂组分。疫苗制剂可以缺乏溶解的活病毒和溶解的缓冲剂组分。疫苗制剂可以包含着色剂。疫苗制剂可以包含着色剂、调味料或甜味剂。疫苗制剂可以是含有悬浮体的液体形式且适合于经口施用。
[0008]在另一个方面，本文件的特征在于用于制备液体形式的疫苗制剂的方法。该方法包括下述或基本上由下述组成:在其中干燥的活病原体在食用油内形成悬浮体的条件下，组合干燥的活病原体病毒(例如干燥的活病毒、干燥的活微生物或干燥的活寄生虫)和液体形式的食用油，从而形成液体形式的疫苗制剂，并且其中(a)疫苗制剂具有每mL疫苗制剂至少最小病原体滴度的滴度，或(b)当在37°C下贮存30天时，疫苗制剂经历活病原体的活力减少不超过50%。干燥的活病原体可以包括干燥的活病毒例如干燥的减毒轮状病毒。可替代地，干燥的活病毒可以是恒河猴轮状病毒血清型3、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型1、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型2，或恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型
4。活病毒可以是恒河猴轮状病毒血清型3、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型1、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型2，和恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型4。干燥的活病毒可以是干燥的减毒脊髓灰质炎病毒。干燥的活病毒可以包含冻干的活病毒。在其中干燥的活病原体包括干燥的活病毒的实施方案中，疫苗制剂可以具有每mL疫苗制剂至少
3.5x10s PFU或FFU的病毒滴度。疫苗制剂可以具有每mL疫苗制剂至少8xl05 PFU或FFU的病毒滴度。食用油可以包含中链甘油三酯。中链甘油三酯的脂肪酸可以包括例如己酸、辛酸、癸酸和/或月桂酸。至少40%的食用油可以包含中链甘油三酯。至少50%的食用油可以包含中链甘油三 酯。至少60%的食用油可以包含中链甘油三酯。至少65%的食用油可以包含中链甘油三酯。食用油可以包含椰子油、玉米油、棉籽油、橄榄油、棕榈油、花生油、菜籽油、红花油、芝麻油、大豆油或向日葵油。食用油可以是橄榄油、大豆油或向日葵油。该方法可以包括在其中干燥缓冲剂组分在食用油内形成悬浮体的条件下，组合干燥缓冲剂组分与食用油。干燥缓冲剂组分可以包含碳酸钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、氢氧化铝、氢氧化镁或其混合物。缓冲剂组分可以是碳酸氢钠、碳酸钙或其混合物。在组合干燥缓冲剂组分与食用油之前，缓冲剂组分可以是粉末形式。疫苗制剂可以缺乏水(或含有不超过5%、4%、3%、2%或1%水)。该方法可以缺乏将水加入疫苗制剂中的步骤。疫苗制剂可以缺乏溶解的活病毒。疫苗制剂可以缺乏溶解的缓冲剂组分。疫苗制剂可以缺乏溶解的活病毒和溶解的缓冲剂组分。该方法可以包括组合着色剂与食用油。该方法可以包括组合调味料或甜味剂与食用油。该方法可以包括将含有悬浮体的液体形式的疫苗制剂插入适合于经口递送至哺乳动物的容器内。容器可以是口腔注射器。容器可以是口腔注射器样容器。哺乳动物可以是人。哺乳动物可以是小于三岁的人类儿童。
[0009]在另一个方面，本文件的特征在于用于给哺乳动物接种疫苗的方法。该方法包括下述或基本上由下述组成:给哺乳动物经口施用液体形式的疫苗制剂，其中疫苗制剂包含液体形式的食用油和以悬浮体形式存在于食用油内的活病原体(例如活病毒、活微生物或活寄生虫)，其中(a)疫苗制剂具有每mL疫苗制剂至少最小病原体滴度FFU的滴度，或(b)当在37°C下贮存30天时，疫苗制剂经历活病原体的活力减少不超过50%。食用油可以包含中链甘油三酯。中链甘油三酯的脂肪酸可以包括例如己酸、辛酸、癸酸和/或月桂酸。至少40%的食用油可以包含中链甘油三酯。至少50%的食用油可以包含中链甘油三酯。至少60%的食用油可以包含中链甘油三酯。至少65%的食用油可以包含中链甘油三酯。食用油可以包含椰子油、玉米油、棉籽油、橄榄油、棕榈油、花生油、菜籽油、红花油、芝麻油、大豆油、向日葵油或其混合物。食用油可以是橄榄油、大豆油、向日葵油或其混合物。疫苗制剂可以包含以悬浮体形式存在于食用油内的缓冲剂组分。缓冲剂组分可以包含碳酸钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、氢氧化铝、氢氧化镁或其混合物。缓冲剂组分可以是碳酸氢钠、碳酸钙或其混合物。在一些情况下，疫苗制剂的缓冲剂组分是与食用油组合的缓冲剂组分的粉末形式。活病原体可以包括活病毒例如减毒轮状病毒。可替代地，活病毒可以是恒河猴轮状病毒血清型3、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型1、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型2，或恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型4。活病毒可以是恒河猴轮状病毒血清型3、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型1、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型2，和恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型4。活病毒可以是减毒脊髓灰质炎病毒。活病毒可以包含冻干的活病毒。在其中活病原体包括活病毒的实施方案中，疫苗制剂可以具有每mL疫苗制剂至少3.5x10s PFU或FFU的病毒滴度。疫苗制剂可以具有每mL疫苗制剂至少8xl05 PFU或FFU的病毒滴度。疫苗制剂可以缺乏水(或含有不超过5%、4%、3%、2%或1%水)。在一些情况下，疫苗制剂的活病毒可以是可以与食用油组合的冻干的活病毒。疫苗制剂可以缺乏溶解的活病毒。疫苗制剂可以缺乏溶解的缓冲剂组分。疫苗制剂可以缺乏溶解的活病毒和溶解的缓冲剂组分。疫苗制剂可以包含着色剂。疫苗制剂可以包含调味料或甜味剂。哺乳动物可以是人。哺乳动物可以是小于三岁的人类儿童。疫苗制剂在施用于哺乳动物前可以在室温下贮存一段时间，其中所述时间段是至少15天。所述时间段可以是至少30天。疫苗制剂在施用于哺乳动物前可以在15°C -30°C的温度下贮存一段时间，其中所述时间段是至少五天。所述时间段可以是至少十天。所述时间段可以是至少30天。温度可以是18°C-25°C。所述时间段可以是至少十天。所述时间段可以是至少30天。
[0010]除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管下文描述了合适的方法和材料，但与本文所述那些相似或等价的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献整体通过引用并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和例子仅是举例说明性的并且不预期是限制性的。
[0011]本发明的其他特征和优点从下述详述和权利要求书来看将是显而易见的。
[0012]发明详 述
本文件提供了与液体疫苗制剂有关的方法和材料。例如，本文件提供了液体疫苗制剂以及用于制备和使用液体疫苗制剂的方法和材料。液体疫苗制剂可以配制成用于经口递送，并且可以包括冻干或干燥的疫苗组分(例如冻干的轮状病毒疫苗，例如冻干的RotaShield)和液体食用油组合物(例如含有一种或多种中链甘油三酯的液体食用油组合物)。
[0013]本文提供的液体疫苗制剂可以包含任何合适的疫苗组分。一般而言，疫苗组分设计为含有哺乳动物(例如人)待对于其进行免疫接种的病原体的一种或多种抗原。病原体可以是病毒、微生物或寄生虫。在一些情况下，疫苗组分可以是哺乳动物(例如人)待对于其进行免疫接种的活病毒、活微生物或活寄生虫。例如，本文提供的液体疫苗制剂可以包括活病毒制剂作为疫苗组分。活病毒制剂的例子包括但不限于活轮状病毒(例如恒河猴、恒河猴/人重配株、绵羊、牛、牛/人重配株或人轮状病毒)、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒(例如肠道病毒71)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、腺病毒、痘病毒、流感病毒、疱疫病毒或诺如病毒(norovirus)制剂。在一些情况下，本文提供的液体疫苗制剂可以包括活微生物制剂作为疫苗组分。活微生物制剂的例子包括但不限于活沙门氏菌属
菌株(例如伤寒沙门氏菌{Salmonella typhi ))、幽门螺杆菌{HeIicobacter pylori )、难辨梭菌(Clos tridium difficile )(例如难辨梭菌的毒素A+ B+菌株)、马红球菌{Rhodococcus egwi )、霍乱弧菌(KiArio cho I era)、欠 ^i^HEscherichia co7i)、志贺氏菌属)菌株、结核分枝杆菌(Mycobacterium (MercWiosis)(例如BCG疫苗组分)，或李斯特氏菌属(Zisteria )、乳杆菌属{Lactobacilli )微生物制剂。在一些情况下，本文提供的液体疫苗制剂可以包括活寄生虫制剂作为疫苗组分。活寄生虫制剂的例子包括但不限于活小隐抱子虫parvum)或旋盘尾丝虫(OncAocerca volvulus')(河盲症)寄生虫制剂。
[0014]在一些情况下，疫苗组分可以是减毒的活病毒、活微生物或活寄生虫。例如，活的减毒病毒制剂可以用作本文提供的液体疫苗制剂的疫苗组分。在一些情况下，疫苗组分可以是活病毒、活微生物或活寄生虫，其遗传改变为表达哺乳动物(例如人)待对于其进行免疫接种的病原体的一种或多种抗原(例如多肽例如用于经口免疫接种以帮助治疗阿尔茨海默氏病的淀粉状蛋白@-肽)。例如，腺病毒、痘病毒、流感病毒、疱疹病毒或脊髓灰质炎病毒可以遗传改变，以表达另一种病毒或致病性细菌物种(例如大肠杆菌)的一种或多种抗原。在此类情况下，遗传修饰的病毒的活制剂可以用作本文提供的液体疫苗制剂的疫苗组分。在一些情况下，遗传修饰的沙门氏菌属、大肠杆菌、李斯特氏菌属、志贺氏菌属或乳杆菌属微生物可以用作载体以将抗原经口递送到肠相关淋巴样组织(GALT)内。任何合适的分子生物学技术可以用于改造病毒、微生物或寄生虫，以表达一种或多种多肽(例如来自病原体的多肽)。例如，普通分子生物学技术例如分子克隆技术可以用于改造病毒、微生物或寄生虫，以表达来自病原体的一种或多种多肽。 [0015]在一些情况下，本文提供的液体疫苗制剂的活病毒制剂、活微生物制剂或活寄生虫制剂可以是冻干的或以另外的干燥形式使用。例如，冻干形式的活病毒制剂可以用作本文提供的液体疫苗制剂的疫苗组分。
[0016]任何合适的冻干或干燥技术可以用于制备干燥形式的活病毒制剂、活微生物制剂或活寄生虫制剂。例如，标准冷冻干燥技术可以用于制备活病毒、活微生物或活寄生虫的冻干制剂。在一些情况下，干燥技术例如美国专利号4，622，222,5, 024，836,5, 716，615和5，895，648中描述的那些可以用于制备干燥(例如冻干)形式的活病毒制剂、活微生物制剂或活寄生虫制剂。
[0017]在一些情况下，用作本文提供的液体疫苗制剂的疫苗组分的活病毒、活微生物或活寄生虫的冻干制剂可以含有不超过10%的水(例如不超过9%、不超过8%、不超过7%、不超过6%、不超过5%、不超过4%、不超过3%、不超过2%、或不超过1%的水)。
[0018]本文提供的液体疫苗制剂可以包括液体食用油组合物。在一些情况下，本文提供的液体疫苗制剂可以包括液体食用油组合物和活病毒、微生物或寄生虫的冻干疫苗组分，其至少部分作为悬浮体存在于食用油组合物中。在一些情况下，不超过5%(例如不超过4%、不超过3%、不超过2%，或不超过1%)的活病毒、微生物或寄生虫的冻干疫苗组分溶解于液体疫苗制剂的食用油组合物中。在一些情况下，至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)的活病毒、微生物或寄生虫的冻干疫苗组分以悬浮体形式存在于液体疫苗制剂的食用油组合物中。
[0019]任何合适的液体食用油都可以用作本文提供的液体疫苗制剂的液体食用油组合物，以维持所需％的冻干疫苗组分处于悬浮体形式。例如，食用油例如椰子油、玉米油、棉籽油、橄榄油、棕榈油、花生油、菜籽油、红花油、芝麻油、大豆油或向日葵油可以用作本文提供的液体疫苗制剂的液体食用油组合物。在一些情况下，含有一种或多种中链甘油三酯的食用油可以用作本文提供的液体疫苗制剂的液体食用油组合物。此类中链甘油三酯的脂肪酸可以是己酸、辛酸、癸酸或月桂酸。在一些情况下，至少40% (例如至少45%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%)的本文提供的液体疫苗制剂的食用油可以是中链甘油三酯。在一些情况下，本文提供的液体疫苗制剂的食用油可以是100%的中链甘油三酯。在一些情况下，精炼食用油可以用作本文提供的液体疫苗制剂的液体食用油组合物。
[0020]任何合适的方法都可以用于获得液体食用油组合物。例如，标准油提取和精炼技术可以用于从植物来源中提取油，所述植物来源例如椰子、玉米、棉籽、橄榄、花生、菜籽、大豆或向日葵。在一些情况下，油提取和精炼技术例如美国专利号4，243，603,4, 255，346、4,623,489,5,932, 261和7，531，678中描述的那些可以用于制备液体食用油。在一些情况下，液体食用油可以从供应商商购获得，所述供应商例如ADM (Decatur, IL)、BungeNorth America (St.Louis, MO)、Monsanto Company (St.Louis, MO)或 Stepan Company(Northfield, IL)。
[0021]本文提供的液体疫苗制剂可以设计为用于经口递送至哺乳动物(例如人)，并且可以包括液体食用油组合物和以悬浮体形式存在于液体食用油组合物中的冻干的活疫苗组分。维持至少90%冻干疫苗组分以悬浮体形式存在于本文提供的液体疫苗制剂的液体食用油组合物中的能力，可以允许冻干疫苗组分的活力在延长的时间段(例如至少1、2、3、4、5、6个月或更久)中保持很高，而不要求液体疫苗制剂贮存于低于8°C (例如低于7°C、6°C、5°C、4°C、3°C或2°C)的温度下。例如，当在37°C下贮存30天时，本文提供的液体疫苗制剂可以显示出活力减少不超过50% (例如不超过45%、不超过40%、不超过35%、不超过30%、不超过25%、不超过20%、不超 过15%、不超过10%、不超过5%或不超过1%)。在一些情况下，当在40°C或45°C下贮存30天时，本文提供的液体疫苗制剂可以显示出活力减少不超过50% (例如不超过45%、不超过40%、不超过35%、不超过30%、不超过25%、不超过20%、不超过15%、不超过10%、不超过5%或不超过1%)。在一些情况下，当在37°C、40°C或45°C下贮存至少45天、至少60天或至少六个月时，本文提供的液体疫苗制剂可以显示出活力减少不超过50% (例如不超过45%、不超过40%、不超过35%、不超过30%、不超过25%、不超过20%、不超过15%、不超过10%、不超过5%或不超过1%)。疫苗组分的活力可以使用标准滴度或对于待测试的具体组分合适的活力测定进行测定。例如，标准病毒滴度测定可以用于评估含有活病毒的液体疫苗制剂在37°C下贮存30天前和后的滴度。当液体疫苗制剂含有活细菌时，可以使用设计为评估细菌活力的标准测量技术。
[0022]在一些情况下，本文提供的液体疫苗制剂可以设计为包括液体食用油组合物，和以悬浮体形式存在于液体食用油组合物中的冻干疫苗组分(例如活病毒)。此类液体疫苗制剂可以具有对于疫苗接种目的合适的任何病毒滴度。例如，当在37°C下贮存30天后，此类液体疫苗制剂可以具有至少IxlO4 (例如至少2.5xl04、至少5xl04、至少lxlO5、至少5xl05、至少lxlO6、至少5xl06或至少IxlO7) PFU或FFU的病毒滴度。在一些情况下，当在40°C或45°C下贮存30天后，此类液体疫苗制剂可以具有至少lxl04(例如至少2.5xl04、至少5xl04、至少lxlO5、至少5xl05、至少lxlO6、至少5xl06或至少lxl07)PFU或FFU的病毒滴度。在一些情况下，当在37°C、40°C或45°C下贮存至少45天、至少60天或至少六个月后，此类液体疫苗制剂可以具有至少IxlO4 (例如至少2.5xl04、至少5xl04、至少lxlO5、至少5xl05、至少lxlO6、至少5xl06或至少IxlO7) PFU或FFU的病毒滴度。
[0023]在一些情况下，本文提供的液体疫苗制剂可以设计为包括液体食用油组合物，和以悬浮体形式存在于液体食用油组合物中的活微生物的冻干疫苗组分。此类液体疫苗制剂可以具有对于疫苗接种目的合适的任何浓度的活微生物。例如，当在37°C下贮存30天后，此类液体疫苗制剂可以具有至少IxlO4 (例如至少2.5xl04、至少5xl04、至少lxlO5、至少5xl05、至少lxlO6、至少5xl06或至少1x107)CFU的活微生物浓度。在一些情况下，当在40°C或45°C下贮存30天后，此类液体疫苗制剂可以具有至少I X IO4 (例如至少2.5xl04、至少5xl04、至少lxlO5、至少5xl05、至少lxlO6、至少5xl06或至少IxlO7) CFU的活微生物浓度。在一些情况下，当在37°C、40°C或45°C下贮存至少45天、至少60天或至少六个月后，此类液体疫苗制剂可以具有至少IxlO4 (例如至少2.5xl04、至少5xl04、至少lxlO5、至少5xl05、至少lxlO6、至少5xl06或至少IxlO7) CFU的活微生物浓度。
[0024]本文提供的液体疫苗制剂可以包括任何合适体积的液体食用油组合物和任何合适量的疫苗组分。例如，本文提供的液体疫苗制剂可以由约0.1 mL -约10 mL(例如约0.1mL -约 5 mL、约 0.1 mL -约 2.5 mL、约 0.5 mL -约 10 mL、约 I mL -约 10 mL、约 I mL-约5 mL、约I mL -约2.5 mL，或约I mL -约2 mL)的液体食用油组合物组成。在一些情况下，本文提供的液体疫苗制剂可以由约10 U g -约I g (例如约50 y g -约I g、约100 U g -约 I g、约 100 U g -约 750 mg、约 100 U g -约 500 mg、或约 500 U g -约250 mg)的疫苗组分(例如冻干疫苗组分)组成。本文提供的液体疫苗制剂内存在的疫苗组分的量可以是足以为液体疫苗制剂提供约5xl04 -约5xl09 (例如约IxlO5 -约lxlO8、约 2.5x10s -约 lxlO8、约 5x10s -约 lxlO8、约 IxlO6 -约 lxlO8，或约 5x10s -约 IxlO7) PFU或FFU (对于病毒)或CFU (对于微生物)的量。在一些情况下，本文提供的液体疫苗制剂内存在的疫苗组分的量可以是足以为液体疫苗制剂提供约IxlO3 -约IxlO8 (例如约IxlO5 -约 lxlO8、约 2.5x10s -约 I X 10'约 5x10s -约 lxlO8、约 IxlO6 -约 lxlO8，或约 5x10s -约IxlO7)活寄生虫/mL的量(对于设计为针对寄生虫免疫接种哺乳动物的经口疫苗制剂)。
[0025]本文提供的液体疫苗制剂可以包括缓冲剂组分，其至少部分作为悬浮体存在于液体疫苗制剂的食用油组合物中。在一些情况下，不超过5%(例如不超过4%、不超过3%、不超过2%或不超过1%)的缓冲剂组分溶解于液体疫苗制剂的食用油组合物中。在一些情况下，至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)的缓冲剂组分以悬浮体形式存在于液体疫苗制剂的食用油组合物中。具有维持疫苗组分和缓冲剂组分两者以悬浮体形式存在于本文提供的液体疫苗制剂的食用油组合物内的能力，可以允许两者存在于相同液体疫苗制剂内而不彼此相互作用。
[0026]任何合适的缓冲剂都可以用作本文提供的液体疫苗制剂的缓冲剂组分。例如，缓冲剂组分可以包括碳酸钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、氢氧化铝、氢氧化镁或其任何混合物。在一些情况下，缓冲剂组分可以是粉末状缓冲剂组分。本文提供的液体疫苗制剂的缓冲剂组分可以用于减少胃液对疫苗组分的作用，从而在液体疫苗制剂经口施用于哺乳动物时，增加疫苗组分的活力。
[0027]本文提供的液体疫苗制剂可以包括任何合适量的缓冲剂组分。例如，本文提供的液体疫苗制剂可以由约I mg -约5克(例如约I mg -约2.5克、约10 mg -约750 mg、约 20 mg -约 750 mg、约 50 mg -约 750 mg、约 100 mg -约 750 mg、约 10 mg -约 500
mg,或约10 mg -约250 mg)的缓冲剂组分(例如粉末形式的缓冲剂组分)组成。在一些情况下，本文提供的液体疫苗制剂可以由约60 mg缓冲剂组分(例如粉末形式的缓冲剂组分)组成。本文提供的液体疫苗制剂内存在的缓冲剂组分的量可以是足以减少胃液对疫苗组分的作用的量，从而使得有效量的活疫苗组分在经口施用后递送至哺乳动物。
[0028]本文提供的液体疫苗制剂可以包括其他成分例如填充剂、着色剂、调味料、甜味剂、增稠剂、稳定剂或其组合。一般而言，此类其他成分可以包括在液体疫苗制剂中，条件是它们基本上不减少疫苗组分的稳定性，并且它们基本上不增加疫苗组分、缓冲剂组分或两者在液体疫苗制剂的食用油内的溶解度。例如，可在本文提供的液体疫苗制剂内包括的其他成分包括但不限于缺乏水的那些成分。
[0029]将本文提供的液体疫苗制剂配置到含有单个剂量或多个剂量的递送装置内。例如，递送装置例如注射器、泡罩包装、塑料挤压管或瓶，或具有分开的递送装置的玻璃小瓶可以配置为容纳单个单位剂量的本文提供的液体疫苗制剂。本文提供的液体疫苗制剂的任何合适量可以是用于经口递送至哺乳动物的单位剂量。一般而言，约0.1 mL -约10 mL(例如约 0.1 mL -约 5 mL、约 0.1 mL -约 2.5 mL、约 0.5 mL -约 10 mL、约 I mL -约10 mL、约I mL -约5 mL、约I mL -约2.5 mL、或约I mL -约2 mL)可以是本文提供的液体疫苗制剂的单位剂量以用于经口递送至哺乳动物。
[0030]在一些情况下，本文提供的液体疫苗制剂可以包括多肽制剂作为疫苗组分。例如，此类疫苗组分可以是蓖麻蛋白多肽、AP肽或其他多肽。在此类情况下，当在37°C下贮存30天时，含有多肽制剂 作为疫苗组分的液体疫苗制剂可以显示出在哺乳动物中诱导免疫应答的能力减少不超过50% (例如不超过45%、不超过40%、不超过35%、不超过30%、不超过25%、不超过20%、不超过15%、不超过10%、不超过5%或不超过1%)。任何合适的测定都可以用于评估组合物在哺乳动物中诱导免疫应答的能力。
[0031]在前述描述中，为了明确起见，具体实施方案可以分开描述。除非另外明确说明具体实施方案的特征与另一个实施方案的特征不相容，否则特定实施方案可以包括与一个或多个实施方案相关的本文所述的相容特征的组合。
[0032]如本文使用的，术语“和/或”意指所列出元素中的一个或全部或者所列出元素中的任何两个或更多个的组合；当术语“包含”及其变化在说明书和权利要求书中出现时，这些术语不具有限制性含义；除非另有说明，否则“一个/种”、“该/所述”和“至少一个/种”可互换使用，并且意指一个/种或超过一个/种；并且通过端点叙述的数目范围包括在该范围内包含的所有数目(例如“I至5之间”包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
[0033]本发明将在下述实施例中进一步描述，所述实施例不限制权利要求书中所述的本发明的范围。
实施例
[0034]实施例1-四价轮状病毒疫苗在含有食用油的多种制剂中的稳定性
将由IDT Biologika生产的单位剂量(约4xl05 PFU)的轮状病毒疫苗(RotaShield)或冻干以形成干燥组合物，或冻干且磨碎以形成粉末。纯中链甘油三酯油(NEOBEE M-5)得自Stepan Company (Northfield, IL)。对于制剂 A,将一个经口剂量(约 4xl05 PFU)的冻干的轮状病毒疫苗与I HiL纯中链甘油三酯油组合。对于制剂B，将一个经口剂量(约4xl05 PFU)的冻干的轮状病毒疫苗与I mL纯中链甘油三酯油、60 mg粉末状CaCO3和5 y L Tween-80组合。对于制剂C，将一个经口剂量(约4xl05 PFU)的磨碎的轮状病毒疫苗粉末与I mL纯中链甘油三酯油组合。对于制剂D，将一个经口剂量(约4xl05 PFU)的磨碎的轮状病毒疫苗粉末与I mL纯中链甘油三酯油、60 mg粉末状CaCO3和5 y L Tween-80组合。
[0035]在最初以及在4°C或37°C下贮存30天，在4°C、25°C或37°C下贮存60天，或在4 V、25°C或37°C下贮存六个月后，对制剂A、B、C和D的病毒滴度进行测定。为了测定病毒滴度，将制剂与I mL纯水连同(对于制剂A和C)或不连同(对于制剂B和D) 0.1% Tween-20混合。将含有混合物的小瓶涡旋，并且将混合物转移至50 mL锥形管，并且在输出量5下超声处理两个超声循环10秒。每个疫苗制剂在超声处理后形成乳状液。将锥形管以4000 rpm离心5分钟。在离心后，可见三个层。底层是浓缩固体(最可能是CaCO3X中层是粉红色水性液体(最可能是疫苗病毒的部分)。上层是粉红色/白色泡沫状液体(最可能是油连同一些残留的其他成分)。在起始时间点和在4°C或37°C下贮存30天后(表1)，在4°C、25°C或37°C下贮存60天后(表2)，或在4°C、25°C或37°C下贮存六个月后(表2)，将水性层分离且用于测定每个疫苗制剂的FFU/mL。
[0036]表1.在4°C或37°C下贮存30天的制剂的滴度测定
【权利要求】
1.一种用于经口递送至哺乳动物的液体疫苗制剂，其中所述制剂包含液体形式的食用油和以悬浮体形式存在于所述食用油内的活病毒、微生物或寄生虫，其中当在37°C下贮存30天时，所述疫苗制剂经历所述活病毒、微生物或寄生虫的活力减少不超过50%。
2.权利要求1的疫苗制剂，其中所述制剂包含活病毒。
3.权利要求1的疫苗制剂，其中所述制剂包含活微生物。
4.权利要求1的疫苗制剂，其中所述制剂包含活寄生虫。
5.权利要求1的疫苗制剂，其中所述制剂包含干燥或冻干的活病毒、微生物或寄生虫。
6.权利要求1的疫苗制剂，其中所述制剂包含以悬浮体形式存在于所述食用油内的缓冲剂组分。
7.权利要求1的疫苗制剂，其中当在37°C下贮存30天时，所述疫苗制剂经历所述活病毒、微生物或寄生虫的活力减少不超过25%。
8.权利要求1的疫苗制剂，其中当在37°C下贮存30天时，所述疫苗制剂经历所述活病毒、微生物或寄生虫的活力减少不超过10%。
9.权利要求1的疫苗制剂，其中当在37°C下贮存30天时，所述疫苗制剂经历所述活病毒、微生物或寄生虫的活力减少不超过5%。
10.权利要求1的疫苗制剂，其中当在37°C下贮存30天时，所述疫苗制剂经历所述活病毒、微生物或寄生虫的活力减少不超过1%。
11.一种疫苗制剂，其包含液体形式的食用油、以悬浮体形式存在于所述食用油内的缓冲剂组分，和以悬浮体形式存在于所述食用油内的活病毒，其中(a)所述疫苗制剂具有每mL疫苗制剂至少IxlO5 PFU或FFU的病毒滴度，或(b)当在37°C下贮存30天时，所述疫苗制剂经历所述活病毒的活力减少不超过50%。
12.权利要求11的疫苗制剂，其中所述食用油包含中链甘油三酯。
13.权利要求12的疫苗制剂，其中所述中链甘油三酯的脂肪酸包含己酸、辛酸、癸酸或月桂酸。
14.权利要求11的疫苗制剂，其中超过40%的所述食用油包含中链甘油三酯。
15.权利要求11的疫苗制剂，其中超过50%的所述食用油包含中链甘油三酯。
16.权利要求11的疫苗制剂，其中超过60%的所述食用油包含中链甘油三酯。
17.权利要求11的疫苗制剂，其中超过65%的所述食用油包含中链甘油三酯。
18.权利要求11的疫苗制剂，其中所述食用油包含椰子油、玉米油、棉籽油、橄榄油、棕榈油、花生油、菜籽油、红花油、芝麻油、大豆油或向日葵油。
19.权利要求11的疫苗制剂，其中所述食用油是橄榄油、大豆油或向日葵油。
20.权利要求11的疫苗制剂，其中所述缓冲剂组分包含碳酸钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢韩、氢氧化招或氢氧化镁。
21.权利要求11的疫苗制剂，其中所述缓冲剂组分是碳酸氢钠或碳酸钙。
22.权利要求11的疫苗制剂，其中所述活病毒是减毒轮状病毒。
23.权利要求11的疫苗制剂，其中所述活病毒是恒河猴轮状病毒血清型3、恒河猴-人VP7重配株(代&^0代&社)轮状病毒血清型1、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型2，或恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型4。
24.权利要求11的疫苗制剂，其中所述活病毒是恒河猴轮状病毒血清型3、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型1、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型2，和恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型4。
25.权利要求11的疫苗制剂，其中所述活病毒是减毒脊髓灰质炎病毒。
26.权利要求11的疫苗制剂，其中所述活病毒包含冻干的活病毒。
27.权利要求11的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂具有每mL疫苗制剂至少3.5x10s PFU或FFU的病毒滴度。
28.权利要求11的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂具有每mL疫苗制剂至少8xl05PFU或FFU的病毒滴度。
29.权利要求11的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂缺乏水。
30.权利要求11的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂的所述活病毒是与所述食用油组合的冻干的活病毒。
31.权利要求11的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂的所述缓冲剂组分是与所述食用油组合的所述缓冲剂组分的粉末形式。
32.权利要求11的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂缺乏溶解的活病毒。
33.权利要求11的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂缺乏溶解的缓冲剂组分。
34.权利要求11的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂缺乏溶解的活病毒和溶解的缓冲剂组分。
35.权利要求11的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂包含着色剂。
36.权利要求11的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂包含着色剂、调味料或甜味剂。
37.权利要求11的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂是含有悬浮体的液体形式且适合于经口施用。
38.一种用于制备液体形式的疫苗制剂的方法，其中所述方法包括组合干燥的活病毒与液体形式的食用油，所述组合在其中所述干燥的活病毒在所述食用油内形成悬浮体的条件下进行，从而形成液体形式的所述疫苗制剂，并且其中(a)所述疫苗制剂具有每mL疫苗制剂至少I X IO5 PFU或FFU的病毒滴度，或(b)当在37°C下贮存30天时，所述疫苗制剂经历所述活病毒的活力减少不超过50%。
39.权利要求38的方法，其中所述干燥的活病毒是干燥的减毒轮状病毒。
40.权利要求38的方法，其中所述干燥的活病毒是恒河猴轮状病毒血清型3、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型1、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型2，或恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型4。
41.权利要求38的方法，其中所述活病毒是恒河猴轮状病毒血清型3、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型1、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型2，和恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型4。
42.权利要求38的方法，其中所述干燥的活病毒是干燥的减毒脊髓灰质炎病毒。
43.权利要求38的方法，其中所述干燥的活病毒包含冻干的活病毒。
44.权利要求38的方法，其中所述疫苗制剂具有每mL疫苗制剂至少3.5x10s PFU或FFU的病毒滴度。
45.权利要求38的方法，其中所述疫苗制剂具有每mL疫苗制剂至少8xl05PFU或FFU的病毒滴度。
46.权利要求38的方法，其中所述食用油包含中链甘油三酯。
47.权利要求46的方法，其中所述中链甘油三酯的脂肪酸包含己酸、辛酸、癸酸或月桂酸。
48.权利要求38的方法，其中超过40%的所述食用油包含中链甘油三酯。
49.权利要求38的方法，其中超过50%的所述食用油包含中链甘油三酯。
50.权利要求38的方法，其中超过60%的所述食用油包含中链甘油三酯。
51.权利要求38的方法，其中超过65%的所述食用油包含中链甘油三酯。
52.权利要求38的方法，其中所述食用油包含椰子油、玉米油、棉籽油、橄榄油、棕榈油、花生油、菜籽油、红花油、芝麻油、大豆油或向日葵油。
53.权利要求38的方法，其中所述食用油是橄榄油、大豆油或向日葵油。
54.权利要求38的方法，其中所述方法包括组合所述干燥缓冲剂组分与所述食用油，所述组合在其中所述干燥缓冲剂组分在所述食用油内形成悬浮体的条件下进行。
55.权利要求54的方法，其中所述干燥缓冲剂组分包含碳酸钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、氢氧化铝、氢氧化镁或其混合物。
56.权利要求54的方 法，其中所述缓冲剂组分是碳酸氢钠、碳酸钙或其混合物。
57.权利要求54的方法，其中在组合所述干燥缓冲剂组分与所述食用油之前，所述缓冲剂组分是粉末形式。
58.权利要求38的方法，其中所述疫苗制剂缺乏水。
59.权利要求38的方法，其中所述方法缺乏将水加入所述疫苗制剂中的步骤。
60.权利要求38的方法，其中所述疫苗制剂缺乏溶解的活病毒。
61.权利要求38的方法，其中所述疫苗制剂缺乏溶解的缓冲剂组分。
62.权利要求38的方法，其中所述疫苗制剂缺乏溶解的活病毒和溶解的缓冲剂组分。
63.权利要求38的方法，其中所述方法包括组合着色剂与所述食用油。
64.权利要求38的方法，其中所述方法包括组合调味料或甜味剂与所述食用油。
65.权利要求38的方法，其中所述方法包括将含有悬浮体的液体形式的所述疫苗制剂插入适合于经口递送至哺乳动物的容器内。
66.权利要求38的方法，其中所述容器是口腔注射器。
67.权利要求38的方法，其中所述容器是口腔注射器样容器。
68.权利要求38的方法，其中所述哺乳动物是人。
69.权利要求38的方法，其中所述哺乳动物是不超过三岁的人类儿童。
70.一种用于给哺乳动物接种疫苗的方法，其中所述方法包括给哺乳动物经口施用液体形式的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂包含液体形式的食用油和以悬浮体形式存在于所述食用油内的活病毒，其中(a)所述疫苗制剂具有每mL疫苗制剂至少IxlO5 PFU或FFU的病毒滴度，或(b)当在37°C下贮存30天时，所述疫苗制剂经历所述活病毒的活力减少不超过50%。
71.权利要求70的方法，其中所述食用油包含中链甘油三酯。
72.权利要求71的方法，其中所述中链甘油三酯的脂肪酸包含己酸、辛酸、癸酸或月桂酸。
73.权利要求70的方法，其中超过40%的所述食用油包含中链甘油三酯。
74.权利要求70的方法，其中超过50%的所述食用油包含中链甘油三酯。
75.权利要求70的方法，其中超过60%的所述食用油包含中链甘油三酯。
76.权利要求70的方法，其中超过65%的所述食用油包含中链甘油三酯。
77.权利要求70的方法，其中所述食用油包含椰子油、玉米油、棉籽油、橄榄油、棕榈油、花生油、菜籽油、红花油、芝麻油、大豆油、向日葵油或其混合物。
78.权利要求70的方法，其中所述食用油是橄榄油、大豆油、向日葵油或其混合物。
79.权利要求70的方法，其中所述疫苗制剂包含以悬浮体形式存在于所述食用油内的缓冲剂组分。
80.权利要求79的方法，其中所述缓冲剂组分包含碳酸钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、氢氧化铝、氢氧化镁或其混合物。
81.权利要求79的方法，其中所述缓冲剂组分是碳酸氢钠、碳酸钙或其混合物。
82.权利要求79的方法，其中所述疫苗制剂的所述缓冲剂组分是与所述食用油组合的所述缓冲剂组分的粉末形式。
83.权利要求70的方法，其中所述活病毒是减毒轮状病毒。
84.权利要求70的方法，其中所述活病毒是恒河猴轮状病毒血清型3、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型1、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型2，或恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型4。
85.权利要求70的方法，其中所述活病毒是恒河猴轮状病毒血清型3、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型1、恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型2，和恒河猴-人VP7重配株轮状病毒血清型4。
86.权利要求70的方法，其中所述活病毒是减毒脊髓灰质炎病毒。
87.权利要求70的方法，其中所述活病毒包含冻干的活病毒。
88.权利要求70的方法，其中所述疫苗制剂具有每mL疫苗制剂至少3.5x10s PFU或FFU的病毒滴度。
89.权利要求70的方法，其中所述疫苗制剂具有每mL疫苗制剂至少8xl05PFU或FFU的病毒滴度。
90.权利要求70的方法，其中所述疫苗制剂缺乏水。
91.权利要求70的方法，其中所述疫苗制剂的所述活病毒是与所述食用油组合的冻干的活病毒。
92.权利要求70的方法，其中所述疫苗制剂缺乏溶解的活病毒。
93.权利要求70的方法，其中所述疫苗制剂缺乏溶解的缓冲剂组分。
94.权利要求70的方法，其中所述疫苗制剂缺乏溶解的活病毒和溶解的缓冲剂组分。
95.权利要求70的方法，其中所述疫苗制剂包含着色剂。
96.权利要求70的方法，其中所述疫苗制剂包含调味料或甜味剂。
97.权利要求70的方法，其中所述哺乳动物是人。
98.权利要求70的方法，其中所述哺乳动物是不超过三岁的人类儿童。
99.权利要求70的方法，其中所 述疫苗制剂在施用于所述哺乳动物前在室温下贮存一段时间，其中所述时间段是至少15天。
100.权利要求99的方法，其中所述时间段是至少30天。
101.权利要求70的方法，其中所述疫苗制剂在施用于所述哺乳动物前在15°C-30°c的温度下贮存一段时间，其中所述时间段是至少五天。
102.权利要求101的方法，其中所述时间段是至少十天。
103.权利要求101的方法，其中所述时间段是至少30天。
104.权利要求101的方法，其中所述温度是18°C-25°C。
105.权利要求104的方法，其中所述时间段是至少十天。
106.权利要求10 4的方法，其中所述时间段是至少30天。
【文档编号】C12N1/04GK103747800SQ201280031847
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2012年4月27日 优先权日:2011年4月28日
【发明者】L.P.小鲁伊斯 申请人:国际医学基金会