专利名称：一种生脉液体制剂类过敏反应的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种生脉液体制剂类过敏反应的检测方法，具体是一种测定生脉液体制剂诱导的嗜碱性粒细胞脱颗粒的检测方法。
背景技术：
过敏反应包括急性过敏反应和非急性过敏反应,其中急性过敏反应分为I型变态反应和类过敏反应，而急性过敏反应中绝大多数为类过敏反应。生脉液体制剂在临床使用过程中出现的不良反应中，类过敏反应发生率最高。而当前常用检测类过敏反应的方法主要有动物实验法和ELISA法。其中动物实验方法检测周期过长、灵敏度低，ELISA法成本相对较高、实验过程繁琐且对样本要求高。鉴于以上情况，急需一种方便、灵敏度高、经济适用、适用于工业规模化生产生脉液体制剂安全性评价的快速检测方法，保证生脉液体制剂质量，降低临床应用过程中的类过敏反应的发生率。
发明内容
本发明的目的是提供一种方便、灵敏度高、经济适用、适用工业规模化生产生脉液体制剂安全性评价快速的检测方法。本发明的目的是通过采用以下技术方案来实现的具体地说，本发明采用嗜碱性粒细胞活化试验检测生脉液体制剂中类过敏反应的方法，操作步骤如下I、嗜碱性粒细胞的制备DPercoll 混悬液的配制取 Percoll 90ml，加入 HBSS 9ml,0. 25mol/l 的 HEPES lml, lmol/1 的 HCl 0. 4mI 调节至 pH7. 4 ；2)制备 Percoll 密度梯度管密度为 I. 088，Percoll/HBSS (ml/ml)为 23 : 10 混悬液取4ml置于密度梯度管底层，密度为I. 079，Percoll/HBSS (ml/ml)为27 15. 9混悬液取4ml置于密度梯度管第二层，密度为I. 070，Percoll/HBSS (ml/ml)为24 : 20混悬液取3ml置于密度梯度管最上层；3)用0. lmol/1 EDTA,pH 7. 7抗凝新鲜血,将新鲜的抗凝血按等体积加于Percoll 密度梯度分层液上，室温下1200rpm离心25min ；4)将每一细胞层分别吸出各放于I支试管内，加Hanks液在4度下洗涤3次，每次 1200rpm,离心IOmin弃去上清；5)分别得到的各层细胞涂片，固定后用Wright-Giemsa染液染色,在显微镜下检查嗜碱性粒细胞，调整细胞浓度，涂片染色计数；2、嗜碱性粒细胞检测生脉液体制剂中类过敏反应的测定I)生脉液体制剂稀释液与嗜碱性粒细胞共同孵育；2)于不同时间吸取嗜碱性粒细胞，4°C，IOOOrpm离心5min，细胞沉淀用PBS洗涤两次，再将细胞与PE标记的抗人CD203c抗体(BioLegend)室温下共同孵育15min，用流式细胞仪测定嗜碱性粒细胞荧光强度变化，显示CD203c表达量的多少，判断嗜碱性粒细胞活化情况。优选操作方法如下I、嗜碱性粒细胞的制备DPercoll 混悬液的配制取 Percoll 90ml，加入 HBSS 9ml,0. 25mol/l 的 HEPES lml, pH 7. 3, lmol/1 的 HCl 0. 4mI 调节至 pH7. 4 ；2)制备 Percoll 密度梯度管密度为 I. 088，Percoll/HBSS (ml/ml)为 23 : 10 混悬液取4ml置于密度梯度管底层，密度为I. 079，Percoll/HBSS (ml/ml)为27 15. 9混悬液取4ml置于密度梯度管第二层，密度为I. 070，Percoll/HBSS (ml/ml)为24 : 20混悬液取3ml置于密度梯度管最上层；3)用0. lmol/1 EDTA,pH 7. 7抗凝新鲜血,将新鲜的抗凝血按等体积加于Percoll 密度梯度分层液上，室温下1200rpm离心25min ；4)将每一细胞层分别吸出各放于I支试管内，加无Ca2+，Mg2+离子的Hanks液在 4度下洗漆3次,每次1200rpm,离心IOmin弃去上清；5)分别得到的各层细胞涂片，固定后用Wright-Giemsa染液染色,在显微镜下检查嗜碱性粒细胞，调整嗜碱性粒细胞浓度90-98%，涂片染色计数；2、嗜碱性粒细胞检测生脉液体制剂中类过敏反应的测定I)生脉液体制剂稀释液，稀释100-120倍与嗜碱性粒细胞共同孵育；2)于1、3、6、12、24小时吸取嗜碱性粒细胞，4°C，IOOOrpm离心5min，细胞沉淀用 PBS洗涤两次，再将细胞与PE标记的抗人CD203c抗体(BioLegend)室温下共同孵育15min， 用流式细胞仪测定嗜碱性粒细胞荧光强度变化，显示CD203c表达量的多少，判断嗜碱性粒细胞活化情况。本方案中使用的试验试剂细胞分离液Percoll为美国pharm ac ia公司的产品； 液体培养基HBSS为北京博润莱特科技有限公司的产品；生化试剂HEPES为上海默克化工技术有限公司的产品；Hanks液为Roche公司的产品；Wright-GiemSa染液为上海江莱生物技术有限公司的产品；PBS缓冲液为上海丽臣生物科技有限公司的产品^ioLegend流式抗体为上海起福生物科技有限公司的产品；分析试剂PE为厦门宝能科技有限公司的产品；盐酸等其他化学试剂为国产分析纯试剂。本发明所用的生脉液体制剂为2007年、2008年、2009年上市抽检产品中在临床应用过程中出现类过敏反应的产品。本发明的有益效果是相对于现有技术，本发明的方法灵敏度高、快速、便捷，适用于工业规模化生产生脉液体制剂安全性评价的检测方法，保证生脉液体制剂的质量，降低临床应用过程中的类过敏反应的发生率。以下通过实施例来进一步阐述本发明生脉液体制剂类过敏反应的检测方法。
具体实施例方式生脉注射液为符合中国药典标准且在临床应用过程中出现类过敏反应的产品。实施例I :
I、嗜碱性粒细胞的制备DPercoll 混悬液的配制取 Percoll 90ml，加入 HBSS 9ml,0. 25mol/l 的 HEPES lml, pH 7. 3, lmol/1 的 HCl 0. 4mI 调节至 pH7. 4 ；2)制备Percoll密度梯度管按照下表的比例配制不同密度的溶液
权利要求
1.一种生脉液体制剂类过敏反应的检测方法，包括如下操作步骤(1)嗜碱性粒细胞的制备DPercoll 混悬液的配制取 Percoll 90ml，加入 HBSS 9ml，O. 25mol/l 的 HEPES lml, lmol/1 的 HCl O. 4ml 调节至 ρΗ7· 4 ；2)制备Percoll密度梯度管密度为1.088，Percoll/HBSS为23 10混悬液取4ml置于密度梯度管底层，密度为1.079，PercOll/HBSS为27 15. 9混悬液取4ml置于密度梯度管第二层，密度为I. 070，Percol 1/HBSS为24 : 20混悬液取3ml置于密度梯度管最上层；3)用O.lmol/1 EDTA, pH 7. 7抗凝新鲜血,将新鲜的抗凝血按等体积加于Percoll密度梯度分层液上，室温下1200rpm离心25min ；4)将每一细胞层分别吸出各放于I支试管内，加Hanks液在4度下洗涤3次，每次 1200rpm,离心IOmin弃去上清；5)分别得到的各层细胞涂片，固定后用Wright-Giemsa染液染色，在显微镜下检查嗜碱性粒细胞，调整细胞浓度，涂片染色计数；(2)嗜碱性粒细胞检测生脉液体制剂中类过敏反应的测定1)生脉液体制剂稀释液与嗜碱性粒细胞共同孵育；2)于1、3、6、12、24小时吸取嗜碱性粒细胞，4°C，1000rpm离心5min，细胞沉淀用PBS洗涤两次，再将细胞与PE标记的抗人⑶203c抗体室温下共同孵育15min，用流式细胞仪测定嗜碱性粒细胞荧光强度变化，显示CD203c表达量的多少，判断嗜碱性粒细胞活化情况。
2.根据权利I要求所述的检测方法，其特征在于调整嗜碱性粒细胞浓度为90-98%。
3.根据权利I要求所述的检测方法，其特征在于所述生脉液体制剂稀释100-120倍。
4.根据权利要求1-3所述的检测方法，其特征在于CD203c表达阳性的细胞比例在加入该批次生脉液体制剂后增加的倍数，判断生脉液体制剂活化嗜碱性粒细胞的程度，当增加倍数在4倍以上时，即可判定生脉液体制剂在临床上可出现类过敏反应。
全文摘要
本发明公开了一种生脉液体制剂类过敏反应的检测方法，该方法通过生脉液体制剂诱导嗜碱性粒细胞活化量来检测生脉液体制剂成品的质量，是生脉液体制剂工业规模化生产安全性评价的快速检测方法，保证生脉液体制剂成品质量，降低临床应用过程中的类过敏反应的发生率。
文档编号G01N33/53GK102590492SQ20121004022
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月22日 优先权日2012年2月22日
发明者戴德玲, 易宏伟, 欧阳强 申请人:江苏苏中药业集团股份有限公司