用于检测中药口服液体制剂中乳杆菌的培养基和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药品微生物检测领域，具体涉及一种用于检测中药口服液体制剂中， 是否污染乳杆菌的检测方法，以及用于检测中药口服液体制剂中乳杆菌的培养基
【背景技术】
[0002] 中药口服液体制剂是以中药汤剂为基础，提取原药材中的有效成分，加入矫味剂、 抑菌剂等，再经静置、过滤、灭菌等工艺制成，具有剂量小、服用方便、起效迅速、味道易于接 受等优点，临床应用广泛。然而，中药口服液原料药多以天然动、植物成分为主，蛋白含量 高，且制剂多加入蔗糖、蜂蜜等用于调整口味，营养成分丰富；又其原材料中多携带有大量 微生物，其中不乏耐热杆菌、耐辐照细菌、孢子和芽孢等，对不良环境有较强抗逆性。因此， 产品在生产、贮藏和使用过程中容易受到微生物污染，导致药物变质，不但起不到治疗作 用，严重时，微生物产生的代谢毒素、药物成分改变所形成的致敏原等等，甚至会危及患者 生命健康。
[0003] 乳杆菌（Lactobacillaceae)为革兰阳性杆菌，兼性厌氧，耐酸，自然界中广泛存 在，也寄生于温血动物的口腔、肠道和阴道中。一般乳杆菌可耐受70°C的温度，也有报道证 实，某些植物乳杆菌在80°C的高温时仍可生长。作为益生菌群，乳杆菌在现代食品工业中应 用广泛，查阅文献，几乎未见关于其危害性的报道。但是，对于中药口服液体制剂，乳杆菌却 会造成严重的产品质量安全隐患，主要原因有以下几点：①中药口服液原料药中携带有大 量乳杆菌，野生株多对不良环境有较强的抗逆性。②为有效保留药物的活性成分，生产工艺 尽量避免高温提取或灭菌，为乳杆菌的存活创造了有利条件。③药物中的富含蔗糖、蜂蜜等 调味剂，是乳杆菌善于利用的碳源。④产品中虽然添加了山梨酸钾等抑菌剂，但该成分仅对 霉菌、酵母菌和好氧性细菌有抑制作用，对乳酸菌属几乎无效。⑤产品多进行严格密封，瓶 内剩余空间较少，生存环境接近于厌氧或微需氧状态，适于乳杆菌的生长繁殖。⑥患者购买 后，多置于常温贮存，逢夏秋季节，温度尤适于乳杆菌的生长繁殖。产品受乳杆菌污染后，即 便极低水平的污染，在适宜的条件下，乳杆菌会快速繁殖，短时间内使产品性状发生改变。 主要表现为胀气、沉淀、PH值下降和有效成分降低等现象，威胁患者健康。如果企业生产线 受到该菌污染，常会导致产品连续批次的大规模污染，给企业带来巨额的经济损失。近年 来，国内数起中药口服制剂的召回事件即是源于该菌的污染。
[0004] 目前，中国药品检测相关国家标准，如中国药典等，仅将金黄色葡萄球菌、大肠埃 希菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等致病性微生物作为控制菌，并列出了相关的 检测方法和结果判定标准。乳杆菌本身并不会直接对人体造成危害，因此，药品检测标准 未将其作为有害菌进行控制。随着我国药品GMP管理制度的实施和完善，现行国家标准中 规定检测的致病菌对药品质量安全的威胁几本消除，某些强抗逆性的非致病菌或条件致病 菌，例如本发明所述乳杆菌，已经上升为中药制剂质量安全的主要威胁因素。
[0005] 中国食品安全国家标准中，收载了含乳食品中乳酸菌的检测方法和含活性乳酸菌 的食品中乳酸菌的检测方法，将其作为益生菌进行检测。与中药口服液体制剂中，将乳杆菌 作为有害菌的检测目的不同，因此，培养基、检测方法和结果判定标准均不适用。
[0006] 查阅国内外相关文献，均未见关于中药口服液污染乳杆菌的检测方法。因此，建立 一套适用于中药口服液体制剂中，污染乳杆菌的检测方法和标准，开发专属性培养基，对确 保患者的用药安全、促进中医药产业的健康发展具有非常积极的意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供用于检测中药口服液体制剂中乳杆菌的培养基、以及中药 口服液体制剂中乳杆菌的检测方法，可以有效避免供试品中各类杂菌的干扰，检测限低于 5cfu/100mL〇
[0008] 本发明公开了一种用于检测中药口服液体制剂中乳杆菌的培养基，包括有
[0009] (1) -种为乳杆菌增菌培养基，为液体培养基，用于乳杆菌的前增菌培养；其成分 为：蛋白胨5. 0g、酵母浸出粉4. 0g、葡萄糖10. 0g、蔗糖、10. 0g、磷酸氢二钾I. 0g、硫酸镁 0· 3g、聚山梨酯805. 0g、山梨酸钾3g、水1000 mL ;
[0010] 采用以下方法制成：上述成分中除葡萄糖和蔗糖外，煮沸溶解，然后加入葡萄糖和 蔗糖溶解后，摇匀，调节pH值5. 5~6. 0,分装，115°C，30min灭菌；
[0011] (2)另一种为乳杆菌琼脂培养基，为固体琼脂培养基，用于增菌液的划线培养，其 成分为：蛋白胨10. 〇g、葡萄糖5. 0g、鹿糖5. 0g、氯化钠3. 0g、酵母浸出粉5. 0g、L-胱氨酸 I. 〇g、磷酸氢二钾I. 〇g、琼脂17g、山梨酸钾3g、水1000 mL ;
[0012] 采用以下方法制成：上述成分中除葡萄糖和蔗糖外，煮沸溶解，然后加入葡萄糖和 蔗糖溶解后，摇匀，调节pH值5. 5~6. 0,分装，115°C，30min灭菌，倾注平皿。
[0013] 本发明还公开了一种采用上述培养基用于中药口服液体制剂中乳杆菌的检测方 法，其特征在于，包括以下步骤：
[0014] (1)取供试品，接种至乳杆菌增菌培养基中，37°C ±1°C，厌氧，振荡培养18~24 小时，必要时可延长至48小时，振摇速度100~150r/min ;
[0015] (2)取上述培养物，划线接种至乳杆菌琼脂培养基中，37°C ±1°C，厌氧，培养24~ 48小时；
[0016] (3)如果平皿上出现菌落具有以下特征：灰白色，菌落中心颜色较深，圆形凸起， 光滑，边缘整齐，菌落直径1. 0~I. 5mm，且培养皿散发出乳酸味道，则应挑选2~3个菌 落，分别接种于乳杆菌琼脂培养基，37°C ± 1°C，厌氧，培养24~48小时，取培养物进行革兰 染色镜检和适宜的鉴定试验，根据结果判断是否检出乳杆菌；
[0017] (4)如果平板上无菌落生长或无典型菌落生长，判产品未检出乳杆菌。
[0018] 上述本发明的检测方法，优选的：所述步骤（1)中，乳杆菌增菌培养基的用量是接 种供试品体积的5-10倍。
[0019] 上述本发明的检测方法，优选的：所述供试品最少检验数量如下（表1)，
[0020]
[0021] 本发明的有益效果如下：
[0022] 本发明建立了中药口服液体制剂污染乳杆菌的检测方法，并开发了两种选择性菌 培养基，一种是乳杆菌增菌培养基，另一种是乳杆菌琼脂培养基。采用本发明进行中药口服 液体制剂乳杆菌的检测实验，可以有效避免供试品中各类需氧菌、革兰氏阴性菌、霉菌和酵 母菌等杂菌的干扰，检测限低于5cfu/100mL。采用本发明对中药口服液体制剂进行质量控 制，可以对批出厂产品进行检测，有效防止受污染产品上市销售；采用本发明对中药口服液 体制剂生产线关键区域进行连续监控，可以及时发现生产线存在的污染隐患，及时排除，防 止大规模污染事件的发生。本发明对于确保患者的用药安全、促进中医药产业的健康发展 具有非常积极的意义。
【具体实施方式】：
[0023] 以下是对本法明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0024] 实施例1 :
[0025] 采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) [CMCC (B) 63501]、金黄色葡萄球 菌（Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌（Escherichia coli) [CMCC (B) 44102]、生抱梭菌（Clostridium sporogenes) [CMCC (B) 64941]、白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F)98001]、和黑曲霉（Aspergillus niger)[CMCC(F)98003] 作为验证用菌株，分别代表环境中常见的芽孢杆菌、革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌、霉 菌和酵母菌等，用于验证本发明中所述两种乳杆菌培养基对杂菌的抑制能力；采用植物乳 杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum)[CICC20718]和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri) [CICC 20293]作为验证用菌株，验证中药口服液体制剂乳杆菌检测方法的有效 性，检查两种培养基的促生长能力和指示能力等。
[0026] 1、菌液制备接种枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的新鲜培养物至营 养肉汤培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35°C培养 18~24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23~28°C培养24~48 小时，上述培养物用0. 9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于IOOcfu的菌悬液。接种 黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23~28°C培养5~7天，加入3~5ml 含0. 05%聚山梨酯80的0. 9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后制成孢子数小于IOOcfu 的孢子悬液。
[0027] 2、培养基促生长能力检查取上述植物乳杆菌植物亚种和布氏乳杆菌菌悬液各 lml，分别接种于100mL乳杆菌增菌培养基中，37°C，厌氧，振荡培养24小时，振摇速度 100~150r/min ;取增菌培养液一环，划线接种于乳杆菌琼脂培养基，37°C，厌氧，培养48小 时。同时，以菌种传代说明书中规定的培养基作为对照培养基平行操作。
[0028] 3、培养基抑制能力检查取枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和生孢梭 菌菌悬液个lml，分别接种于100mL乳杆菌增菌培养基中，37°C，厌氧，振荡培养24小时，振 摇速度100~150r/min ;取增菌培养液一环，划线接种于乳杆菌琼脂培养基