一种乙酰辅酶a含量测定试剂盒及其方法
【专利摘要】本发明公开了一种乙酰辅酶A含量测定试剂盒及其方法，该试剂盒包括有：试剂一，由Tris-HCl、聚乙烯吡咯烷酮、巯基乙醇、苯甲基磺酰氟和甘油组成；试剂二，由苹果酸脱氢酶组成；试剂三，由柠檬酸合酶组成；试剂四，由苹果酸和氧化型辅酶I组成；试剂五，由Tris-HCl组成。苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和氧化型辅酶I生成草酰乙酸和还原型辅酶I，柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶A和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶A，利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应，乙酰辅酶A含量和原型辅酶I的生成速率成正比，340nm下吸光值的上升速率反应了乙酰辅酶A含量的高低。本发明操作简便，检测灵敏度高，回收率高，显著降低了试剂成本，本发明还简化了检测步骤，测定更加简便快捷。
【专利说明】一种乙酰辅酶A含量测定试剂盒及其方法
【技术领域】
[0002]本发明涉及试剂盒领域，具体涉及一种乙酰辅酶A含量测定试剂盒及其方法。
[0003]
【背景技术】
[0004]乙酰辅酶A广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是生物体能源物质代谢过程中产生的一种重要的中间代谢产物。乙酰辅酶A在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶A汇聚成一条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化，经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水，释放能量用于ATP的合成。此外，乙酰辅酶A是合成脂肪酸，酮体，胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。原始的乙酰辅酶A含量检测方法灵敏度较低，通常会因样本中乙酰辅酶A含量低、干扰多以致难以检测。目前市面上还没有一种操作简单、快速灵敏的试剂盒，能够让检测者能够方便地测定乙酰辅酶A的含量。
[0005]
【发明内容】
[0006]为了满足上述需求，本发明旨在提供了一种乙酰辅酶A含量测定试剂盒及其方法，具有操作简单、快速、特异、灵敏等特点，为检测者提供了质量优异的试剂盒及优化的操作程序，经过简单的培训，检测者就可胜任该项工作。
[0007]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
一种乙酰辅酶A含量测定试剂盒，包括以下试剂:
试剂一，呈液体，4 °C保存，由聚乙烯吡咯烷酮(PVP )、巯基乙醇、苯甲基磺酰氟(PMSF )和甘油溶于浓度为50mM，PH=7.5的Tris-HCl缓冲溶液后组成，置于试剂瓶中；
试剂二，呈粉剂，_20°C保存，由苹果酸脱氢酶(MDH)组成，置于1.5mLEP管中；
试剂三，呈液体，4°C保存，由柠檬酸合酶组成，置于1.5mLEP管中；
试剂四，呈粉剂，_20°C保存，由苹果酸和氧化型辅酶I (NAD)组成，置于试剂瓶中； 试剂五，呈液体，4°C保存，由浓度为50mM，PH=7.5的Tris-HCl缓冲溶液组成。
[0008]优选的，所述试剂一中，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的质量为2.5g，巯基乙醇的体积为37uL，苯甲基磺酰氟(PMSF)的浓度为10mM,体积为500uL，甘油的体积为5mL，Tris-HCl缓冲溶液的浓度为50mM，PH=7.5，体积为10mL ；
所述试剂二中，苹果酸脱氢酶(MDH)的质量为0.3mg ；
所述试剂三中，柠檬酸合酶的体积为1uL ；
所述试剂四中，苹果酸的质量为30mg和氧化型辅酶I (MD)的质量为7.5mg ；
所述试剂五中，Tris-HCl缓冲溶液的浓度为50mM，PH=7.5，体积为30mL。
[0009]一种采用上述试剂盒的乙酰辅酶A含量测定方法，包括以下步骤:
步骤1.仪器和用品的准备； 紫外分光光度计或酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿或96孔板、研钵、冰和蒸馏水；
步骤2.样本的提取；
1)从细菌或培养细胞中提取:收集细菌或培养细胞到离心管内，弃上清，按照每400万细菌或培养细胞加入ImL的所述试剂一，采用功率为20%的超声波，对所述细菌或培养细胞超声3s，间隔10s，重复30次，破碎所述细菌或培养细胞，然后采用13000g离心率，4°C离心lOmin，取上清，置冰上待测；
2)从组织中提取:称取约0.1g组织，加入ImL的所述试剂一，进行冰浴匀浆，然后采用离心率13000g，4°C离心lOmin，取上清，置冰上待测；
步骤3.试剂临用前的准备；
1)所述试剂二中加入250uL所述试剂二，充分溶解备用；
2)所述试剂三中加入250uL所述试剂二，充分溶解备用；
3)所述试剂四中加入22.5mL所述试剂二，充分溶解备用；
步骤4.工作液的配制；
计算拟用的工作液体积，工作液体积=样本数X 0.23mL，根据所述拟用的工作液体积，将上述步骤3中充分溶解好的所述试剂二、所述试剂三和所述试剂四按照1:1:90的比例混合，或直接将上述步骤3中充分溶解好的所述试剂二和所述试剂三加入到所述试剂四中混匀；加样前，将配置好的所述工作液置于水浴锅中预热10 min。
[0010]步骤5.乙酰辅酶A含量测定；
O分光光度计或酶标仪预热30min，用蒸馏水于340nm处调零；
2)取230uL的所述工作液和25uL样本至微量石英比色皿或96孔板，混匀；
3)立即记录340nm处20s的吸光值Al和80s时的吸光值A2；
4)计算吸光值ΛΑ= A2 - Al ;
5)若使用微量石英比色皿进行测定，采用回归方程为y= 1640x + 0.012，计算乙酰辅酶A含量；若使用96孔板进行测定，采用回归方程为y = 3280x + 0.024，计算乙酰辅酶A
含量;
其中，X表示吸光值ΔΑ, y表示标准品浓度，单位为nmol/mL。
[0011]优选的，在步骤4中，所述工作液预热的具体方法如下:
1)若所述样本从哺乳动物上提取的，则加样前，将配置好的所述工作液置于37°C水浴锅中预热10 min ；
2)若所述样本从非哺乳动物上提取的，则加样前，将配置好的所述工作液置于25°C水浴锅中预热10 min。
[0012]优选的，在步骤5中，若使用微量石英比色皿进行测定，并按照蛋白浓度计算法，则测定乙酰辅酶A含量的计算公式如下:
乙酸辅酶 A 含量(nmol/mg prot) = (1640 X Δ A + 0.012) +Cpr ；
其中，Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL，需要另外测定。
[0013]优选的，在步骤5中，若使用微量石英比色皿进行测定，并按照样品质量计算法，则测定乙酰辅酶A含量的计算公式如下:
乙酸辅酶 A 含量(nmol/mg prot) = (1640X ΔΑ + 0.012)+ (W+V 样总)= (1640X ΔΑ + 0.012) +W ；
其中，W表示样品质量，单位为g; V样总表示加入提取液体积，体积为lmL。
[0014]优选的，在步骤5中，若使用微量石英比色皿进行测定，并按照细菌或细胞密度计算法，则测定乙酰辅酶A含量的计算公式如下:
乙酰辅酶 A 含量(nmol/104) =(1640X ΔΑ + 0.012) + (400 + V 样总)=4.1X ΔΑ ； 其中，400表示细菌或培养细胞总数，总数为400万。
[0015]优选的，在步骤5中，若使用96孔板进行测定，并按照按照蛋白浓度计算法，则测定乙酰辅酶A含量的计算公式如下:
乙酸辅酶 A 含量(nmol/mg prot) = (3280 X ΔΑ + 0.024) +Cpr ；
其中，Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL，需要另外测定。
[0016]优选的，在步骤5中，若使用96孔板进行测定，并按照样品质量计算法，则测定乙酰辅酶A含量的计算公式如下:
乙酸辅酶 A 含量(nmol/mg prot) = (3280X ΔΑ + 0.024)+ (W+V 样总)= (3280X ΔΑ + 0.024) +W ；
其中，W表示样品质量，单位为g; V样总表示加入提取液体积，体积为lmL。
[0017]优选的，在步骤5中，若使用96孔板进行测定，并按照细菌或细胞密度计算法，则测定乙酰辅酶A含量的计算公式如下:
乙酰辅酶 A 含量(nmol/104) = (3280 X ΔΑ + 0.024) (400 + V 样总)=8.2 X Λ A ;
其中，400表示细菌或培养细胞总数，总数为400万。
[0018]本发明的测定的原理如下:
苹果酸脱氢酶(MDH)可催化苹果酸和氧化型辅酶I (NAD)生成草酰乙酸和还原型辅酶I (NADH)。柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶A和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应，乙酰辅酶A含量和还原型辅酶I(NADH)的生成速率成正比，340nm下吸光值的上升速率反应了乙酰辅酶A含量的高低。
[0019]本发明的有益效果是:
1、本发明的检测方法利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应，乙酰辅酶A含量和NADH的生成速率成正比，通过检测NADH的生成速率间接反应乙酰辅酶A含量的高低，检测灵敏度和原始方法相比提高了 10倍左右，最低检测限为1.6nmol/mL，解决了因样本中乙酰辅酶A含量低、干扰多以致难以检测的问题。
[0020]2、本发明的试剂盒操作简便，采用分光光度计和酶标仪均可检测，缩短了反应时间。
[0021]3、本发明试剂盒的回收率高达98%_102%，且测定体系为0.255mL，显著降低了试剂成本。
[0022]4、本发明简化了检测步骤，通过临用前工作液的简易配制和加液体积的规范，测定更加简便快捷，检测效率大大提高。
[0023]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明。
[0024]
【具体实施方式】
[0025]下面将结合实施例，来详细说明本发明。
[0026]实施例1
一种乙酰辅酶A含量测定试剂盒，包括以下试剂:
试剂一，呈液体，4°C保存，由质量为2.5g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，体积为37uL的巯基乙醇，浓度为10mM,体积为500uL的苯甲基磺酰氟(PMSF)和体积为5mL的甘油溶于浓度为50mM, PH=7.5，体积为10mL的Tris-HCl缓冲溶液后组成，置于试剂瓶中；
试剂二，呈粉剂，_20°C保存，由质量为0.3mg的苹果酸脱氢酶(MDH)组成，置于1.5mLEP
管中；
试剂三，呈液体，4°C保存，由体积为1uL的柠檬酸合酶组成，置于1.5mLEP管中；试剂四，呈粉剂，_20°C保存，由质量为30mg的苹果酸和质量为7.5mg的氧化型辅酶I(NAD)组成，置于30mL试剂瓶中；
试剂五，呈液体，4°C保存，由浓度为50mM，PH=7.5，体积为30mL的Tris-HCl缓冲溶液组成。
[0027]—种采用上述试剂盒的乙酰辅酶A含量测定方法，包括以下步骤:
步骤1.仪器和用品的准备；
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水；
步骤2.样本的提取；
1)从细菌或培养细胞中提取:收集细菌或培养细胞到离心管内，弃上清，按照每400万细菌或培养细胞加入ImL的所述试剂一，采用功率为20%的超声波，对所述细菌或培养细胞超声3s，间隔10s，重复30次，破碎所述细菌或培养细胞，然后采用13000g离心率，4°C离心lOmin，取上清，置冰上待测；
2)从组织中提取:称取约0.1g组织，加入ImL的所述试剂一，进行冰浴匀浆，然后采用离心率13000g，4°C离心lOmin，取上清，置冰上待测；
步骤3.试剂临用前的准备；
1)所述试剂二中加入250uL所述试剂二，充分溶解备用；
2)所述试剂三中加入250uL所述试剂二，充分溶解备用；
3)所述试剂四中加入22.5mL所述试剂二，充分溶解备用；
步骤4.工作液的配制；
计算拟用的工作液体积，工作液体积=样本数X 0.23mL，根据所述拟用的工作液体积，将上述步骤3中充分溶解好的所述试剂二、所述试剂三和所述试剂四按照1:1:90的比例混合，或直接将上述步骤3中充分溶解好的所述试剂二和所述试剂三加入到所述试剂四中混匀；加样前，将配置好的所述工作液置于水浴锅中预热10 min。
[0028]步骤5.乙酰辅酶A含量测定；
O分光光度计预热30min，用蒸馏水于340nm处调零；
2)取230uL的所述工作液和25uL样本至微量石英比色皿，混匀；
3)立即记录340nm处20s的吸光值Al和80s时的吸光值A2；
4)计算吸光值ΛΑ= A2 - Al ; 5)采用回归方程为y = 1640x + 0.012，计算乙酰辅酶A含量；
其中，X表示吸光值ΔΑ, y表示标准品浓度，单位为nmol/mL。
[0029]优选的，在步骤4中，所述工作液预热的具体方法如下:
1)若所述样本从哺乳动物上提取的，则加样前，将配置好的所述工作液置于37°C水浴锅中预热10 min ；
2)若所述样本从非哺乳动物上提取的，则加样前，将配置好的所述工作液置于25°C水浴锅中预热10 min。
[0030]优选的，在步骤5中，若按照蛋白浓度计算法，则测定乙酰辅酶A含量的计算公式如下:
乙酸辅酶 A 含量(nmol/mg prot) = (1640 X ΔΑ + 0.012) +Cpr ；
其中，Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL，需要另外测定。
[0031]优选的，在步骤5中，若按照样品质量计算法，则测定乙酰辅酶A含量的计算公式如下:
乙酸辅酶 A 含量(nmol/mg prot) = (1640X ΔΑ + 0.012)+ (W+V 样总)= (1640X ΔΑ + 0.012) +W ；
其中，W表示样品质量，单位为g; V样总表示加入提取液体积，体积为lmL。
[0032]优选的，在步骤5中，若按照细菌或细胞密度计算法，则测定乙酰辅酶A含量的计算公式如下:
乙酰辅酶 A 含量(nmol/104) =(1640 X ΔΑ + 0.012) + (400 + V 样总)=4.1X ΔΑ ；
其中，400表示细菌或培养细胞总数，总数为400万。
[0033]实施例2
一种乙酰辅酶A含量测定试剂盒，包括以下试剂:
试剂一，呈液体，4°C保存，由质量为2.5g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，体积为37uL的巯基乙醇，浓度为10mM,体积为500uL的苯甲基磺酰氟(PMSF)和体积为5mL的甘油溶于浓度为50mM, PH=7.5，体积为10mL的Tris-HCl缓冲溶液后组成，置于试剂瓶中；
试剂二，呈粉剂，_20°C保存，由质量为0.3mg的苹果酸脱氢酶(MDH)组成，置于1.5mLEP
管中；
试剂三，呈液体，4°C保存，由体积为1uL的柠檬酸合酶组成，置于1.5mLEP管中；试剂四，呈粉剂，_20°C保存，由质量为30mg的苹果酸和质量为7.5mg的氧化型辅酶I(NAD)组成，置于30mL试剂瓶中；
试剂五，呈液体，4°C保存，由浓度为50mM，PH=7.5，体积为30mL的Tris-HCl缓冲溶液组成。
[0034]一种采用上述试剂盒的乙酰辅酶A含量测定方法，包括以下步骤:
步骤1.仪器和用品的准备；
酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水；
步骤2.样本的提取；
I)从细菌或培养细胞中提取:收集细菌或培养细胞到离心管内，弃上清，按照每400万细菌或培养细胞加入ImL的所述试剂一，采用功率为20%的超声波，对所述细菌或培养细胞超声3s，间隔10s，重复30次，破碎所述细菌或培养细胞，然后采用13000g离心率，4°C离心lOmin，取上清，置冰上待测；
2)从组织中提取:称取约0.1g组织，加入ImL的所述试剂一，进行冰浴匀浆，然后采用离心率13000g，4°C离心lOmin，取上清，置冰上待测；
步骤3.试剂临用前的准备；
1)所述试剂二中加入250uL所述试剂二，充分溶解备用；
2)所述试剂三中加入250uL所述试剂二，充分溶解备用；
3)所述试剂四中加入22.5mL所述试剂二，充分溶解备用；
步骤4.工作液的配制；
计算拟用的工作液体积，工作液体积=样本数X 0.23mL，根据所述拟用的工作液体积，将上述步骤3中充分溶解好的所述试剂二、所述试剂三和所述试剂四按照1:1:90的比例混合，或直接将上述步骤3中充分溶解好的所述试剂二和所述试剂三加入到所述试剂四中混匀；加样前，将配置好的所述工作液置于水浴锅中预热10 min。
[0035]步骤5.乙酰辅酶A含量测定；
1)酶标仪预热30min,用蒸懼水于340nm处调零；
2)取230uL的所述工作液和25uL样本至96孔板，混匀；
3)立即记录340nm处20s的吸光值Al和80s时的吸光值A2；
4)计算吸光值ΛΑ= A2 - Al ;
5)采用回归方程为y= 3280x + 0.024，计算乙酰辅酶A含量；
其中，X表示吸光值ΔΑ, y表示标准品浓度，单位为nmol/mL。
[0036]优选的，在步骤4中，所述工作液预热的具体方法如下:
1)若所述样本从哺乳动物上提取的，则加样前，将配置好的所述工作液置于37°C水浴锅中预热10 min ；
2)若所述样本从非哺乳动物上提取的，则加样前，将配置好的所述工作液置于25°C水浴锅中预热10 min。
[0037]优选的，在步骤5中，若按照按照蛋白浓度计算法，则测定乙酰辅酶A含量的计算公式如下:
乙酸辅酶 A 含量(nmol/mg prot) = (3280 X ΔΑ + 0.024) +Cpr ；
其中，Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL，需要另外测定。
[0038]优选的，在步骤5中，若按照样品质量计算法，则测定乙酰辅酶A含量的计算公式如下:
乙酸辅酶 A 含量(nmol/mg prot) = (3280X ΔΑ + 0.024)+ (W+V 样总)= (3280X ΔΑ + 0.024) +W ；
其中，W表示样品质量，单位为g; V样总表示加入提取液体积，体积为lmL。
[0039]优选的，在步骤5中，若按照细菌或细胞密度计算法，则测定乙酰辅酶A含量的计算公式如下:
乙酰辅酶 A 含量(nmol/104) = (3280 X ΔΑ + 0.024) (400 + V 样总)=8.2 X Λ A ;
其中，400表示细菌或培养细胞总数，总数为400万。
[0040]上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本
【发明内容】
的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种乙酰辅酶A含量测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂: 试剂一，呈液体，4°C保存，由聚乙烯吡咯烷酮、巯基乙醇、苯甲基磺酰氟和甘油溶于浓度为50mM，PH=7.5的Tris-HCl缓冲溶液后组成，置于试剂瓶中； 试剂二，呈粉剂，_20°C保存，由苹果酸脱氢酶组成，置于1.5mLEP管中； 试剂三，呈液体，4°C保存，由柠檬酸合酶组成，置于1.5mLEP管中； 试剂四，呈粉剂，_20°C保存，由苹果酸和氧化型辅酶I组成，置于试剂瓶中； 试剂五，呈液体，4°C保存，由浓度为50mM，PH=7.5的Tris-HCl缓冲溶液组成。
2.根据权利要求1所述的乙酰辅酶A含量测定试剂盒，其特征在于: 所述试剂一中，聚乙烯吡咯烷酮的质量为2.5g，巯基乙醇的体积为37uL，苯甲基磺酰氟的浓度为10mM,体积为500uL，甘油的体积为5mL，Tris-HCl缓冲溶液的浓度为50mM，ΡΗ=7.5，体积为 10mL ； 所述试剂二中，苹果酸脱氢酶的质量为0.3mg ； 所述试剂三中，柠檬酸合酶的体积为1uL ； 所述试剂四中，苹果酸的质量为30mg和氧化型辅酶I的质量为7.5mg ； 所述试剂五中，Tris-HCl缓冲溶液的浓度为50mM，PH=7.5，体积为30mL。
3.一种采用如权利要求2所述的试剂盒的乙酰辅酶A含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1.仪器和用品的准备； 紫外分光光度计或酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿或96孔板、研钵、冰和蒸馏水； 步骤2.样本的提取； 1)从细菌或培养细胞中提取:收集细菌或培养细胞到离心管内，弃上清，按照每400万细菌或培养细胞加入ImL的所述试剂一，采用功率为20%的超声波，对所述细菌或培养细胞超声3s，间隔10s，重复30次，破碎所述细菌或培养细胞，然后采用13000g离心率，4°C离心lOmin，取上清，置冰上待测； 2)从组织中提取:称取约0.1g组织，加入ImL的所述试剂一，进行冰浴匀浆，然后采用离心率13000g，4°C离心lOmin，取上清，置冰上待测； 步骤3.试剂临用前的准备； 1)所述试剂二中加入250uL所述试剂二，充分溶解备用； 2)所述试剂三中加入250uL所述试剂二，充分溶解备用； 3)所述试剂四中加入22.5mL所述试剂二，充分溶解备用； 步骤4.工作液的配制； 计算拟用的工作液体积，工作液体积=样本数X 0.23mL，根据所述拟用的工作液体积，将上述步骤3中充分溶解好的所述试剂二、所述试剂三和所述试剂四按照1:1:90的比例混合，或直接将上述步骤3中充分溶解好的所述试剂二和所述试剂三加入到所述试剂四中混匀；加样前，将配置好的所述工作液置于水浴锅中预热10 min ； 步骤5.乙酰辅酶A含量测定； O分光光度计或酶标仪预热30min，用蒸馏水于340nm处调零； 2)取230uL的所述工作液和25uL样本至微量石英比色皿或96孔板，混匀； 3)立即记录340nm处20s的吸光值Al和80s时的吸光值A2； 4)计算吸光值ΛΑ= A2 - Al ; 5)若使用微量石英比色皿进行测定，采用回归方程为y= 1640x + 0.012，计算乙酰辅酶A含量；若使用96孔板进行测定，采用回归方程为y = 3280x + 0.024，计算乙酰辅酶A含量; 其中，X表示吸光值ΔΑ, y表示标准品浓度，单位为nmol/mL。
4.根据权利要求3所述的乙酰辅酶A含量测定方法，其特征在于，在步骤4中，所述工作液预热的具体方法如下: 1)若所述样本从哺乳动物上提取的，则加样前，将配置好的所述工作液置于37°C水浴锅中预热10 min ； 2)若所述样本从非哺乳动物上提取的，则加样前，将配置好的所述工作液置于25°C水浴锅中预热10 min。
5.根据权利要求3所述的乙酰辅酶A含量测定方法，其特征在于，在步骤5中，若使用微量石英比色皿进行测定，并按照蛋白浓度计算法，则测定乙酰辅酶A含量的计算公式如下: 乙酸辅酶 A 含量(nmol/mg prot) = (1640 X ΔΑ + 0.012) +Cpr ； 其中，Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL，需要另外测定。
6.根据权利要求3所述的乙酰辅酶A含量测定方法，其特征在于，在步骤5中，若使用微量石英比色皿进行测定，并按照样品质量计算法，则测定乙酰辅酶A含量的计算公式如下:
乙酸辅酶 A 含量(nmol/mg prot) = (1640X ΔΑ + 0.012) + (W+V 样总)= (1640X ΔΑ + 0.012) +W ； 其中，W表示样品质量，单位为g; V样总表示加入提取液体积，体积为lmL。
7.根据权利要求3所述的乙酰辅酶A含量测定方法，其特征在于，在步骤5中，若使用微量石英比色皿进行测定，并按照细菌或细胞密度计算法，则测定乙酰辅酶A含量的计算公式如下:
乙酰辅酶 A 含量(nmol/104) =(1640 X ΔΑ + 0.012) + (400 + V 样总)=4.1X ΔΑ ； 其中，400表示细菌或培养细胞总数，总数为400万。
8.根据权利要求3所述的乙酰辅酶A含量测定方法，其特征在于，在步骤5中，若使用96孔板进行测定，并按照按照蛋白浓度计算法，则测定乙酰辅酶A含量的计算公式如下: 乙酸辅酶 A 含量(nmol/mg prot) = (3280X Δ A + 0.024) +Cpr ； 其中，Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL，需要另外测定。
9.根据权利要求3所述的乙酰辅酶A含量测定方法，其特征在于，在步骤5中，若使用96孔板进行测定，并按照样品质量计算法，则测定乙酰辅酶A含量的计算公式如下: 乙酸辅酶 A 含量(nmol/mg prot) = (3280X ΔΑ + 0.024)+ (W+V 样总)= (3280X ΔΑ + 0.024) +W ； 其中，W表示样品质量，单位为g; V样总表示加入提取液体积，体积为lmL。
10.根据权利要求3所述的乙酰辅酶A含量测定方法，其特征在于，在步骤5中，若使用96孔板进行测定，并按照细菌或细胞密度计算法，则测定乙酰辅酶A含量的计算公式如下:乙酰辅酶 A 含量(nmol/104) = (3280 X Λ A + 0.024) + (400 + V 样总)=8.4X Λ A ;其中，400表示细菌或培养细胞总数，总数为400万。
【文档编号】C12Q1/527GK104293884SQ201410501212
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月26日 优先权日:2014年9月26日
【发明者】姚金美, 赵林川 申请人:苏州科铭生物技术有限公司