一种用于极微量样品中atp含量测定的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于ATP含量检测技术领域，特别涉及一种用于极微量样品中ATP含量测定 的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 在生物体内能量的转换和传递过程中，5'-三磷酸腺苷（Adenosine 5'-triphosphate，ATP)是一种关键物质。线粒体是ATP合成的重要场所，其产生的ATP是细胞生 命活动主要能量来源。ATP与线粒体的功能状态紧密相关，且作为关键的能量分子在细胞的 各种生理、病理过程中起着重要作用。ATP水平的改变，会影响诸多的细胞功能。通常细胞在 凋亡、坏死或处于一些毒性状态下，ATP含量会下降；而高葡萄糖刺激等因素则有可能上调 某些类型细胞内的ATP含量。因此，准确测定细胞或组织中的ATP水平对于评估细胞或机体 状态不可或缺。
[0003] 下面将结合申请人的研究领域，以卵母细胞和早期胚胎质量评估为例，简要介绍 ATP含量检测的重要意义。近10年来我国育龄人群的不孕不育率逐年攀升，并且呈年轻化趋 势。其中除部分由于器质性病变引起的不孕外，大多数女性不孕不育都与卵母细胞质量低 下密切相关。卵母细胞中所储存的大量母源因子(包括代谢产物)在支持胚胎发育过程中起 着关键作用。因此评估卵母细胞/早期胚胎质量对于防治不孕不育、自发流产和出生缺陷等 重大生殖疾病，进一步提高人类辅助生殖成功率和保障女性生殖健康具有重大意义。
[0004] 其中ATP是卵母细胞和早期胚胎主要的能量来源，并且参与调控了卵母细胞的减 数分裂过程。在整个减数分裂活动中，精确的纺锤体组装和染色体运动是产生健康卵母细 胞的重要环节。若ATP供应不足，可能导致卵母细胞成熟过程中出现纺锤体组装缺陷，染色 体运动和分离障碍，最终形成非整倍性的卵子。而非整倍性卵子的受精则是诱发妊娠失败 和后代发育异常的最主要因素。特别是，最近越来越多的研究表明母源肥胖会导致卵母细 胞中线粒体功能障碍，ATP含量显著下降。因此，测定卵母细胞和早期胚胎中的ATP含量对于 预防生殖疾病和降低出生缺陷风险非常重要。
[0005] 尽管已有的方法和商业化试剂盒可以检测组织和大量细胞内的ATP含量，但是对 于像卵母细胞和早期胚胎这种珍贵且极微量的样品目前还没有合适可行的方法。因此，开 发一种能在单细胞水平检测ATP的方法及试剂盒不仅对于基础生物学研究至关重要，而且 对于相关的临床检测技术的改进也很有意义。
【发明内容】
[0006] 解决的技术问题:本发明提供一种用于极微量样品中ATP含量测定的试剂盒及其 应用
[0007] 技术方案：一种用于测定极微量样品中ATP的试剂盒，包括溶液I、溶液II、溶液 III、试剂I、试剂II和试剂III，所述溶液I内含:20mM TrisHCl pH8.1和0.01 wt. %牛血清白 蛋白混合液；溶液II内含：0 . 〇〇425mol/L氢氧化钠溶液；溶液III内含：0.20mol/L盐酸和 0.10M TrisHCl ρΗ6·6的混合液;试剂I内含:60mM TrisHCl pH8.1、0.04wt·%牛血清白蛋 白、2mM氯化镁、ImM二硫苏糖醇、300μΜ D-葡萄糖、100μΜ烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、4yg/ mL己糖激酶、2yg/mL无色葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；试剂II内含：lOOmM Imidapril HC1 pH7.0、0.02wt. %牛血清白蛋白、7.5mMa-酮戊二酸单钠盐、7.5mM氢氧化钠、25mM醋酸铵、 0.1 mM二磷酸腺苷、5mM葡萄糖-6-磷酸、20yg/mL谷氨酸脱氢酶、2yg/mL无色葡萄糖-6-磷酸 脱氢酶；试剂ΠΙ内含：50mM Imidapril HC1 pH7.0、lmM pH7.0乙二胺四乙酸、5mM氯化镁、 30mM醋酸铵、100mM NADP、0.025U/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶。
[0008] 所述试剂盒在测定极微量样品ATP中的应用。
[0009] 具体检测步骤为：1)取样品用溶液I反复清洗三次，转移至PCR管中，加入3yL溶液 II，80°C加热20分钟，再加入2yL溶液III并混匀得碱性提取液；
[0010] 2)取碱性提取液5yL，加入等体积试剂I，在24°C下反应20分钟，再加入2yL 0.02mol/L氢氧化钠溶液，90°C下反应20分钟，得ATP反应产物;基本反应原理如下：
[0011]
[0012] 3)取ATP反应产物5yL，加入50yL试剂II，首先在37°C下反应60分钟，然后98°C加热 5分钟，取出并离心6s得循环反应产物;基本反应原理如下：
[0013]
[0014] 4)取循环反应产物20yL，加入180yL试剂III，在24°C下作用10分钟完成反应;基本 反应原理如下：
[0015]
[0016] 5)最后测定NADPH吸光值，读取并计算最终结果。
[0017] 上述样品为细胞，数量为1~20个。
[0018]其中，步骤4可以在96孔板中进行。
[0019]有益效果:本发明是根据极微量样品代谢产物ATP的检测方法设计了一种试剂盒， 通过应用一系列酶促循环反应(整个体系大概循环2000次），适宜在样品极微量情况下，主 要用于单个或少数细胞中代谢产物ATP的定量。操作简单，省时省力，避免了现配现用耗时 长的缺点，与传统试剂盒方法相比较，所测结果更为精确，并提供了一种极为方便、有效的 ATP检测试剂盒，以使该技术应用于更大的基础生物学研究领域，并且，对于临床辅助生殖 技术的改进也具有非常重要的意义。
【附图说明】
[0020]图1为采用市售试剂盒检测不同数量卵母细胞所作ATP标准曲线图。
[0021] X-轴是指不同含量的ATP标准品(pmol)，Y-轴是指对应的ATP荧光强度。
[0022]图2为不同数量卵母细胞样品组检测得到的平均每个卵母细胞ΑΤΡ含量（单位为 pmol)统计图。
[0023] X-轴是指不同数量卵母细胞样品组，分别设计了 1、10个和20个卵母细胞三个样品 组，Y-轴是指平均每个卵母细胞ATP含量(pmol)。
[0024]图3为采用本发明微量方法检测不同数量卵母细胞所作ATP标准曲线图。
[0025] X-轴是指不同含量的ATP标准品(pmol)，Y-轴是指对应的ATP吸光值。
[0026] 图4为不同数量卵母细胞样品组检测得到的平均每个卵母细胞ΑΤΡ含量(pmol)统 计图。
[0027] X-轴是指不同数量的卵母细胞样品组，分别设计了 1个卵母细胞、5个卵母细胞、10 个卵母细胞三个样品组，Y-轴是指平均每个卵母细胞ATP含量(pmol)。
【具体实施方式】
[0028] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明 的范围。
[0029]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所使用的试剂和材料均为市售产品。
[0030] 实施例1
[0031] 以测定小鼠卵母细胞中的ATP含量进行相关实验。
[0032] 1.样品准备
[0033] 选择ICR 3周龄小鼠卵母细胞作为样本进行实验，采用颈椎脱臼法处死小鼠后，无 菌35mm培养皿收集GV期卵母细胞，待用。
[0034] 2.ATP含量测定
[0035] 1)应用目前市售的试剂盒检测不同数量卵母细胞中的ATP含量
[0036]该试剂盒包含ATP检测混合粉末，含有荧光素酶、荧光素、硫酸镁、二硫苏糖醇、乙 二胺四乙酸、牛血清白蛋白、三(羟甲基）甲基缓冲盐，加50mL超纯水至溶解待用;ATP分析混 合粉末，含有硫酸镁、二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白、三(羟甲基）甲基缓冲盐， 加入5mL超纯水，涡旋直至溶解，调整pH7.8得ATP分析混合液待用;ATP标准液，1: 25的体积 比例稀释待用;细胞裂解液(10X)，超纯水10倍稀释待用。
[0037]本试剂盒检测法是基于荧光素酶在催化荧光素发光时必须有ATP、镁离子等辅助 因子存在时才能发光的生物现象。因此，当卵母细胞中ATP被特殊细胞裂解试剂释放出来 后，ATP检测试剂中的若干组分如荧光素、荧光素酶等与被测样本反应产生光子，再利用酶 标仪捕捉、收集光子，检测荧光强度。反应原理如下：
[0038]