利用光声-荧光互补原理的深层钙离子浓度监测方法与装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明属于无损测试测量技术领域，特别涉及一种利用光声-荧光互补原理的深层钙离子浓度监测方法与装置。
【背景技术】
[0002]目前主要是通过观察钙离子荧光探针的荧光信号来监测钙离子浓度的变化。然而由于生物组织对荧光散射的影响，荧光成像方法不能监测深层钙离子浓度的变化。而光声信号(光致超声)受组织散射的影响远小于光子所受的影响，因此我们将无损光声成像技术与纯光学成像高灵敏度特性和纯超声成像中深穿透特性结合在一起，克服了光散射限制，实现了对活体深层组织的高分辨、高对比度成像。钙离子是机体各项生理活动不可缺少的离子。它对于维持细胞膜两侧的生物电位，维持正常的神经传导功能，维持正常的肌肉伸缩与舒张功能以及神经、肌肉传导功能，起着非常重要的作用。钙离子，作为信号转导通路中的第一信使，对于整个中枢神经系统的突触神经元和神经胶质至关重要。
【发明内容】
[0003]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种利用光声-荧光互补原理的深层钙离子浓度监测方法。
[0004]本发明的另一目的在于提供利用光声-荧光互补原理的深层钙离子浓度监测装置。
[0005]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0006]—种利用光声-荧光互补原理的深层钙离子浓度监测方法，包括如下步骤:
[0007](I)利用钙离子荧光探针作为光声钙离子探针；
[0008]由于钙离子荧光探针的荧光强度会随着钙离子的浓度的增加而增强或者减弱。在同一激发过程中产生的光声、荧光信号此消彼长，存在着互补关系。因此，钙离子荧光探针的光声信号会随着钙离子的浓度增加而减少或者增强。因此，可以通过探测钙离子荧光探针的光声信号强弱的变化，检测钙离子浓度大小的变化。又因为光声波(光声信号)受组织散射的影响远比荧光小，因此利用光声-荧光互补原理，通过检测钙离子荧光探针的光声信号可以监测深层组织钙离子的变化。
[0009](2)将钙离子荧光探针注射到拟检测的区域；
[0010](3)光声荧光信号激发源发出的脉冲激光经过显微物镜后，聚焦在检测区域，使得钙离子荧光探针产生光声信号和荧光信号；
[0011](4)光声信号穿过超声耦合液后被碗状中空聚焦超声探测器接收，然后经过信号放大器放大；荧光信号经过分光镜和滤光片滤光后被光电倍增管接收;两路信号被双通道并行采集卡同时采集，再将数据传输并储存到带有采集控制软件和图像重建软件的计算机中；
[0012](5)检测样品与盛放超声耦合液的超声耦合杯一起放置于三维扫描平台上，由装有电机控制软件的计算机控制样品的三维移动;每采集完一个点的光声信号，三维扫描平台水平方向有序移动一步；当扫描完一个平面后，平台再纵向移动一步；以对样品进行逐点扫描，用于重建三维图像;最终获得三维光声信号强度分布，以获取钙离子浓度分布；
[0013](6)钙离子荧光探针的光声信号被采集后，通过最大值投影算法重建出钙离子探针光声信号强度分布图像，根据光声信号强度判断钙离子的浓度变化；
[0014](7)通过探测单点的钙离子荧光探针的光声信号强度，实时监测该点钙离子浓度的变化。
[0015]步骤(I)中所述的钙离子荧光探针优选为Rhod-2，但不限定上述探针。
[0016]所述步骤(2)中所选择的钙离子荧光探针在和钙离子结合前后吸收光谱无明显变化。
[0017]步骤(3)中所述的光声荧光信号激发源为脉冲激光器，输出激光波长根据钙离子荧光探针的激发波长来选择。
[0018]步骤(3)中所述的脉冲激光器为输出激光脉冲宽度是纳秒或者皮秒的激光器，输出波长为532nm、675?lOOOnm，重复频率20Hz?1KHz0
[0019]步骤(4)中所述的电机控制软件为Labview软件，程序自行编写。
[0020]步骤(5)中所述的超声耦合液为水；
[0021]步骤(5)中所述的碗状中空聚焦超声探测器的主频为1MHz，中空聚焦探头。
[0022]步骤(5)中所述的采集控制软件和图像重建软件均为Labview软件，程序自行编与;
[0023]步骤(6)中所述的最大值投影算法是通过Matlab软件自行编写。
[0024]步骤(7)中所述的探测单点，利用高重复频率(1KHz)的脉冲激光器和高采样率的采集卡200M/s。
[0025]利用光声-荧光互补原理的深层钙离子浓度监测装置，是根据上述方法构建的。所述的检测装置包括光声荧光信号激发源、碗状中空聚焦超声探测器、光电倍增管、反射镜、分光镜、扩束透镜组、显微物镜、超声耦合杯、样品台、三维扫描平台、滤光片、信号放大器、双通道并行采集卡、带有采集控制软件和图像重建软件以及电机控制软件的计算机。
[0026]所述的光声焚光信号激发源为输出激光脉冲宽度是纳秒或者皮秒的脉冲激光器，激光输出后经过反射镜将光传输至显微物镜上，显微物镜将光聚焦在样品上。
[0027]所述的碗状中空聚焦超声探测器的碗状中空超声探头固定在显微物镜下方，使显微物镜与超声探头同轴，光能从探头中间的小孔穿过探头聚焦于超声探头的焦点处，实现光、声共焦。激发产生的光声信号被超声探头接收。
[0028]所述显微物镜固定于碗状中空聚焦超声探测器内部，并保证显微物镜与碗状中空聚焦超声探测器共焦点；所述盛放超声耦合液的超声耦合杯位于样品正上方，碗状中空聚焦超声探测器和光电倍增管置于超声耦合杯的正上方，其中光电倍增管在碗状中空聚焦超声探测器的上方；
[0029]所述光声荧光激发光源、信号放大器、光电倍增管、三维扫描平台、双通道并行采集卡与带有采集控制软件和图像重建软件以及电机控制软件的计算机依次电气相连；
[0030]所述的信号放大器的放大倍数为70dB，带宽为50KHz?500MHz;
[0031]所述的信号放大器优选为多级级联放大器；
[0032]所述的显微物镜为平场物镜，放大倍数为4倍、10倍、20倍、40倍、100倍，成像质量只与放大倍数有关，倍数越高则质量越好。
[0033]所述的双通道并行采集卡的型号可以为PCI2400(NI公司生产)，但其他型号，例如研华采集卡也可以用。
[0034]所述的三维扫描平台由二维电动平台和升降台构成;所述的二维电动平台由步进电机和移动平台构成，通过电机旋转带动移动平台前后移动，二维电动平台由两个这种电动平台组成，可以实现前后左右四个方向移动；在竖直方向主要由升降台控制以达到不同平面的效果。
[0035]所述的采集控制软件和图像重建软件均为Labview软件，程序自行编写；
[0036]所述的电机控制软件为Labview软件，程序自行编写;成像软件可用Matlab软件编自行编写。
[0037]本发明的原理是:基于光声-荧光互补原理即钙离子荧光探针受激辐射的过程只有两个途径:辐射跃迀和非辐射跃迀。荧光成像和光声成像正是对这两个途径中产生的能量转化形式(荧光与光声)的检测而实现的。荧光成像探测的是辐射跃迀的能量(荧光)，而光声成像探测的是非辐射跃迀的能量(光声信号)。对于一般的钙离子荧光探针而言，受激后的辐射跃迀和非辐射跃迀过程都是同时发生并存在着相互竞争机制，两者的实际发生几率则由钙离子的浓度决定。通常钙离子浓度是有荧光信号强度来表征的。由于光声、荧光存在此消彼长的互补关系，光声信号同样也可以反映钙离子的浓度变化。而且光声信号在组织中的传输深度要比荧光深得多达到lcm。因此，利用光声-荧光互补原理可以实现对深层钙离子浓度的监测。这方法将用于神经科学的研究。
[0038]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果:
[0039]本发明的方法与装置可以实现深层组织的钙离子浓度监测；操作简单，监测钙离子荧光探针的灵敏度可以达到0.15μΜ，能够监测深层组织钙离子浓度变化。本发明可以实时检测深层组织钙离子浓度的变化情况，由此可以通过该变化的快慢而推断出组织病变程度。
【附图说明】
[0040]图1是利用光声-荧光互补原理的深层钙离子浓度监测装置的结构示意图；其中，I为带有采集控制软件和图像重建软件以及电机控制软件的计算机;2为三维扫描平台；3为光声荧光信号激发源;4为反射镜;5为放置样品的样品台；6为超声耦合杯;7为碗状中空聚焦超声探测器;8为显微物镜;9为分光镜；10为滤光片；11为光电倍增管；12为信号放大器；13为扩束透镜组。
[0041]图2是钙离子浓度和钙离子探针的光声、荧光信号强度的关系图。
【具体实施方式】
[0042]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0043]实施例1
[0044]利用光声-荧光互补原理的深层钙离子浓度监测装置的结构示意图如图1所示。
[0045]该监测装置包括:1为带有采集控制软件和图像重建软件以及电机控制软件的计算机;2为三维扫描平台；3为光声荧光信号激发源;4为反射镜;5为放置样品